一种三维TSPCs球体肌腱向分化诱导培养基及分化培养方法与流程

本发明属于细胞工程技术领域，特别涉及一种三维tspcs球体肌腱向分化诱导培养基，还涉及一种三维tspcs球体肌腱向分化培养方法。

背景技术：

肌腱是连接骨骼和肌肉的纤维结缔组织，负责传递由骨骼和肌肉产生的力量而使身体发生运动。肌腱损伤常常发生于运动或者体力劳动中。随着人们生活方式的改变以及体育锻炼的增加，肌腱损伤日益增多，占运动损伤的50％。由于肌腱组织细胞少、血供差等，一旦损伤或者缺损，极难愈合，恢复肌腱结构和功能是医学领域目前最具挑战的难题之一。

近年来，随着干细胞生物学以及组织工程技术的发展给肌腱损伤治疗带来了希望。肌腱干/祖细胞(tspcs)作为组织工程首选的种子细胞。2007年bi等第一次从人和鼠的肌腱组织中成功分离出tspcs，并发现在体外培养这种细胞具有间充质干细胞的普遍特性，如克隆形成能力、自我更新能力以及多向分化潜能等。tspcs在体外普通培养环境下，给予适宜的化学因子诱导后可以分化形成成熟的肌腱细胞；然而分化的肌腱细胞群体无法很好模拟肌腱组织本身的结构特征，缺乏典型的细胞间平行有序的排列结构，无法用来作为筛选和评价影响tspcs分化功能因素的稳定体系，大大阻碍了探索并发现新的、潜在的、调节tspcs分化功能的基因和生长活性因子。

技术实现要素：

技术问题：为了解决上述难题，本发明提供了一种三维tspcs球体肌腱向分化诱导培养基，所述培养基为含有tgf-β1、gdf5、维生素c、地塞米松、胰岛素的dmem培养基。

优选地，其中，tgf-β1的浓度为5-20ng/ml，gdf5的浓度为5-20ng/ml，维生素c浓度为0.2-0.8μm，地塞米松的浓度为35-65μm，胰岛浓度为7-15μm。

优选地，其中，tgf-β1的浓度为15ng/ml，gdf5的浓度为10ng/ml，维生素c浓度为0.5μm，地塞米松的浓度为50μm、胰岛素的浓度为10μm。

同时，本发明还提供了一种tspcs的三维球体体外培养方法，包括以下步骤：tspcs于dmem培养基中重悬，置于一定浓度co2的恒温孵箱中培养；待tspcs至80-90％融合后，接种于低粘附培养皿中，加入1-3％低浓度的胎牛血清、10-30ng/mlbfgf以及30-40ng/mlegf生长因子，置于一定浓度co2的恒温孵箱中培养，即得tspcs的三维球体。

优选地，其中选用加入2％低浓度的胎牛血清、20ng/mlbfgf以及36ng/mlegf生长因子。

同时，本发明还提供了一种三维tspcs球体肌腱向分化培养方法，包括以下步骤：将tspcs的三维球体置于离心管中，通过差异性梯度离心的方法去除散在的单个细胞和废弃的培养基；轻柔加入诱导培养基，转移至铺有matrigel的正常粘附培养皿中培养，每2-3天更换新鲜的诱导培养基。

优选地，所述培养基为含有tgf-β1、gdf5、维生素c、地塞米松、胰岛素的dmem培养基。

优选地，其中，tgf-β1的浓度为5-20ng/ml，gdf5的浓度为5-20ng/ml，维生素c浓度为0.2-0.8μm，地塞米松的浓度为35-65μm，胰岛浓度为7-15μm。

优选地，其中，tgf-β1的浓度为15ng/ml，gdf5的浓度为10ng/ml，维生素c浓度为0.5μm，地塞米松的浓度为50μm、胰岛素的浓度为10μm。

有益效果：本发明方法通过在体外构建三维球体培养的体系，并使用适宜的生物活性因子组合诱导后，在体外成功诱导tspcs分化，并且体外模拟肌腱组织特征性的平行有序的结构，可以作为筛选并评价影响tspcs分化功能因素的稳定的体外体系，用于探索并发现新的、潜在的、调节tspcs分化功能的基因和生长活性因子。

附图说明

图1：图1a为10倍光镜下tspcs三维球体培养第3天的形貌图，显示tspcs开始逐渐聚集成群；图1b为tspcs三维球体培养第7天的光学显微镜结果，显示tspcs已经形成球体结构。

图2：图2a为球体培养第7天后的tspcs球体阳性表达干细胞干性基因sox2、cd146的免疫荧光图；图2b为球体培养第7天后的tspcs球体阳性表达干细胞干性基因oct4、cd146的免疫荧光图。

图3：图3a为球体培养第7天后的tspcs球体转移至含有诱导培养基的正常粘附培养皿后，经过连续14天的诱导分化后的肌腱相关基因scx的免疫荧光图(图中白色亮点细胞代表scx阳性细胞)；图3b为球体培养第7天后的tspcs球体转移至含有诱导培养基的正常粘附培养皿后，经过连续14天的诱导分化后的肌腱相关基因col1以及细胞骨架蛋白f-actin的免疫荧光图(图中染色较深的即为col1染色阳性细胞)。

图4：图4a为球体培养第7天后的tspcs球体转移至含有诱导培养基的正常粘附培养皿后，经过连续21天的诱导分化后的肌腱相关基因tnmd的免疫荧光图图中染色较深的即为tnmd染色阳性细胞)；图4a为球体培养第7天后的tspcs球体转移至含有诱导培养基的正常粘附培养皿后，经过连续21天的诱导分化后的肌腱相关基因tnc和增殖相关基因ki67的免疫荧光图(图中染色较深的即为tnc染色阳性细胞，图中白色亮点细胞代表ki67阳性细胞)。

图5：图5a为球体培养第7天后的tspcs球体转移至含有诱导培养基的正常粘附培养皿后，经过连续21天的诱导分化后的光学显微镜下图；图5b球体培养第7天后的tspcs球体转移至含有诱导培养基的正常粘附培养皿后经过连续21天的诱导分化后的he染色图(图中着色较深区域为染色阳性区域)；图5c球体培养第7天后的tspcs球体转移至含有诱导培养基的正常粘附培养皿后经过连续21天的诱导分化后的天狼星红染色图(图中着色较深区域为染色阳性区域)；

图6：图6a为球体培养第7天后的tspcs球体转移至含有诱导培养基的正常粘附培养皿后，经过连续21天的诱导分化后的细胞外基质的扫描电镜图；图6b为球体培养第7天后的tspcs球体转移至含有诱导培养基的正常粘附培养皿后，经过连续21天的诱导分化后的细胞外基质的透射电镜图；图6c为球体培养第7天后的tspcs球体转移至含有诱导培养基的正常粘附培养皿后，经过连续21天的诱导分化后的单个细胞的透射电镜图。

具体实施方式

下面对本发明附图结合实施例作出进一步说明。

实施例1

获取6-8周龄大鼠achilles肌腱，充分切碎，使用胶原酶和分散酶消化后，使用dmem培养基重悬，置于5％co2浓度的37℃孵箱中培养，每隔2-3天更换新鲜培养基。待tspcs至80-90％融合后消化，并接种于低粘附培养皿当中，使用2％浓度的胎牛血清，加入30ng/ml生长因子bfgf以及30ng/mlegf等，不换液，每隔2-3天轻柔添加原始体积1/10的新鲜培养基，结果显示：

(1)球体培养第3天，光镜下观察，可看到tspcs开始逐渐聚集成群，见图1a；

(2)球体培养第7天，光镜下观察，可看到tspcs最终形成类似圆形的球体，细胞之间紧密连接，见图1b；

以上结果表明：本发明中提供的培养环境可以在体外形成tspcs球体。

作为本发明的具体实施方式，置于一定浓度co2的恒温孵箱中培养，co2浓度为3％的36.5℃孵箱中培养，或co2浓度为5.5％的36℃孵箱中培养，获得结果和结论与上述实施例中结果和结论是一致的。

作为本发明的具体实施方式，接种于低粘附培养皿当中，当使用1％低浓度的胎牛血清、10ng/mlbfgf以及40ng/mlegf生长因子的培养皿，或使用3％低浓度的胎牛血清、20ng/mlbfgf以及36ng/mlegf生长因子的培养皿，进行上述实验过程时，获得结果和结论与上述实施例中结果和结论是一致的，进一步证明本发明中提供的培养环境可以在体外形成tspcs球体。

实施例2

为了验证形成的tspcs球体具备良好干细胞干性，我们通过sox2、oct4、cd146免疫荧光染色实验进行验证。

进行以下处理：

在球体培养环境下连续培养7天后，轻柔去除培养基，加入4％多聚甲醛溶液固定球体，进行sox2-cd146以及oct4-cd146免疫荧光染色。

结果显示：体外三维球体培养的tspcs球体很好表达干细胞干性基因cd146和sox2(见图2a)以及cd146和oct4(见图2b)。

结论

实验证明：体外使用periostin重组蛋白可以明显促进tspcs的自我更新能力，见图2a。

实施例3

验证球体培养7天后的tspcs球体转移至含有诱导培养基的正常粘附培养皿后经过连续14天的诱导分化后成功分化为组织特异性的肌腱细胞，我们通过scx、col1、f-actin免疫荧光染色实验进行验证。

进行以下处理：

球体培养7天后，将球体连同培养基转移至离心管中，通过差异性梯度离心的方法去除散在的单个细胞，去除废弃的培养基，轻柔加入新鲜诱导培养基(含有浓度5ng/mltgf-β、浓度为20ng/mlgdf5、地塞米松浓度为50μm、维生素c浓度为0.5μm、胰岛素浓度为10μm)，转移至铺有matrigel的正常粘附培养皿当中，，每2-3天更换新鲜的诱导培养基，在连续诱导培养14天后，进行scx、col1、f-actin的免疫荧光染色。

结果显示：

(1)球体经过连续14天的诱导培养后，逐渐形成有序排列的结构，并较大比例阳性表达肌腱特异性基因scx，见图3a；

(2)球体经过连续14天的诱导培养后，逐渐形成分泌出细胞外基质i型胶原(col1)并呈现有序的结构，细胞骨架f-actin染色显示细胞有序平行延伸，见图3b。

结论：

通过免疫荧光染色显示，tspcs球体在本发明中特定的诱导条件诱导后形成有序的肌腱细胞排列结构，并表达肌腱特异性基因scx、col1。

作为本发明的具体实施方式，新鲜诱导培养基选择包括tgf-β1的浓度为20ng/ml，gdf5的浓度为5ng/ml，维生素c浓度为0.2μm，地塞米松的浓度为35μm，胰岛浓度为15μm，或者新鲜诱导培养基选择包括tgf-β1的浓度为15ng/ml，gdf5的浓度为10ng/ml，维生素c浓度为0.8μm，地塞米松的浓度为65μm，胰岛浓度为7μm，进行上述实验过程时，获得结果和结论与上述实施例中结果和结论是一致的，进一步证明tspcs球体在本发明中特定的诱导条件诱导后形成有序的肌腱细胞排列结构，并表达肌腱特异性基因scx、col1。

实施例4

验证球体培养7天后的tspcs球体转移至含有诱导培养基的正常粘附培养皿后经过连续21天的诱导分化后成功分化为组织特异性肌腱细胞，我们通过tnmd、tnc、ki67免疫荧光染色实验进行验证。

进行以下处理：

球体培养7天后，将球体连同培养基转移至离心管中，通过差异性梯度离心的方法去除散在的单个细胞，去除废弃的培养基，轻柔加入新鲜诱导培养基(tgf-β1的浓度为20ng/ml，gdf5的浓度为5ng/ml，维生素c浓度为0.2μm，地塞米松的浓度为35μm，胰岛浓度为15μm)，转移至铺有matrigel的正常粘附培养皿当中，，每2-3天更换新鲜的诱导培养基，在连续诱导培养21天后，进行tnmd、tnc、ki67的免疫荧光染色。

结果显示：

(1)球体经过连续21天的诱导培养后，进一步形成有序排列的结构，并较大比例阳性表达肌腱分泌性蛋白tnmd,见图4a；

(2)球体经过连续21天的诱导培养后，逐渐形成分泌出细胞外基质tnc并呈现有序的结构，部分细胞表达增殖相关基因ki67,表明分化细胞的肌腱细胞保持较好的增殖能力，见图4b；

结论：

通过免疫荧光染色显示，tspcs球体在本发明中特定的诱导条件诱导后形成有序的肌腱细胞排列结构，并表达肌腱特异性基因tnmd、tnc以及增殖相关基因ki67。

作为本发明的具体实施方式，新鲜诱导培养基选择含有浓度5ng/mltgf-β、浓度为20ng/mlgdf5、地塞米松浓度为50μm、维生素c浓度为0.5μm、胰岛素浓度为10μm，或者新鲜诱导培养基选择包括tgf-β1的浓度为15ng/ml，gdf5的浓度为10ng/ml，维生素c浓度为0.8μm，地塞米松的浓度为65μm，胰岛浓度为7μm，进行上述实验过程时，获得结果和结论与上述实施例中结果和结论是一致的，进一步证明tspcs球体在本发明中特定的诱导条件诱导后形成有序的肌腱细胞排列结构，并表达肌腱特异性基因tnmd、tnc以及增殖相关基因ki67。

实施例5

为了验证验证球体培养7天后的tspcs球体转移至含有诱导培养基的正常粘附培养皿后，经过连续21天的诱导分化后成功在体外形成类似的肌腱组织结构，我们通过he和天狼星红组织学染色实验进行验证。

进行以下处理：

球体培养7天后，将球体连同培养基转移至离心管中，通过差异性梯度离心的方法去除散在的单个细胞，去除废弃的培养基，轻柔加入新鲜诱导培养基(包括tgf-β1的浓度为15ng/ml，gdf5的浓度为10ng/ml，维生素c浓度为0.8μm，地塞米松的浓度为65μm，胰岛浓度为7μm)，转移至铺有matrigel的正常粘附培养皿当中，，每2-3天更换新鲜的诱导培养基，在连续诱导培养21天后，进行he和天狼星红组织学染色。

结果显示：

(1)光学显微镜下显示经过连续21天诱导后，逐渐形成平行有序的类肌腱组织结构，见图5a。

(2)he染色和天狼星红染色显示细胞有序排列延伸，见图5b。

结论：

通过he染色和天狼星红染色，进一步证明tspcs球体在本发明中特定的诱导条件诱导后形成有序的肌腱细胞排列的组学结构。

作为本发明的具体实施方式，新鲜诱导培养基选择含有浓度5ng/mltgf-β、浓度为20ng/mlgdf5、地塞米松浓度为50μm、维生素c浓度为0.5μm、胰岛素浓度为10μm，或者新鲜诱导培养基选择包括含有浓度5ng/mltgf-β、浓度为20ng/mlgdf5、地塞米松浓度为50μm、维生素c浓度为0.5μm、胰岛素浓度为10μm，进行上述实验过程时，获得结果和结论与上述实施例中结果和结论是一致的，进一步证明tspcs球体在本发明中特定的诱导条件诱导后形成有序的肌腱细胞排列的组学结构。

实施例6

为了验证验证球体培养7天后的tspcs球体转移至含有诱导培养基的正常粘附培养皿后经过连续21天的诱导分化后在体外形成类似的肌腱组织结构在微观结构，包括细胞形态以及胶原纤维排列都类肌腱组织结构，我们通过扫描电镜和透射电镜实验进行验证。

进行以下处理：

球体培养7天后，将球体连同培养基转移至离心管中，通过差异性梯度离心的方法去除散在的单个细胞，去除废弃的培养基，轻柔加入新鲜诱导培养基(含有浓度5ng/mltgf-β、浓度为20ng/mlgdf5、地塞米松浓度为50μm、维生素c浓度为0.5μm、胰岛素浓度为10μm)，转移至铺有matrigel的正常粘附培养皿当中，每2-3天更换新鲜的诱导培养基，在连续诱导培养21天后，进行扫描电镜和透射电镜检测。

结果显示：

(1)扫描电镜和透射电镜下，诱导分化后分泌的细胞外胶原纤维呈现平行有序排列的结构，很好模拟了肌腱组织胶原纤维结构，见图6a、6b；

(2)透射电镜下诱导分化后的肌腱细胞的细胞核呈现长梭形延伸。见图6c；

结论：

通过扫描电镜和透射电镜实验，进一步证明tspcs球体在本发明中特定的诱导条件诱导后在微观结构上形成有序的细胞外胶原纤维，并且分化的细胞呈现典型的长梭形。

作为本发明的具体实施方式，新鲜诱导培养基选择包括tgf-β1的浓度为20ng/ml，gdf5的浓度为5ng/ml，维生素c浓度为0.2μm，地塞米松的浓度为35μm，胰岛浓度为15μm，或者新鲜诱导培养基选择包括tgf-β1的浓度为15ng/ml，gdf5的浓度为10ng/ml，维生素c浓度为0.8μm，地塞米松的浓度为65μm，胰岛浓度为7μm，进行上述实验过程时，获得结果和结论与上述实施例中结果和结论是一致的，进一步证明tspcs球体在本发明中特定的诱导条件诱导后在微观结构上形成有序的细胞外胶原纤维，并且分化的细胞呈现典型的长梭形。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。