白介素37的应用及对肺癌细胞RNAm6A甲基化影响的试验方法与流程

文档序号:21690229发布日期:2020-07-31 22:07阅读:489来源:国知局
白介素37的应用及对肺癌细胞RNA m6A甲基化影响的试验方法与流程

本发明涉及白介素37的应用及对肺癌细胞rnam6a甲基化影响的试验方法,属于生物化学领域。



背景技术:

中国的癌症发病率和死亡率逐年上升,据统计,2015年中国约有429.2万例癌症新发病例,281.4万例癌症死亡病例,肺癌是其中最常见的癌症,也是癌症死亡的首要原因。肺腺癌患者人数占所有肺癌患者的80%左右,且大多数肺腺癌患者在确诊时已处于晚期阶段,术后5年生存率差。目前,肺腺癌治疗方式有手术、放化疗以及靶向治疗等,靶向治疗以其精准、高效的特点在癌症治疗中起到了越来越大的作用。因此,发现并筛选新的肺腺癌有效的预后标志物和潜在的治疗靶点是目前研究的重要临床科学问题。

白介素37作为il-1家族中一类新型抑炎性细胞因子,除了可以抑制过度的炎症反应,越来越多的研究表明,il-37在肺癌的发生发展中发挥着举足轻重的作用。有研究证实il-37可以通过抑制il-6/stat3信号通路抑制非小细胞肺癌的侵袭转移;过表达il-37的a549细胞凋亡率升高,而且il-37组裸鼠移植体体积和重量均低于空白质粒组;细胞内成熟的il-37是一种新的内源性rac1抑制剂,可能成为控制rac1(ras相关的c3肉毒素底物1)活性和肺癌进展。由此可见il-37对肺癌的抑制作用已被大量文献证实,但其在表观遗传学方向的抑癌机制还未见有报道。

n6-甲基腺嘌呤(m6a)是真核细胞信使rna(mrnas)及非编码rna中最为丰富的表观遗传学修饰,也是一种动态、可逆的化学修饰过程。近年来很多研究表明rna甲基化与肿瘤的发生发展密不可分,包括书写器、消除器及阅读器的异常都可导致肿瘤的产生与进展。有研究表明,包括mettl-3和mettl14复合体、rna结合蛋白15等甲基化转移酶复合物在髓系白血病中高度表达,他们的改变往往预示着预后不良,表明m6a水平的升高可能预示着髓系白血病的发生。去甲基化酶的表达也与肿瘤关系密切,例如:低氧促进乳腺癌的表达,部分是通过增加去甲基化酶alkbh5的表达,进而减少m6a表达水平来实现的;有研究者也发现,在某些急性粒细胞白血病亚型中fto通过促进细胞增殖或转化和体外抑制细胞凋亡,使用merip-seq测序法证实fto过表达和敲除会分别降低和提升靶基因asb2和rara的m6a水平,进一步证实fto可促进aml的发展,在aml中发挥着“原癌基因”的作用。除此之外,wtap在膀胱癌中表达明显上升,有望成为潜在的治疗靶点。此外,还有研究认为rna甲基化转移酶在有些癌症中发挥“抑癌基因”的作用,如通过上调mettl3后能明显抑制肾细胞癌细胞增殖、迁移和侵袭等,并诱导g0/g1期阻滞,可能是通过pi3k-akt-mtor通路来实现的;而mettl14在肝癌中通过与dgcr8相互作用,上调microrna-126的表达抑制肿瘤细胞转移。综上所述,il-37抑制肺癌生物学行为的机制研究并不充分。



技术实现要素:

本发明的目的在于提供白介素37的应用及对肺癌细胞rnam6a甲基化影响的试验方法,以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的本发明采用以下技术方案:白介素37在对肺癌细胞的m6a调控的应用,以及在通过靶向wnt5a/5b影响肺癌的侵袭和转移生物学行为的应用。

白介素37对肺癌细胞rnam6a甲基化影响的试验方法,包括如下步骤:

1)、细胞培养;

人肺腺癌细胞使用含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的dmem-f12培养基,人正常肺上皮细胞使用含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的1640培养基,置于37℃、5%的co2培养箱中培养,将生长良好1×10^6个a549细胞接种于直径96mm培养皿中,加入10ml培养基培养,待细胞融合率为50%时,将培养基换为5ml含有5μg/ml的polybrene混合培养基,分别加入15μl携带有nc和il-37质粒的慢病毒,4小时后再加入5ml混合培养基培养,72小时后加入5mltrizol收集到离心管中,-20℃冻存;

2)、rna制备;

il-37组及nc组各制备3个生物学重复,使用trizol试剂提取组织总rna,使用ribo-zerorrna去除试剂盒降低总rna的核糖体rna含量,随后使用碎片缓冲液将rna碎片化成大约100个核苷酸长度的片段;

3)、rnamerip-seq文库构建及测序;

首先将rna片段与抗m6a多克隆抗体在免疫沉淀(ip)缓冲液中于4℃孵育2小时,然后将混合物与a蛋白珠在4℃温育2小时,使混合物免疫沉淀,然后在ip缓冲液中用m6a从微珠上洗脱结合的rna,随后用trizol试剂提取,继续使用nebnextrultratmrna库制备试剂盒收集纯化的rna,以生成rna-seq库,最后,将非免疫沉淀的输入样品和m6aip样品在illuminahiseq4000测序仪上进行了150bp的配对末端测序;

4)、数据分析;

以q30作为配对读段质控标准,随后修剪3个适配器并使用cutadapt软件(v1.9.3)去除低质量读段,随后使用hisat2软件(v2.0.4)将所有文库的读数与参考基因组(mm10)对齐,使用chip-seq(macs)软件进行模型分析,检测到得分(-10*log10,p值)>3的峰,差异甲基化位点的倍数变化截止值≥2,错误发现率截止值为≤0.0001,通过diffreps差分分析包进行识别,使用macs和diffreps识别并分析mrna和lncrna中外显子重叠的m6a峰,m6a结合蛋白数据来自rmbasev2.0数据库,

使用基因注释、可视化分析、集成分析数据库进行了基因本体论(go)和富集途径分析,go分析包括三个部分:细胞成分(cc),分子功能(mf)和生物过程(bp),p值表示该基因go项富集的重要性,富集途径分析是一种功能分析,可将基因映射至kegg(kyotoencyclopediaofgenesandgenomes)通路分析,p值表示与条件相关的途径的重要性。

与现有技术相比,本发明的有益效果是:本发明从表观遗传学入手,通过对il-37过表达的肺癌a549细胞进行merip-seq(methylatedrnaimmunoprecipitationsequencing)检测,发现il-37对a549细胞的rnam6a修饰产生显著的影响,预示着il-37可通过rnam6a以来的方式影响肺癌的增殖、转移等生物学行为。

附图说明

图1为本发明肺腺癌细胞a549rna的merip-seq分析显示图。

图2为本发明含有差异甲基化位点的蛋白编码基因进行go富集分析图(甲基化m6a位点的基因在rna核输出等相关的过程中显著(p<0.05)富集)。

图3为本发明含有差异甲基化位点的蛋白编码基因进行go富集分析图,具有甲基化m6a位点的基因在调节蛋白质入核、调节含核酸酶代谢过程、抑制白介素-6的产生等方面高度(p<0.05)富集)。

图4为本发明含有差异甲基化位点的蛋白编码基因进行kegg通路分析图(具有甲基化m6a位点的基因密切(p<0.05)参与剪接体相关途径、nod样受体、精氨酸和脯氨酸代谢等信号通路)。

图5为本发明为本发明含有差异甲基化位点的蛋白编码基因进行kegg通路分析图(在下调的信号通路中,则主要参与了细胞粘附分子、小细胞肺癌、rna降解、细胞外基质受体等信号通路)。

图6为本发明在对照组和处理组中wnt5甲基化峰的差异图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的阐述。

1.1细胞培养;

人肺腺癌细胞系a549购于上海歌凡生物科技有限公司,人肺腺癌细胞使用含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的dmem-f12培养基,人正常肺上皮细胞使用含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的1640培养基,置于37℃、5%的co2培养箱中培养。将生长良好1×10^6个a549细胞接种于直径96mm培养皿中,加入10ml培养基培养,待细胞融合率为50%左右时,将培养基换为5ml含有5μg/ml的polybrene混合培养基,分别加入15μl携带有nc和il-37质粒的慢病毒,4小时后再加入5ml混合培养基培养。72小时后加入5mltrizol收集到离心管中,-20℃冻存。

1.2rna制备;

il-37组及nc组各制备3个生物学重复。使用trizol试剂提取组织总rna。使用ribo-zerorrna去除试剂盒降低总rna的核糖体rna含量。随后使用碎片缓冲液将rna碎片化成大约100个核苷酸长度的片段。trizol试剂购自英潍捷基(上海)贸易有限公司。ribo-zerorrna去除试剂盒、碎片缓冲液均来自美国因美纳公司。

1.3rnamerip-seq文库构建及测序;

首先将rna片段与抗m6a多克隆抗体在免疫沉淀(ip)缓冲液中于4℃孵育2小时。然后将混合物与a蛋白珠在4℃温育2小时,使混合物免疫沉淀。然后在ip缓冲液中用m6a从微珠上洗脱结合的rna,随后用trizol试剂提取。继续使用nebnextrultratmrna库制备试剂盒收集纯化的rna,以生成rna-seq库。最后,将非免疫沉淀的输入样品和m6aip样品在illuminahiseq4000测序仪上进行了150bp的配对末端测序。

1.4数据分析;

以q30作为配对读段质控标准,随后修剪3个适配器并使用cutadapt软件(v1.9.3)去除低质量读段。随后使用hisat2软件(v2.0.4)将所有文库的读数与参考基因组(mm10)对齐。使用chip-seq(macs)软件进行模型分析,检测到得分(-10*log10,p值)>3的峰。差异甲基化位点的倍数变化截止值≥2,错误发现率截止值为≤0.0001,通过diffreps差分分析包进行识别。使用macs和diffreps识别并分析mrna和lncrna中外显子重叠的m6a峰。m6a结合蛋白数据来自rmbasev2.0数据库。

使用基因注释、可视化分析、集成分析数据库进行了基因本体论(go)和富集途径分析。go分析包括三个部分:细胞成分(cc),分子功能(mf)和生物过程(bp)。p值表示该基因go项富集的重要性。富集途径分析是一种功能分析,可将基因映射至kegg(kyotoencyclopediaofgenesandgenomes)通路分析。p值表示与条件相关的途径的重要性。

a549细胞正常组和il-37处理组中m6a甲基化的一般特征;

肺腺癌细胞a549rna的merip-seq分析显示,在对照组的两个生物学重复中,有1647个编码基因转录本(mrna)中存在2040个非重叠m6a峰,在220个长非编码转录本(lncrnas)中存在232个非重叠m6a峰。在il-37处理组的两次生物学重复中,有1300个mrna中有1533个不重叠的m6a峰,在175个lncrna中有181个不重叠的m6a峰。其中,mrna中的35个峰(仅占对照组和处理组所有峰的约1%)在对照组和处理组之间重叠,而lncrna中仅有1个峰(占对照组和处理组所有峰约0.2%)和处理组重叠(图1)。由此可见mrna和lncrna中重叠的m6a峰的百分比都比较低,表明两组之间的mrna和lncrnam6a模式均存在较大差异。

差异甲基化rna参与重要生物学通路;

为了揭示il-37介导的m6a在肺腺癌细胞a549中的功能,我们选择了含有差异甲基化位点(differentiallymethylatedm6asites,dmms)的蛋白编码基因进行go富集分析和kegg通路分析。在生物学过程这一类别中,我们发现甲基化m6a位点的基因在rna核输出等相关的过程中显著(p<0.05)富集(图2),而且具有甲基化m6a位点的基因在调节蛋白质入核、调节含核酸酶代谢过程、抑制白介素-6的产生等方面高度(p<0.05)富集(图3)。除此之外,在上调相关信号通路中,我们的结果显示具有甲基化m6a位点的基因密切(p<0.05)参与剪接体相关途径、nod样受体、精氨酸和脯氨酸代谢等信号通路(图4);在下调的信号通路中,则主要参与了细胞粘附分子、小细胞肺癌、rna降解、细胞外基质受体等信号通路(图5),提示其可能参与相关通路中重要的生物学过程。

对照组和处理组中wnt5甲基化峰的差异;

在将原始数据导入可视化软件中分析后我们发现,在两个生物学重复中,相比于对照组,il-37处理组的wnt5a及5b的m6a甲基化峰值明显升高(图6)。wnt5a(wntfamilymember5a)属于分泌信号糖蛋白家族,在机体生长发育、生理和病理过程中起重要作用,wnt5a蛋白也是非wnt/β-catenin(β-连环素)信号通路中研究的热点[17]。wnt5a参与了多种人类恶性肿瘤的致癌和抑癌过程。例如在人类结肠癌细胞中,wnt5a信号已被证明会抑制癌细胞迁移和侵袭[19];而在宫颈癌hela细胞中wnt5a信号通路与细胞迁移和emt发生密切相关,通过调节细胞极性和定向迁移促进肿瘤进展。另有研究称wnt5a/b和β-catenin在炎性乳腺癌(inflammatorybreastcancer,ibc)组织中的表达显著增加,并与患者的高肿瘤分级和淋巴血管侵犯的存在呈正相关。因此,我们结果所显示的il-37处理组的wnt5a及5b的m6a甲基化峰值升高,提示il-37可能通过靶向wnt5a/5b影响在肺癌的侵袭和转移等生物学行为。

我们使用携带il-37质粒的慢病毒构建过表达il-37的a549细胞株,通过merip-seq探究il-37对a549细胞rna甲基化状态的影响,并对il-37处理组相对于对照组的m6a甲基化差异进行了表征,证明il-37处理组和对照组中mrna和lncrnam6a模式均存在较大差异。表明il-37对a549细胞的m6a存在显著的调控作用。除此之外,il-37处理组的wnt5a及5b的m6a甲基化峰值明显升高,也提示il-37可能通过靶向wnt5a/5b影响在肺癌的侵袭和转移等生物学行为,为今后的研究提供方向。

以上所述为本发明较佳实施例,对于本领域的普通技术人员而言,根据本发明的教导,在不脱离本发明的原理与精神的情况下,对实施方式所进行的改变、修改、替换和变型仍落入本发明的保护范围之内。

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