一种利用工业色谱技术制备丹酚酸类化合物的方法与流程

本发明涉及一种分离纯化技术，特别涉及一种利用工业色谱技术制备丹酚酸类化合物的方法。

背景技术：

丹参为唇形科鼠尾草属植物丹参salviamiltiorrhizabunge的干燥根及根茎，目前临床上其制剂广泛应用于缺血性心脑血管疾病的治疗。丹酚酸a是从丹参中提取的一种水溶性成分，近十多年的研究表明丹酚酸a对缺血心肌、游离脂肪酸导致的内皮细胞损伤、脑缺血再灌注损伤保护等方面有显著活性。

丹酚酸a在大鼠体内外表现出抗血小板聚集作用，丹酚酸a能够剂量依赖性的抑制二磷酸腺苷(adp)、花生四稀酸(aa)和凝血酶(thr)诱导的血小板聚集。丹酚酸a不仅对血小板聚集具有全面温和的抑制作用，而且对血栓引起的脑缺血具有显著的保护作用(王海港,孔令雷,王睿等.丹酚酸a与阿司匹林抗血栓作用的比较研究[j].药学学报,2019,54(2):301-307.)。丹酚酸a对心肌缺血再灌注损伤大鼠心率变异性(hrv)和心肌损伤的影响，发现丹酚酸a可增加hrv，减少心肌梗死面积，发挥心肌保护作用(赵国胜,杨会杰,左保华等.川穹嗪和丹参对大鼠心脏氧反常保护作用的比较[j].天津医药,1996,24(5):289-292.)。丹酚酸a可显著降低实验性高脂血症大鼠血中总胆固醇、低密度脂蛋白水平，并对游离脂肪酸导致的内皮细胞损伤具有明显的保护作用(杨秀颖,强桂芬,宫丽丽等.丹酚酸a调节高脂血症大鼠血脂水平并保护游离脂肪酸导致的内皮细胞损伤[j].中国新药杂志,2013,22(24):2869-2873.)。丹酚酸a尾静脉注射可以显著降低可溶性环氧化物水解酶(seh)在mcao大鼠海马ca1区的表达，同时降低seh活性从而上调mcao大鼠血液和脑组织中环氧十二碳三稀酸(ett)的水平，减少mcao大鼠脑梗死体积，提示丹酚酸a通过抑制seh对缺血性损伤发挥保护作用(wangsb,pangxb,zhaoy,etal.protectionofsalvianolicacidaonratbrainfromischemicdamageviasolubleepoxidehydrolaseinhibition[j].journalofasiannaturalproductsresearch,2012,14(11):1084-1092.)。丹酚酸a对缺血心肌、游离脂肪酸导致的内皮细胞损伤、脑缺血再灌注损伤有显著保护作用。

研究表明，saa在体内主要经肝脏的儿茶酚氧位甲基转移酶(catechol-o-methyl-transferase，comt)和尿苷二磷酸葡醛酸转移酶(uridine-diphosphateglucuronosyltransferases，ugts)代谢，生成包括葡醛酸和甲基结合在内的多种ⅱ相结合代谢产物，成为其发挥体内药效作用的直接物质基础。许卉等利用具有高儿茶酚氧位甲基转移酶(comt)活力的大鼠肝细胞液体外温孵代谢反应，首次制备了4种丹酚酸a(saa)的甲基结合代谢物，其中就包括3-甲氧基丹酚酸a(许卉，李艳丽，田翠红等.丹酚酸a甲基结合代谢物的制备与结构鉴定[j].分析学研究报告，2014,42(1)：65-70.)。因此制备丹酚酸a的大鼠体内代谢产物3-甲氧基丹酚酸a用于心脑血管疾病治疗相关活性筛选和药物研发具有重要的意义。目前报道的只有许卉等利用具有高儿茶酚氧位甲基转移酶(comt)活力的大鼠肝细胞液体外温孵代谢反应的方法制备得到少量纯度大于95％的3-甲氧基丹酚酸a用于结构鉴定，该方法不适合工业化生产。

技术实现要素：

为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种利用工业色谱技术制备丹酚酸类化合物3-甲氧基丹酚酸a的制备方法，该方法可大量制备得到纯度大于98％的3-甲氧基丹酚酸a，适合工业化生产，可以满足用于药理研究以及药物制剂生产的需求。

本发明提供一种利用工业色谱技术制备丹酚酸类化合物3-甲氧基丹酚酸a的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

(1)提取：取丹参药材，粉碎，加入药材重量的6～12倍的水，加热提取，提取液浓缩，醇沉，过滤；

(2)转化：步骤(1)所述的滤液浓缩至溶液中乙醇浓度≤5％，调ph至3.0～4.5，100～120℃反应3.0～4.5h，冷却，得转化液；

(3)纯化：步骤(2)所述的转化液经过大孔吸附树脂柱层析和工业色谱纯化。

优选的，步骤(1)中，

水为纯化水或饮用水；

和/或，提取温度为70～85℃；

和/或，提取时间为不小于1h；

和/或，提取次数不少于3次；

和/或，提取液浓缩温度为60～65℃；

和/或，提取液浓缩至相对密度1.05～1.15，优选为1.07～1.08；

和/或，所述醇沉使用溶剂为乙醇；调至乙醇浓度65％-75％(v/v)，常温静置24小时以上；其中优选为调至乙醇浓度70％-72％(v/v)。

更优选的，步骤(1)为：取丹参药材，粉碎，加入药材重量的6-12倍的纯化水或饮用水，提取温度为70～85℃，提取数次(如3次)，每次不小于1h。

优选的，步骤(2)为，将步骤(1)滤液在60～65℃浓缩至无醇味，用盐酸调ph至3.0～4.5，100～120℃反应3.0～4.5h。

优选的，步骤(3)中，大孔吸附树脂柱层析步骤为：转化液浓缩至相对密度1.02-1.05，采用乙醇-水混合溶剂体系进行大孔吸附树脂柱层析，合并洗脱液，浓缩，得3-甲氧基丹酚酸a粗品。

更优选的，大孔吸附树脂为苯乙烯型大孔吸附树脂；和/或，乙醇-水混合溶剂体系为30％～60％(v/v)乙醇水溶液。

优选的，步骤(3)中，工业色谱柱纯化步骤为：将3-甲氧基丹酚酸a粗品用20％～30％(v/v)甲醇水溶液溶解，上样于工业色谱柱，用甲醇-水混合溶剂体系或甲醇-水-甲酸混合溶剂体系进行洗脱，合并洗脱液，浓缩。

更优选的，工业色谱的填料为ods-aqc18、xaquac18等反向c18填料；和/或，工业色谱柱为动态轴向压缩工业色谱柱系统；和/或，甲醇-水-甲酸混合溶剂体系为体积比为(20～60)：(40～80)：(0.01～0.1)的甲醇-水-甲酸混合溶液。

优选的，步骤(3)为

a.大孔吸附树脂柱层析：转化液浓缩至相对密度1.02-1.05，进行大孔吸附树脂柱层析用30％-60％(v/v)乙醇-水溶液洗脱，合并洗脱液，浓缩，得3-甲氧基丹酚酸a粗品；

b.工业色谱柱纯化：将3-甲氧基丹酚酸a粗品用20％～30％(v/v)甲醇-水溶液溶解，上样于工业色谱柱，用体积比为(20～60)：(40～80)：(0.01～0.1)的甲醇-水-甲酸混合溶液进行洗脱，合并洗脱液，浓缩。

更优选的，步骤(3)为：

a.大孔吸附树脂柱层析：转化液浓缩至相对密度1.02-1.03，进行大孔吸附树脂柱层析用35％-55％(v/v)乙醇:水溶液洗脱，合并洗脱液，浓缩，得3-甲氧基丹酚酸a粗品；

b.工业色谱柱纯化：将3-甲氧基丹酚酸a粗品用适量20％～30％(v/v)甲醇水溶液溶解，将粗品上样工业色谱柱，用体积比为(20～60)：(40～80)：(0.01～0.1)的甲醇-水-甲酸溶液进行洗脱，合并洗脱液，浓缩干，再用适量20％～30％(v/v)甲醇水溶液溶解，继续上样工业色谱柱，用体积比为(20～60)：(40～80)：(0.01～0.1)的甲醇-水-甲酸溶液进行洗脱，合并洗脱液，浓缩，得高纯度3-甲氧基丹酚酸a。

本发明的有益技术效果：

1.本发明所示的3-甲氧基丹酚酸a的制备方法，操作方便，收率高，可大量制备高纯度该化合物，适合工业化生产。

2.本发明所示制备方法的大孔吸附树脂柱层析和工业色谱纯化技术，所用填料容易再生，可重复使用，正常使用寿命长，可显著降低成本。

附图说明

图1：实施例1中3-甲氧基丹酚酸ahplc检测图；

图2：实施例2中3-甲氧基丹酚酸ahplc检测图。

具体实施方式

实施例1

取丹参药材200.26kg，粉碎，分别加入2000kg、1600kg、1200kg饮用水，加热至75℃，各提取1h，合并提取液60℃浓缩至相对密度1.07，加入95％(v/v)乙醇调至乙醇浓度70％(v/v)，常温放置24h，过滤。滤液浓缩至溶液中乙醇浓度5％(v/v)，用1％(v/v)盐酸调ph至3.5，加热至110℃反应4h，冷却，60℃浓缩至相对密度1.02，采用工业色谱级的hpd-100s大孔吸附树脂柱层析(20*200cm层析柱，50kg填料)，用体积比为30％(v/v)的乙醇-水溶剂洗脱10倍柱体积，40％(v/v)乙醇-水溶液洗脱8倍柱体积，45％(v/v)乙醇-水溶液洗脱8倍柱体积，55％(v/v)乙醇-水溶液洗脱5倍柱体积，合并洗脱液，浓缩干，加体积比为20：80：0.05甲醇-水-甲酸溶液适量溶解，工业色谱系统纯化(dac-hb200动态轴向压缩柱，ods-aq50μm填料10kg)，用体积比为20：80：0.05甲醇-水-甲酸溶液洗脱6倍柱体积，用体积比为30：70：0.05甲醇-水-甲酸溶液洗脱8倍柱体积，用体积比为40：60：0.05甲醇-水-甲酸溶液洗脱5倍柱体积，用体积比为50：50：0.05甲醇-水-甲酸溶液洗脱5倍柱体积，合并洗脱液，45℃减压浓缩干，得3-甲氧基丹酚酸a106.53g，纯度95.26％，hplc色谱图见图1。

实施例2

取丹参药材200.43kg，粉碎，分别加入2000kg、1600kg、1200kg饮用水，加热至80℃，各提取1h，合并提取液65℃浓缩至相对密度1.08，加入95％(v/v)乙醇调至乙醇浓度72％(v/v)，常温放置24h，过滤。滤液浓缩至溶液中乙醇浓度5％(v/v)，用1％(v/v)盐酸调ph至4.0，加热至115℃反应4h，冷却，60℃浓缩至相对密度1.03，采用工业色谱级的hpd-100s大孔吸附树脂柱层析(20*200cm层析柱，50kg填料)，用体积比为30％(v/v)的乙醇-水溶剂洗脱10倍柱体积，40％(v/v)乙醇：水溶液洗脱8倍柱体积，45％(v/v)乙醇-水溶液洗脱8倍柱体积，55％(v/v)乙醇-水溶液洗脱5倍柱体积，合并含有3-甲氧基丹酚酸a的洗脱液，浓缩干，加体积比为20：75：0.05甲醇-水-甲酸溶液适量溶解，工业色谱系统纯化(dac-hb200动态轴向压缩柱，ods-aq50μm填料10kg)，用体积比为20：80：0.05甲醇-水-甲酸溶液洗脱6倍柱体积，用体积比为30：70：0.05甲醇-水-甲酸溶液洗脱8倍柱体积，用体积比为40：60：0.05甲醇-水-甲酸溶液洗脱8倍柱体积，用体积比为50：50：0.05甲醇-水-甲酸溶液洗脱5倍柱体积，合并洗脱液，45℃减压浓缩干，加30％(v/v)甲醇-水适量溶解，继续工业色谱系统纯化(dac-hb150动态轴向压缩柱，ods-aq10μm填料5kg)，用体积比为30：70：0.05甲醇-水-甲酸溶液洗脱15倍柱体积，用体积比为45：55：0.05甲醇-水-甲酸溶液洗脱5倍柱体积，合并高效液相检测纯度大于98％的3-甲氧基丹酚酸a洗脱液，45℃减压浓缩干，得3-甲氧基丹酚酸a94.31g，纯度98.28％，hplc色谱图见图2。