一种肠道厌氧微生物培养瓶及其制备方法与流程

本发明涉及微生物培养技术领域，特别涉及一种肠道厌氧微生物培养瓶及其制备方法。

背景技术：

目前大部分环境中存在的微生物都无法培养，可培养的微生物约占总数量的1％左右，之所以不能被培养，除了丰度较低以外，还包括培养条件不够优化，包括温度、ph、氧气利用率、营养等。从技术上来说，温度可以调节，ph也可以调节，一般难度就在厌氧处理和营养上；因此，厌氧微生物在体外培养过程的重点在于厌氧环境及其营养环境的模拟。

目前，研究中常用的厌氧培养技术，用厌氧箱，厌氧袋，厌氧罐，操作繁琐，成本较高，对于固体培基，涂布完板子，可以在厌氧箱，厌氧袋，厌氧罐中培养，但是用液体培基增殖时，开放的空间反而不方便操作，之前有研究人员解决了厌氧环境的问题，但是厌氧瓶中营养不够，微生物还是生长不好。本发明开发的厌氧培养瓶，在除氧的基础上，添加上具有活性的营养物质，保证微生物的生长，并且操作方便，成本低廉，适合广大微生物研究的技术人员具体实施。

此外，厌氧菌的保存也一直是个大问题，如果按照正常的细菌冻存方法，肯定要跟氧气接触，除非是在厌氧箱中操作，但是厌氧箱制备无氧环境麻烦，带着橡胶手套操作也不方便，此外还需要额外准备无氧冻存液。另外，厌氧菌的运输目前都是采用将细菌在特定条件下制作成干粉，然后装在安瓿瓶中除氧密封，在到达目的地以后，重新活化的方法。对于长距离的运输，这种干粉的处理方式很合适，但是短距离的运输，这样操作性价比就不高了，从一个实验室到另外一个实验室，厌氧菌的运输只能依靠厌氧袋和厌氧罐的转移，不太方便。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种便于肠道厌氧微生物的培养、储存和运输的厌氧微生物培养瓶。

本发明的另一目的是提供上述肠道厌氧微生物培养瓶的制备方法

为此，本发明技术方案如下：

一种肠道厌氧微生物培养瓶，包括密封封装的培养瓶和灌装在培养瓶内的培养液；其中，培养液包括由以体积份计的100份基础培养基水溶液、4份2.5wt.％的l-半胱氨酸盐水溶液和0.1份0.1wt.％的刃天青水溶液混合得到的基础培养液，以及体积份数为基础培养液的4％的活性添加剂混合液配制而成；活性添加剂混合液由以体积份计的10份1640培基液、1份bi血清、1份维生素k和1份氯化血红素混合而成。

该肠道厌氧微生物培养瓶是密封的，完全满足厌氧环境，而培养液则用于为厌氧微生物提供适宜的营养环境；其中，培养液中的l-半胱氨酸具有较强的还原性，其与密封封装的培养瓶中氧气在高温作用下发生氧化反应，生成l-胱氨酸，除氧同时还进一步提供了满足微生物培养的氨基酸；刃天青为氧气指示剂，其用于指示瓶中的氧气含量，有氧气则为粉红色或浅蓝色，便于观察培养瓶内部状态是否满足厌氧培养环境的要求；而活性添加剂混合液对基础培养液进行营养补充，经实验验证，该活性添加剂能够满足大多数厌氧微生物的生长。

优选，所述培养液的灌装体积为培养瓶容积的90％～95％。

优选，所述基础培养基为粉末状的ram基础培养基、cdc基础培养基、rcm基础培养基或mrs基础培养基。

优选，所述培养瓶由西林瓶、插装在西林瓶瓶口处的橡胶胶塞、封装在橡胶胶塞和西林瓶瓶口端部的中空铝盖、以及盖装在中空铝盖上的顶盖。其中，西林瓶为硼硅玻璃材质，刚性结构，抗高温高压，用来储存液体培基，且适合灭菌操作和观察细菌生长状态；采用橡胶胶塞对西林瓶进行封口，可以有效防止瓶中的培养基流出，同时气密性较好，也方便用注射器插进去进行厌氧菌的传代和培养等操作，并保证瓶中厌氧环境；而中空铝盖则是一方面起到加固胶塞的作用，防止高温高压下胶塞弹出，另一方面其中空结构，可以方便以后厌氧菌的培养操作。

优选，所述西林瓶采用硼硅玻璃瓶，其在培养厌氧微生物的过程中，能够实现在不打开盖子的情况下，可以通过测量瓶中液体的浊度，进而测量出瓶中微生物总量；顶盖采用聚四氟乙烯顶盖，高温高压下不易变形，有效防止培养瓶储存和运输期间瓶口污染。

一种厌氧微生物培养瓶的制备方法，具体制备方法如下：

s1、将粉末状的基础培养基按比例溶解在无菌水中配制得到基础培养基溶液；将粉末状刃天青溶解在无菌水中配制得到0.1wt.％的刃天青水溶液；将粉末状l-半胱氨酸盐溶解在无菌水中配制得到2.5wt.％的l-半胱氨酸盐水溶液；

s2、将基础培养基溶液、l-半胱氨酸盐水溶液和刃天青水溶液按照体积比为100:4:0.1混合得到的基础培养液，分别灌装至若干个培养瓶中，并将完成灌装的培养瓶进行密封封装；其中，灌装体积为培养瓶容积的90％～95％；

s3、对经过步骤s2完成灌装和密封的培养瓶进行高压灭菌；

s4、将1640培基液、bi血清、维生素k和氯化血红素按照10:1:1:1的体积比混合配制得到活性添加剂混合液，待经过步骤s4高压灭菌后的培养瓶的温度降至室温后，在无菌操作台中将活性添加剂混合液通过注射器注入至培养瓶内；活性添加剂混合液的注入量与基础培养液的体积比为1:25。

与现有技术相比，该厌氧微生物培养瓶采用培养瓶由商品化产品组装得到，方便采购和使用，而灌装在培养瓶内的培养液也采用商品化产品配制得到，且配制和制备方法简单易行；本申请通过将二者进行装配得到的厌氧微生物培养瓶实现了降低厌氧培养的门槛和成本，让厌氧培养、储存和运输的操作都更为简单，且符合大规模生产的要求，能够满足医院检验科和相关科研单位的使用需求，极大地方便了科研人员的工作，具有很好的商业推广前景。

附图说明

图1为本发明的肠道厌氧微生物培养瓶的培养瓶结构示意图；

图2为根据本发明的实施例2的测试结果的mcf值制作的差异统计图。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步的说明，但下述实施例绝非对本发明有任何限制。

实施例1

采用本申请的方法制备若干个肠道厌氧微生物培养瓶，具体制备方法如下：

一种肠道厌氧微生物培养瓶的制备方法，具体制备方法如下：

s1、将粉末状的ram基础培养基(海博)按71:1000的比例溶解在无菌水中配制得到基础培养基溶液；将粉末状刃天青溶解在无菌水中配制得到0.1wt.％的刃天青水溶液；将粉末状l-半胱氨酸盐溶解在无菌水中配制得到2.5wt.％的l-半胱氨酸盐水溶液；

s2、将100ml的基础培养基溶液、4ml的l-半胱氨酸盐水溶液和0.1ml的刃天青水溶液进行混合得到的混合液分别灌装至10个规格为10ml的西林瓶中，并通过在西林瓶瓶口插装橡胶胶塞、在橡胶胶塞和西林瓶瓶口端部封装中空铝盖、以及在中空铝盖上盖装聚四氟乙烯顶盖，是将对西林瓶的密封封装；其中，混合液灌装体积为10ml，此时培养瓶的瓶颈部分是留空的；

s3、将经过步骤s2完成灌装和密封封装的10个培养瓶放置在型号为zealway的高压锅中，并设定温度为121℃，对10个培养瓶高压灭菌20min；

s4、将10ml的1640培基液、1ml的bi血清、1ml的维生素k和1ml的氯化血红素混合配制得到活性添加剂混合液；待经过步骤s4高压灭菌后的培养瓶的温度降至室温后，在无菌操作台中通过1ml注射器向每个培养瓶中再注入0.4ml的活性添加剂混合液；

s5、重复上述步骤s1～s4，直至制备出足够数量的厌氧微生物培养瓶。

对比例1

采用与实施例1相同的方法，即重复实施例1中的步骤s1～步骤s3，制备若干个未添加有活性添加剂混合液的厌氧微生物培养瓶。

实施例2

采用实施例1制备的和对比例1制备的两种肠道厌氧微生物培养瓶对下表1中的40种菌株进行厌氧培养。具体培养方法为：将表1中的40种肠道厌氧微生物的冻干粉按照序号分别快速溶解在1ml的pbs中，并用1毫升的注射器吸取500微升的溶解菌液，注射进由实施例1和对比例1制作的标有相同序号的厌氧微生物培养瓶中；将全部培养瓶在37℃恒温箱中培养24h，分别测量培养后的微生物的浊度，浊度单位为mcf，1mcf＝3*10^8cfu/ml，cfu为菌株的单位；全部培养瓶在培养前的浊度均为0mcf。

表1：

从上表1的测试结果可以看出，采用对比例1的方法制作的培养瓶虽然也能够对菌种进行培养，但是采用实施例1的方法制作的培养瓶对菌种的培养效果明显更佳。如图2所示为根据表1的测试结果的mcf值制作的差异统计图。从图2中可以看出，采用实施例1的方法制作的培养瓶相对于采用对比例1的方法制作的培养瓶具有明显的菌种培养效果，二者之间的p值为0.0154，小于0.05，具有统计学意义。

实施例3

将实施例2完成培养的样品中，取出采用实施例1制备的40个培养瓶并置于4℃冰箱中，待放置30天后，取出、混匀后，再静止1h恢复室温；分别用注射器从40个培养中吸取500微升液体，注射进采用实施例1制备的40个新的厌氧微生物培养瓶中，并将40个新培养瓶置于37℃恒温箱中培养24h。

培养结束后，分别测量40个新培养瓶经过培养后的微生物的浊度。测试结果表明：除了bacteroidespac002443，lachnospiraceaepac001085_s，lachnospiraceaepac001459_s和lachnospiraceaepac001772_s四株细菌没有长起来，其他36种细菌均被活化，活化率达到90％，可见该厌氧微生物培养瓶能够满足对厌氧微生物短期储存的要求。

此外，由于本申请的肠道厌氧微生物培养瓶的瓶体内液体始终处于密封封装的环境下，基本不受外界环境的影响，且体积小巧，因此也能满足便携携带或运输的要求，如其他科研单位需要某种厌氧菌株可以直接装在口袋里即可携带，或置于冷藏条件下近距离对科研院所或者医院进行运输。

综上所述，本申请公开的肠道厌氧微生物培养瓶实现了厌氧培养、储存和运输的操作都更为简单的目的，且符合大规模生产的要求，具有很好的市场推广前景。