本发明属于生检测技术领域，具体涉及一种检测mll-af4融合基因的方法。
背景技术：
mll(mixedlineageleukemia)基因异常是急性白血病中一种十分常见的染色体异常，大多数发生mll基因异常的急性白血病的预后很差，其中由t(4；11)(q21；q23)易位而形成的mll-af4融合基因是急性淋巴细胞白血病中第二大常见的染色体异常,多数患者对常规化疗耐药，即使做异基因造血干细胞移植也容易复发，是一个独立的预后不良因素。
当前国内外广泛使用的分子生物学检测mll-af4融合基因的方法中，荧光原位杂交技术(fish)虽然结果较为直观，但只能进行定性检测且操作复杂，需要荧光显微镜等大型仪器设备和病理医生的诊断意见，对检测机构的要求较严格，不利于临床样本的快速检出。传统的固相生物芯片(biochip)或基因芯片技术存在着可重复性差、灵敏度不够好以及操作繁琐，成本高的突出弱点。因此我们需要一款新型的检测mll-af4融合基因的方法来解决上述问题，满足人们的需求。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种检测mll-af4融合基因的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种检测mll-af4融合基因的方法，按照先后顺序依次包括以下步骤：
步骤一：样本dna的获取：通过提取核酸的试剂对样本进行处理，获得待测样本的dna；
步骤二：pcr反应液的配置：分为阳性对照、样本和阴性对照三管，每个管中的反应体系均为20μl，且用于扩增mll-af4融合基因的引物为：
f：5’-ccgcccaagtatccctgtaaaac-3’；
r：3’-tcgttatgtatgcggatcatgtcg-5’；
步骤三：目的条带扩增：以待测样本的dna为模板，通过设计的引物扩增需要的dna片段；
步骤四：目的dna回收：对上述pcr反应液进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带；
步骤五：对上述步骤中dna片段进行纯化处理；
步骤六：对纯化后的dna进行转化；
步骤七：测序，判断是否为mll-af4融合基因。
优选的，所述步骤二中引物序列的浓度为700-800nm。
优选的，所述步骤三中将配好的试剂通过pcr仪中来扩增目的条带，其中pcr仪反应参数为：94℃，3min；进入循环程序，94℃，3s；55℃，45s；72℃，30s，循环次数为30次；72℃，10min。
优选的，所述步骤一中样本为人和动物组织、新鲜植物组织或者为血液。
优选的，所述阳性对照管中样本dna为mll-af4融合基因溶液，且浓度为500拷贝/μl。
优选的，所述阴性对照管中样本dna为ddh2o。
优选的，所述步骤二中pcr反应液组成及成分为dna聚合酶(2×taqmix)14-17μl、引物序列f1μl、引物序列r1μl、样本dna1μl、加入ddh2o补至20μl。
本发明的技术效果和优点：该检测mll-af4融合基因的方法设计了适用于pcr扩增的引物，在检测的过程中具有很高的特异性、准确定和灵敏度，且更加快速和高效的扩增出目的条带，且具有可重复性。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一：
一种检测mll-af4融合基因的方法，按照先后顺序依次包括以下步骤：
步骤一：样本dna的获取：通过提取核酸的试剂对样本进行处理，获得待测样本的dna，样本为人和动物组织、新鲜植物组织或者为血液；
步骤二：pcr反应液的配置：分为阳性对照、样本和阴性对照三管，每个管中的反应体系均为20μl，阳性对照管中样本dna为mll-af4融合基因溶液，且浓度为500拷贝/μl，阴性对照管中样本dna为ddh2o，且用于扩增mll-af4融合基因的引物为：
f：5’-ccgcccaagtatccctgtaaaac-3’；
r：3’-tcgttatgtatgcggatcatgtcg-5’；引物序列的浓度为700-800nm，
pcr反应液组成及成分为dna聚合酶(2×taqmix)14μl、引物序列f1μl、引物序列r1μl、样本dna1μl、加入ddh2o补至3μl；
步骤三：目的条带扩增：以待测样本的dna为模板，通过设计的引物扩增需要的dna片段，将配好的试剂通过pcr仪中来扩增目的条带，其中pcr仪反应参数为：94℃，3min；进入循环程序，94℃，3s；55℃，45s；72℃，30s，循环次数为30次；72℃，10min；
步骤四：目的dna回收：对上述pcr反应液进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带；
步骤五：对上述步骤中dna片段进行纯化处理；
步骤六：对纯化后的dna进行转化；
步骤七：测序，判断是否为mll-af4融合基因。
实施例二：
一种检测mll-af4融合基因的方法，按照先后顺序依次包括以下步骤：
步骤一：样本dna的获取：通过提取核酸的试剂对样本进行处理，获得待测样本的dna，样本为人和动物组织、新鲜植物组织或者为血液；
步骤二：pcr反应液的配置：分为阳性对照、样本和阴性对照三管，每个管中的反应体系均为20μl，阳性对照管中样本dna为mll-af4融合基因溶液，且浓度为500拷贝/μl，阴性对照管中样本dna为ddh2o，且用于扩增mll-af4融合基因的引物为：
f：5’-ccgcccaagtatccctgtaaaac-3’；
r：3’-tcgttatgtatgcggatcatgtcg-5’；引物序列的浓度为700-800nm，
pcr反应液组成及成分为dna聚合酶(2×taqmix)15μl、引物序列f1μl、引物序列r1μl、样本dna1μl、加入ddh2o补至2μl；
步骤三：目的条带扩增：以待测样本的dna为模板，通过设计的引物扩增需要的dna片段，将配好的试剂通过pcr仪中来扩增目的条带，其中pcr仪反应参数为：94℃，3min；进入循环程序，94℃，3s；55℃，45s；72℃，30s，循环次数为30次；72℃，10min；
步骤四：目的dna回收：对上述pcr反应液进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带；
步骤五：对上述步骤中dna片段进行纯化处理；
步骤六：对纯化后的dna进行转化；
步骤七：测序，判断是否为mll-af4融合基因。
实施例三：
一种检测mll-af4融合基因的方法，按照先后顺序依次包括以下步骤：
步骤一：样本dna的获取：通过提取核酸的试剂对样本进行处理，获得待测样本的dna，样本为人和动物组织、新鲜植物组织或者为血液；
步骤二：pcr反应液的配置：分为阳性对照、样本和阴性对照三管，每个管中的反应体系均为20μl，阳性对照管中样本dna为mll-af4融合基因溶液，且浓度为500拷贝/μl，阴性对照管中样本dna为ddh2o，且用于扩增mll-af4融合基因的引物为：
f：5’-ccgcccaagtatccctgtaaaac-3’；
r：3’-tcgttatgtatgcggatcatgtcg-5’；引物序列的浓度为700-800nm，
pcr反应液组成及成分为dna聚合酶(2×taqmix)16μl、引物序列f1μl、引物序列r1μl、样本dna1μl、加入ddh2o1μl；
步骤三：目的条带扩增：以待测样本的dna为模板，通过设计的引物扩增需要的dna片段，将配好的试剂通过pcr仪中来扩增目的条带，其中pcr仪反应参数为：94℃，3min；进入循环程序，94℃，3s；55℃，45s；72℃，30s，循环次数为30次；72℃，10min；
步骤四：目的dna回收：对上述pcr反应液进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带；
步骤五：对上述步骤中dna片段进行纯化处理；
步骤六：对纯化后的dna进行转化；
步骤七：测序，判断是否为mll-af4融合基因。
实施例四：
一种检测mll-af4融合基因的方法，按照先后顺序依次包括以下步骤：
步骤一：样本dna的获取：通过提取核酸的试剂对样本进行处理，获得待测样本的dna，样本为人和动物组织、新鲜植物组织或者为血液；
步骤二：pcr反应液的配置：分为阳性对照、样本和阴性对照三管，每个管中的反应体系均为20μl，阳性对照管中样本dna为mll-af4融合基因溶液，且浓度为500拷贝/μl，阴性对照管中样本dna为ddh2o，且用于扩增mll-af4融合基因的引物为：
f：5’-ccgcccaagtatccctgtaaaac-3’；
r：3’-tcgttatgtatgcggatcatgtcg-5’；引物序列的浓度为700-800nm，
pcr反应液组成及成分为dna聚合酶(2×taqmix)17μl、引物序列f1μl、引物序列r1μl、样本dna1μl；
步骤三：目的条带扩增：以待测样本的dna为模板，通过设计的引物扩增需要的dna片段，将配好的试剂通过pcr仪中来扩增目的条带，其中pcr仪反应参数为：94℃，3min；进入循环程序，94℃，3s；55℃，45s；72℃，30s，循环次数为30次；72℃，10min；
步骤四：目的dna回收：对上述pcr反应液进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带；
步骤五：对上述步骤中dna片段进行纯化处理；
步骤六：对纯化后的dna进行转化；
步骤七：测序，判断是否为mll-af4融合基因。
实施例五：
上述任一实施例中样本dna的提取，具体为：
从动物组织提取，先后顺序为：
取1～100mg的动物组织或人组织移入冰浴预冷的研钵中，快速用力展研成匀浆；
加入650μl的solutiona和0.9μl的rnasea1，温和研磨30秒钟；
收集650μl研磨好的组织匀浆液移至collectiontube中。如果匀浆体积不足650μl，请补充solutiona至650μl，65℃保温5分钟；
加入400μl的solutionb，振荡混合；
加入1ml的4℃预冷的solutionc，充分混匀后，12000rpm离心2分钟；
弃去上层有机相，再加入1ml的4℃预冷的solutionc，充分混匀后，12000rpm离心2分钟；
弃去上层有机相，然后将水相溶液(无色下层)转移至置于collectiontube上的filtercup中，12000rpm离心1分钟；
弃filtercup，在滤液中加入400μl的dbbuffer，混合均匀；
将试剂盒中的spincolumn安置于collectiontube上，将上述操作的滤液混合溶液转移至spincolumn中，12000rpm离心1分钟，弃滤液；
将500μl的rinsea加入至spincolumn中，12000rpm离心30秒钟，弃滤液；
将700μl的rinseb加入至spincolumn中，12000rpm离心30秒钟，弃滤液；
重复上个操作；
将spincolumn安置于新的1.5ml的离心管上，在spincolumn膜的中央处加入50～200μl的灭菌蒸馏水或elutionbuffer，室温静置1分钟；
12000rpm离心1分钟洗脱dna。
从植物材料提取，先后顺序为：
按下表称取适量的新鲜植物材料(如选用的是冷冻干燥植物材料，则用量减半)，剪成小块放入研钵中，加入液氮，待样品冷冻完全后快速、用力研磨至粉末状，研磨时应间断加入液氮以防止材料融化；
将研钵移至65℃水浴，当样品粉末刚开始融化时，向研钵中加入700μl的solutiona和1.2μl的rnasea1，用力碾磨30秒；
收集650μl研磨好的组织匀浆移至collectiontube中。如匀浆体积不足650μl，请补充solutiona至650μl，65℃保温15分钟；
剩下的步骤同动物组织提取步骤一致。
从血液中提取，先后顺序为：
取10～250μl的全血(含抗凝剂)加入至collectiontube中；
加入500μl的solutiona；
加入1μl的rnasea1，激烈振荡15秒钟后，冰浴5分钟；
剩下的步骤同动物组织提取步骤一致。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。