一种分析灵敏度高的甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶测定试剂盒及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生化试剂测定
技术领域：
，特别涉及一种分析灵敏度高的甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶测定试剂盒及其制备方法和应用。
背景技术：
：甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶(glycylprolinedipeptidylaminopeptidase,gpda)于1966年首次被发现，广泛分布于肝、肾、结缔组织、唾液腺及血清、唾液等体液中，细胞内gpda大部分(55％)分布于微粒体中；细胞可溶部分、胞核和线粒体中的gpda分别占胞内gpda总活性的20％，18％和8％。甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶能特异性水解释放肽链n-末端的甘氨酰-脯氨酸(gly-pro)，而胶原分子中富含有这种gly-pro结构，gpda的生理作用可能与胶原肽降解有关。胶原是机体内含量最多的蛋白质，是结缔组织的主要成分，也是上皮细胞基底膜的主要组成部分，对于维持这些组织的功能具有重要作用，由上皮细胞或间充质细胞分化而产生的癌组织常含胶原酶，能分解癌组织周围的胶原，可能与癌的浸润和扩散有关，作为胶原分解过程中的二肽氨基肽酶，gpda也可能起重要作用。已有研究表明，健康成人血清gpda水平较为恒定，新生儿显著低于成人。从婴儿出生到20岁的生长发育阶段，血清gpda逐渐升高。这可能与胶原量的增加有关，也提示gpda在胶原肽降解中的作用。原发性肝癌患者血清gpda活性增高，并明显高于肝硬化、胆石症、慢性肝炎患者，gpda活性的测定对原发性肝癌的诊断有一定的特异性，可能反映了原发性肝癌患者胶原分解代谢的亢进。胃癌患者血清中甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶的活性明显下降，其它良性胃肠道疾病时，血清中甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶的活性也略有降低。血清中gpda有两种同工酶，gpda-s和gpda-f，gpda-f在afp含量变化不明显时，是原发性肝癌的重要标志物，和afp有良好的互补作用(run-zhounietal.2003)。甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶检验方法有荧光法、酶联免疫法和比色法。荧光法、酶联免疫法灵敏度较高，但是操作比较复杂，而且荧光法一般被用来测定gpda水平较低的尿液标本。比色法一般采用连续监测法，即gpda催化底物甘氨酰脯氨酰对硝基苯胺水解，生成甘氨酰脯氨酸和黄色的对硝基苯胺，后者可引起在规定波长下吸光度的升高，吸光度升高速率与gpda活性成正比，而市场上甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶测定试剂存在分析灵敏度低、重复性不好的问题，在用一些精密性稍差的仪器设备中，表现的问题尤为突出。本发明通过反复实验，优化反应体系，提供一种用连续监测法检测甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶的试剂盒，该试剂盒不仅稳定性好，灵敏度高，重复性也好，并能进行临床样本的批量检测。技术实现要素：为了解决上述问题，本发明提供一种甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶测定试剂盒及其制备方法和应用，该试剂盒是一种灵敏度高、稳定性强、重复性好的液体试剂盒。本发明是通过以下技术方案实现的：一种甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶试剂盒，试剂盒含有试剂r1和试剂r2；试剂r1中含有以下成分：试剂r2中含有以下成分：优选地，试剂r1中所述缓冲液为2-氨基-2-甲基-1-丙醇(amp)缓冲液；试剂r2中所述缓冲液为n-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(taps)缓冲液。优选地，试剂r1的ph值为7.0-10.0；试剂r2的ph值为6.0-10.0。优选地，试剂r2中所述的稳定剂为海藻酸钠和硫酸葡聚糖。优选地，试剂r1中所述的防腐剂为叠氮钠、pc300、咪唑烷基脲、对羟基苯甲酸甲酯中的一种或多种；试剂r2中所述的防腐剂为叠氮钠、pc300、咪唑烷基脲、对羟基苯甲酸甲酯中的一种或多种。优选地，试剂r2中所述的表面活性剂为聚乙烯吡咯烷酮k12、烷基酚聚氧乙烯醚op-10的一种或两种。优选地，所述试剂r1与试剂r2的体积比为1～5:1。更优选地，所述试剂r1与试剂r2的体积比为3:1。上述所述的甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶测定试剂盒的制备方法，包括以下步骤：(1)试剂r1的配制：取适量水，分别依次加入r1中所示原料，搅匀溶解一个原料后加入下一个原料，用盐酸或氢氧化钠调节到ph值7.0-10.0，定容到所需体积；(2)试剂r2的配制：取适量水，分别依次加入r2中所示原料，搅匀溶解一个原料后加入下一个原料，用盐酸或氢氧化钠调节到ph值6.0-10.0，定容到所需体积。本发明还公开了该试剂盒的应用，用于非疾病的诊断和治疗目的测定血清中甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶的浓度。本发明基本原理如下：在碱性条件下，gpda催化底物甘氨酰-脯氨酰-对硝基苯胺对甲苯磺酸盐水解，生成甘氨酰脯氨酸和黄色的对硝基苯胺，后者可引起在405nm波长下吸光度的升高，吸光度升高速率与gpda活性成正比。甘氨酰-脯氨酰-对硝基苯胺对甲苯磺酸盐甘氨酰脯氨酸+对硝基苯胺本发明的有益效果：1)本发明选择甘氨酰-脯氨酰-对硝基苯胺对甲苯磺酸盐作为反应底物，这种底物安全性高，同时添加羧甲基壳聚糖，对反应有增效作用，反应后显色能力强，提高了试剂的分析灵敏度。2)在试剂r1和r2中都添加缓冲液，试剂r1中优选2-氨基-2-甲基-1-丙醇(amp)缓冲液，试剂r2中优选taps缓冲液，r1中的缓冲液进行孵育，去除干扰，r2中的缓冲液能够有效提高gpda催化活性，保证显色效果，抑制其他的副反应，有利于提高试剂的重复性。3)在试剂的r2中加入了海藻酸钠和硫酸葡聚糖，可协同提高底物的溶解性和稳定性，同时添加表面活性剂，表面活性剂有乳化作用和助溶作用，可进一步提高底物溶液的稳定性，而且刺激gpda酶发挥最大活性。附图说明图1为实施例1和对比例1试剂的相关性曲线；图2为对比例2和对比例1试剂的相关性曲线；图3为实施例1和对比例1、2、4、5、6、7提供的甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶测定试剂进行稳定性试验的浓度变化。具体实施方式以下是本发明的具体实施例结合附图说明，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。本发明试剂盒测定血清中甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶的测试条件为：方法：速率法；主/副波长：405nm/800nm；温度：37℃；校正类型：线性；校准方法：两点定标；反应方向：向上。具体操作如表1所示。表1甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶测定试剂操作步骤计算结果：样本要求：1.不溶血血清。2.样本稳定性：标本2～8℃保存可稳定3天，-20℃保存可稳定2周。实施例1一种分析灵敏度高的甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶测定试剂盒，它包括试剂r1和试剂r2。试剂r1的组分为：试剂r2的组分为：试剂r1的ph值为7.5；试剂r2的ph值为8.8；制备方法:(1)试剂r1的配制：取适量水，分别加入r1中所示原料，搅匀溶解一个原料后加入下一个原料，用盐酸或氢氧化钠调节到所需ph值，定容到所需体积。(2)试剂r2的配制：取适量水，分别加入r2中所示原料，搅匀溶解一个原料后加入下一个原料，用盐酸或氢氧化钠调节到所需ph值，定容到所需体积。实施例2试剂r1的组分为：试剂r2的组分为：试剂r1的ph值为8.0；试剂r2的ph值为8.6；实施例2试剂盒的制备方法同实施例1实施例3试剂r1的组分为：试剂r2的组分为：试剂r1的ph值为7.8；试剂r2的ph值为8.4；实施例3试剂盒的制备方法同实施例1对比例1甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶elisa试剂盒对比例2公开的常规应用的一种配方，用作理论对照。试剂r1的组分为：三羟甲基氨基甲烷缓冲液100mmol/l双甘氨肽60mmol/l叠氮钠1g/l试剂r2的组分为：甘氨酰-脯氨酰-对硝基苯胺100mmol/l叠氮钠1g/l对比例3与实施例1中甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶测定试剂盒的区别仅在于试剂r1不含羧甲基壳聚糖，其它与实施例1相同。对比例4与实施例1中甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶测定试剂盒的区别仅在于试剂r2不含海藻酸钠，其它与实施例1相同。对比例5与实施例1中甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶测定试剂盒的区别仅在于试剂r2不含硫酸葡聚糖，其它与实施例1相同。对比例6与实施例1中甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶测定试剂盒的区别仅在于试剂r2不含聚乙烯吡咯烷酮k12，其它与实施例1相同。对比例7与实施例1中甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶测定试剂盒的区别仅在于试剂r2用等量蔗糖代替硫酸葡聚糖，其它与实施例1相同。性能验证试验一相关性试验试验方案为：实施例1、对比例1和对比例2，同时检测了40个临床血清样本，对两组检测结果进行相关性分析，计算相关系数r；以对比例1检测结果作为靶值，分别计算40对数据的相对偏差(bias％)。要求r不小于0.990，相对偏差不超过±10％。表2相关性对比实验结果表3对比例1分别与实施例1和对比例2的相关系数相关系数r实施例1和对比例10.9988对比例2和对比例10.9821由表2和图1可以看出，实施例1和对比例1的试剂盒血清样本测试偏差最大值为-2％，两种试剂的相关系数为0.9988，实施例1和对比例1的检测结果非常接近，因此本发明提供的实施例1检测试剂准确度较高；由表2和图2可以看出，对比例2和对比例1检验结果偏差较大，相关系数为0.9821，说明本发明试剂盒通过优化反应体系，准确度优于对比例2。试验二灵敏度实验分别用实施例1、对比例1、2、3的试剂测定已知浓度在100u/l的样本，记录吸光度变化率(δa/min)。检测结果见表3。表4分析灵敏度对比实验结果通过检测数据可知，实施例1测定试剂盒的吸光度变化率与elisa试剂盒相似，均高于对比例2和对比例3的，说明本发明试剂盒的分析灵敏度在添加羧甲基壳聚糖后明显提高。试验三稳定性实验对实施例1和对比例1、2、4、5、6、7提供的甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶测定试剂进行稳定性试验，试验方案为：对实施例1和对比例1、2、4、5、6、7提供的试剂，一起放入37℃水浴箱中，每天检测靶值为96.5±4u/l的质控品，并监测质控品测定值的变化。表5试剂热稳定性验证结果由表5和图3可以看出，与对比例1相似，本发明提供的实施例1试剂在37℃水浴条件下10天内基本无变化，稳定性较好；而对比例2、4、5、6、7试剂在37℃水浴条件下10天内变化明显，尤其是对比例2。实施例1的试剂盒稳定性优于对比例2、4、5、6、7试剂盒的稳定性，说明本发明海藻酸钠，硫酸葡聚糖，表面活性剂的同时加入，可以协同提高甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶测定试剂盒的稳定性。试验四重复性试验分别选取高值、中值、低值三个质控，分别用实施例1和对比例1、2进行对照检测，对每份质控进行20次检测，将共20次检测结果计算平均值、标准差和变异系数。表6试剂重复性验证结果由检测结果可知，实施例1检测数值接近靶值，标准偏差小，变异系数小，重复性较好。这说明本发明通过调整优化反应体系，优化了反应过程，抑制了副反应，极大的提高了试剂的重复性。本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属
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的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实施例，但是对本领域熟练技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。当前第1页12