长片段捕获测序探针组的制备方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体而言，涉及一种长片段捕获测序探针组的制备方法。

背景技术：

人类基因组大小接近3g，包含约2万个蛋白质编码基因。全基因组测序需要耗费大量的成本和时间，目标序列捕获测序成为当前基因组学研究中的一个热点技术。当只对目标序列进行测序时，在相同成本下，研究者可以测到更多的样本数量和更深的深度。特别对于一些稀有的变异或者部分体细胞的基因突变，测序深度决定了目标序列捕获测序是一种有效的工具。

目标序列捕获测序，是将感兴趣的目标基因组区域定制成特异性探针与基因组dna进行杂交，将目标基因组区域的dna片段进行富集后再进行测序。

基于液相杂交探针捕获的靶标富集是利用与目标区域互补设计的几千到上百万条寡核苷酸捕获探针将目标区域抓取下来后再进行测序，其特点是探针设计灵活、通量高、捕获区域可大可小、可以检测融合基因；缺点是探针合成的成本相对较高、特别是针对大的panel。因而如果能够降低panel中探针的数目，将有效促进长片段序列测定方法推广与应用。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种经济的、有效的、降低探针数目的长片段捕获测序方法。

本发明涉及一种长片段捕获测序探针组的制备方法，包括：

a)使用如下公式计算获取探针平均间隔范围：

n＝(l+2)×p±3×p；

其中：

n：探针平均间隔，单位bp；

p：每条探针平均长度，单位bp；

l：基因组片段化平均长度单位kb，取整数；

b)根据所述探针平均间隔范围制备用于检测靶区域的探针组。

使用该方法设计探针，具有全面、快速、准确、性价比高的优点，解决了捕获测序探针密集、合成成本高的问题。

根据本发明的另一方面，本发明还涉及如上所述的方法在三代测序中的应用。

根据本发明的另一方面，本发明还涉及通过如上所述的方法制备得到的探针组，或包括所述探针组的试剂盒，以及所述探针组或试剂盒的应用。

本发明所提供的方法制备的探针组能够检测目的基因各种突变信息，同时适用于肌肉、血液和羊水等多种组织样本的检测。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一个实施例中基因组片段化平均长度为5kb的捕获dna片段的0.5×的平均覆盖深度；

图2为本发明一个实施例中基因组片段化平均长度为2kb的捕获dna片段的0.5×的平均覆盖深度；

图3为本发明一个实施例中基因组片段化平均长度为8kb的捕获dna片段的0.5×的平均覆盖深度；

图4为本发明一个实施例中探针添加量与捕获中靶率关系曲线。

具体实施方式

本发明涉及一种长片段捕获测序探针组的制备方法，包括：

a)使用如下公式计算获取探针平均间隔范围：

n＝(l+2)×p±3×p；

其中：

n：探针平均间隔，单位bp；

p：每条探针平均长度，单位bp；

l：基因组片段化平均长度单位kb，取整数；

b)根据所述探针平均间隔范围制备用于检测靶区域的探针组。

基因组的“靶区域”(及其任何语法等同物)是指全基因组或通过本文所述的一种或多种方法鉴定为目标和/或所选的基因组的任何一个或多个区域。通过本文描述的方法和系统测序的基因组的靶区域包括但不限于内含子、外显子、基因间区或其任意组合。在某些实例中，本文所述的方法和系统提供关于全外显子组、外显子的一部分、一个或多个选定基因(包括选定的基因的组)、一个或多个内含子以及内含子序列和外显子序列的组合的序列信息。

基因组的靶区域还可以包括基因组的某些部分或百分比而不是由序列鉴定的区域。在某些实施方案中，根据本文所述的方法捕获和分析的基因组的靶区域包括位于基因组的每1、2、5、10、15、20、25、50、100、200、250、500、750、1000或10000kb处的基因组部分。在另一些实施方案中，基因组的靶区域包含全基因组的5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％。在另一些实施方案中，靶区域包含全基因组的1-10％、5-20％、10-30％、15-40％、20-50％、25-60％、30-70％、35-80％、40-90％或45-95％。此外，靶区域可以是连续的，也可以是间断的。

在一些实施方式中，所述p的取值范围为15～250bp；例如15bp、20bp、30bp、40bp、50bp、60bp、70bp、80bp、90bp、100bp、110bp、120bp、130bp、140bp、150bp、160bp、170bp、180bp、190bp、200bp、210bp、220bp、230bp、240bp、250bp，或上述数值组成的范围值。

在一些实施方式中，所述探针用于检测的靶区域长度不低于1kb，可选1.5kb、2kb、2.5kb、3kb、4kb、5kb、10kb、15kb、20kb、30kb、40kb、50kb、100kb、150kb、200kb、300kb、400kb、500kb、600kb、700kb、800kb、900kb、1mb、2mb、3mb、4mb、5mb、10mb、15mb、20mb或更多。

探针组中探针应当是与靶区域中的相应区域是互补配对的。本发明所述“互补配对”是指所述探针能够在严格条件下与所期望的相应位点杂交。本发明中使用的严格条件是公知的，包括诸如在含400mmnacl、40mmpipes(ph6.4)和1mmedta的杂交液中于65℃杂交12～16小时，然后在65℃下用含0.1％sds、和0.1％ssc的洗涤液洗涤15～60分钟。这对于本领域技术人员来说是熟悉的。

在一些实施方式中，所述l的取值为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

在一些实施方式中，所述靶区域的种属来源可以选择动物，包括人类及所有畜养(如家畜和宠物)和野生的动物及禽鸟，其非限制性地包括牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡等，其中优选哺乳动物，优选灵长类动物，最优选为人。

在一些实施方式中，所述方法还包括将所述探针组分组，所述分组选自下列分组中的至少一组：

(1)捕获所述靶区域全长的探针；

(2)仅捕获所述靶区域的外显子区域的探针；

(3)仅捕获高突变率区域的探针。

在一些实施方式中，所述方法还包括将所述探针可与固相所结合的标记偶联，所述标记可选自链霉亲和素、生物素、抗生物素蛋白、抗体、化学偶联剂中的一种或多种，优选生物素。

在本发明中：“靶区域”或者“基因”的理解包括但不仅限于(优选人的)dystrophin基因、tsc1基因、tsc2基因、brac1基因、brac2基因、gjb2基因、12srrna基因或slc26a4基因中的任一种。

本发明还涉及如上所述的方法在三代测序中的应用。

在一些实施方式中，所述三代测序采用pacbiosequel、promethion、minion或gridion平台进行。

本发明还涉及探针组，其通过如上所述的方法制备得到；

在一些具体的实施方式中，所述探针组用于检测tsc(tuberoussclerosiscomplex)基因，在本申请中，若无特别说明，则tsc基因用于指代tsc1基因和/或tsc2基因。

在一些具体的实施方式中，所述探针组包括与下述染色体区域互补配对的探针(以下简称tsc探针组)：

chr9:135813137-135813237,chr9:135789857-135789957,chr9:135768617-135768717,chr9:135768977-135769077,chr9:135769457-135769557,chr9:135769817-135769917,chr9:135770297-135770397,chr9:135770777-135770877,chr9:135771137-135771237,chr9:135771617-135771717,chr9:135772097-135772197,chr9:135772457-135772557,chr9:135772937-135773037,chr9:135758177-135758277,chr9:135773777-135773877,chr9:135774257-135774357,chr9:135774617-135774717,chr9:135775097-135775197,chr9:135775577-135775677,chr9:135775937-135776037,chr9:135776417-135776517,chr9:135776897-135776997,chr9:135777257-135777357,chr9:135777737-135777837,chr9:135758657-135758757,chr9:135778577-135778677,chr9:135779057-135779157,chr9:135779417-135779517,chr9:135779897-135779997,chr9:135780377-135780477,chr9:135780617-135780717,chr9:135781097-135781197,chr9:135781577-135781677,chr9:135781937-135782037,chr9:135782417-135782517,chr9:135783737-135783837,chr9:135759257-135759357,chr9:135784577-135784677,chr9:135785057-135785157,chr9:135785897-135785997,chr9:135786377-135786477,chr9:135786737-135786837,chr9:135787217-135787317,chr9:135787697-135787797,chr9:135788057-135788157,chr9:135759737-135759837,chr9:135790217-135790317,chr9:135790697-135790797,chr9:135791177-135791277,chr9:135791537-135791637,chr9:135792017-135792117,chr9:135792497-135792597,chr9:135793217-135793317,chr9:135793697-135793797,chr9:135794057-135794157,chr9:135794537-135794637,chr9:135795377-135795477,chr9:135795857-135795957,chr9:135796217-135796317,chr9:135796697-135796797,chr9:135797177-135797277,chr9:135797537-135797637,chr9:135798017-135798117,chr9:135798497-135798597,chr9:135798857-135798957,chr9:135799337-135799437,chr9:135800177-135800277,chr9:135800657-135800757,chr9:135801017-135801117,chr9:135801497-135801597,chr9:135801977-135802077,chr9:135802337-135802437,chr9:135802817-135802917,chr9:135803297-135803397,chr9:135803657-135803757,chr9:135804137-135804237,chr9:135804857-135804957,chr9:135805337-135805437,chr9:135761417-135761517,chr9:135806177-135806277,chr9:135806657-135806757,chr9:135807017-135807117,chr9:135807497-135807597,chr9:135807977-135808077,chr9:135808337-135808437,chr9:135808817-135808917,chr9:135809297-135809397,chr9:135809657-135809757,chr9:135810137-135810237,chr9:135761897-135761997,chr9:135810977-135811077,chr9:135811457-135811557,chr9:135811817-135811917,chr9:135812297-135812397,chr9:135813617-135813717,chr9:135814097-135814197,chr9:135814457-135814557,chr9:135814937-135815037,chr9:135815777-135815877,chr9:135816257-135816357,chr9:135816977-135817077,chr9:135817457-135817557,chr9:135817817-135817917,chr9:135818297-135818397,chr9:135818777-135818877,chr9:135819137-135819237,chr9:135819617-135819717,chr9:135820097-135820197,chr9:135820457-135820557,chr9:135820937-135821037,chr9:135762977-135763077,chr9:135821777-135821877,chr9:135822257-135822357,chr9:135822617-135822717,chr9:135823577-135823677,chr9:135823937-135824037,chr9:135824417-135824517,chr9:135824897-135824997,chr9:135825737-135825837,chr9:135763457-135763557,chr9:135826577-135826677,chr9:135827057-135827157,chr9:135828377-135828477,chr9:135828617-135828717,chr9:135765137-135765237,chr9:135765617-135765717,chr9:135766097-135766197,chr9:135766457-135766557,chr9:135766937-135767037,chr9:135757577-135757677,chr9:135767777-135767877,chr9:135768257-135768357,chr16:2144932-2145032,chr16:2088172-2088272,chr16:2117692-2117792,chr16:2102452-2102552,chr16:2107732-2107832,chr16:2147572-2147672,chr16:2147812-2147912,chr16:2091412-2091512,chr16:2116732-2116832,chr16:2099812-2099912,chr16:2100292-2100392,chr16:2101612-2101712,chr16:2102092-2102192,chr16:2102932-2103032,chr16:2089252-2089352,chr16:2103772-2103872,chr16:2104252-2104352,chr16:2104612-2104712,chr16:2105092-2105192,chr16:2105932-2106032,chr16:2106412-2106512,chr16:2106892-2106992,chr16:2107252-2107352,chr16:2089732-2089832,chr16:2108572-2108672,chr16:2110372-2110472,chr16:2110732-2110832,chr16:2111212-2111312,chr16:2111692-2111792,chr16:2111932-2112032,chr16:2112412-2112512,chr16:2112892-2112992,chr16:2113252-2113352,chr16:2113732-2113832,chr16:2090332-2090432,chr16:2114572-2114672,chr16:2115412-2115512,chr16:2115892-2115992,chr16:2116372-2116472,chr16:2117212-2117312,chr16:2118532-2118632,chr16:2090812-2090912,chr16:2120212-2120312,chr16:2120692-2120792,chr16:2121172-2121272,chr16:2121532-2121632,chr16:2122012-2122112,chr16:2122492-2122592,chr16:2122852-2122952,chr16:2123332-2123432,chr16:2091292-2091392,chr16:2124052-2124152,chr16:2124532-2124632,chr16:2125852-2125952,chr16:2126212-2126312,chr16:2126692-2126792,chr16:2127172-2127272,chr16:2127532-2127632,chr16:2128012-2128112,chr16:2128492-2128592,chr16:2128852-2128952,chr16:2129332-2129432,chr16:2130172-2130272,chr16:2131012-2131112,chr16:2131492-2131592,chr16:2131972-2132072,chr16:2132332-2132432,chr16:2132812-2132912,chr16:2133292-2133392,chr16:2133652-2133752,chr16:2134132-2134232,chr16:2092372-2092472,chr16:2134972-2135072,chr16:2135452-2135552,chr16:2136172-2136272,chr16:2136652-2136752,chr16:2137012-2137112,chr16:2137492-2137592,chr16:2137972-2138072,chr16:2138332-2138432,chr16:2138812-2138912,chr16:2139292-2139392,chr16:2139652-2139752,chr16:2140132-2140232,chr16:2092972-2093072,chr16:2140972-2141072,chr16:2141452-2141552,chr16:2141812-2141912,chr16:2142292-2142392,chr16:2142772-2142872,chr16:2143132-2143232,chr16:2143612-2143712,chr16:2144092-2144192,chr16:2144452-2144552,chr16:2093452-2093552,chr16:2145772-2145872,chr16:2146252-2146352,chr16:2147092-2147192,chr16:2093812-2093912,chr16:2094292-2094392,chr16:2094772-2094872,chr16:2096092-2096192,chr16:2096452-2096552,chr16:2096932-2097032,chr16:2088652-2088752,chr16:2097772-2097872,chr16:2098252-2098352,chr16:2098612-2098712

其中，所述染色体区域为人tsc1和tsc2基因上的区域，其参考序列为人类参考基因组版本dec.2013(grch38/hg38)(tsc1:chr9:132891348-132944633和tsc2:chr16:2047895-2088720)。

本发明还涉及用于基因检测的试剂盒，包括如上所述的探针组。

在一些实施方式中，所述试剂盒还包括上述内容中所定义的固相载体、接头序列、用于与所述接头序列结合并扩增核酸片段的引物、dna提取体系、pcr反应缓冲液、无核酸酶的水、dna聚合酶、分子量marker、靶序列洗脱液、末端修复酶、末端修复缓冲液、dna连接酶中的一种或多种。

在一些实施方式中，所述探针组中的探针还包含可与固相所结合的标记；在一些实施方式中，所述标记可选自生物素、链霉亲和素、抗生物素蛋白、抗体、化学偶联剂；以及本领域中已知的用于亲和纯化的任何生物的、化学的、物理的或酶促的试剂。

“化学偶联剂”指能够与另一化学基团反应以形成共价键的基团，即在合适的反应条件下共价反应的基团。一般可以选择亲核基团、亲电子基团和光激活基团。示例性的化学偶联剂包括但不限于下列基团，烯烃、乙炔、醇、酸、醚、氧化物、卤化物、醛、酮、羧酸、酯、酰胺、氰酸盐/酯、异氰酸盐/酯、硫氰酸盐/酯、异硫氰酸盐/酯、胺、肼、腙、酰肼、重氮、重盐、硝石(nitre)、腈、硫醇、硫化物、二硫化物、亚砜、砜、磺酸、硫酸、缩醛、缩酮、酐、硫酸盐/酯、次磺酸异腈、脒、二酰亚胺、亚氨酸盐/酯、硝酮、羟胺、肟、异羟肟酸、硫代异羟肟酸、丙二烯、原酸酯、亚硫酸盐/酯、烯胺、炔胺、脲、假脲、氨基脲、碳二亚胺、氨基甲酸盐/酯、亚胺、叠氮化物、偶氮化合物、氧化偶氮化合物和亚硝基化合物。化学偶联剂的反应性官能团还包括用于制备生物缀合物的那些，例如n-羟基琥珀酰亚胺酯、马来酰亚胺等。制备这些官能团中的每一种的方法在本领域中是公知的并且其出于特定目的的应用或改变在本领域技术人员的能力范围之内(参见，例如，sandier和karo，编辑，organicfunctionalgrouppreparations.academicpress，sandiego，1989)。

所述探针可以与三代测序联用以达到更好的技术效果。

本发明还涉及基因测序方法，其包括以下步骤：

a)将待检测样品中的基因组dna打断为核酸片段并扩增构建dna文库；

b)使用如上所述的探针组在所述dna文库中捕获能够与所述探针组特异性结合的靶序列；

c)对所述靶序列进行测序。

在一些实施方式中，当n＝7p时，所述探针组中探针的添加量≥0.3pmol，例如0.3pmol～0.8pmol。

在一些实施方式中，所述待检测样品为体液、组织或组织裂解液；体液可以选择例如血液(全血)、血清、血浆、细胞培养上清、唾液、精液、组织或组织裂解液；组织可以选择例如羊水、绒毛、骨骼、肌肉或毛发等。

在一些实施方式中，所述构建dna文库的方法包括：

将所述核酸片段进行末端修复后连接接头序列，以所述接头序列为模板设计引物进行pcr扩增。

在一些实施方式中，所述捕获发生在固相载体上；

所述固相载体优选为富集颗粒，所述富集颗粒包被有生物素或亲和素；优选为亲和素，而其所捕获的对象为生物素。

在优选的实施例中，“固相载体”为“富集颗粒”；如本文所使用的，“富集颗粒”是指可以是各种形状的离散的小物体、例如球体(例如珠)、胶囊、多面体等。颗粒可以是宏观的或微观的，例如微粒或纳米颗粒。颗粒可以是非磁性或磁性的。磁性颗粒可以包含铁磁性物质，并且铁磁性物质可以是fe，ni，co，氧化铁等。

在一些实施方式中，对所述靶序列进行测序之前，先对所述靶序列进行扩增。

在一些实施方式中，所述扩增具体为pcr扩增。

在一些实施方式中，所述测序为三代测序；

在一些实施方式中，所述三代测序采用pacbiosequel、promethion、minion、gridion平台进行。

更为优选的实施方式为磁珠。

根据本发明的一方面，本发明还涉及如上所述的探针或探针组合产品、或如上所述的试剂盒、或如上所述的方法在检测人基因(例如tsc基因)变异中的应用；

在一些实施方式中，所述人基因(例如tsc基因)变异包括插入、缺失、复制、倒位、易位、snp。

该应用包括诊断与非诊断目的，非诊断目的例如遗传学研究、人种分布、人类进化学等领域的研究中进行应用(典型的如snp的应用)，或者可以是tsc基因相关疾病的细胞和动物模型(如果同源性与人很高)的鉴定。

根据本发明的一方面，本发明还涉及如上所述的探针组、或如上所述的试剂盒在制备人结节性硬化症的诊断剂中的应用。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

dystrophin基因(简称dmd基因)是人类最大的基因之一，位于xp21，长度约2.3mb。该基因编码区包括79个外显子及7个组织特异性的启动子，其mrna序列长14kb。dystrophin基因最多见的突变是基因内部一个或多个外显子的缺失，占总突变类型的65％。而重复型突变的发生率因检测手段敏感性不同为5％～15％。其余的突变则为点突变或微缺失，通常导致无义突变和移码突变。在dystrophin基因的突变中，约有30％是新发突变，而非遗传所致。其中，导致该基因所编码的抗肌萎缩蛋白缺陷的突变，会引发常见的神经肌肉病抗肌萎缩蛋白病(dystrophinopathy)。该病根据发病年龄、有无肌肉假性肥大、病程及预后等，分为duchenne型肌营养不良症(dmd)和becker型肌营养不良症(bmd)。

对dmd基因使用本发明的方法确定探针平均间隔范围，将基因组片段化平均长度l设定为5kb、每条探针平均长度p设定为120bp，代入公式n＝(l+2)×p±3×p计算探针平均间隔n的范围为480至1200bp。在该范围内选定1000bp为探针平均间隔。设计时，需同时保证探针gc含量值适中、无发夹结构；并进一步与ncbi等数据库进行blast比对，确保探针避开基因组上的重复区域，以确保探针的特异性。最终确定的探针序列为“dystrophin探针分组”信息中所示。

dystrophin探针分组情况如下：

组i：

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组ii：

chrx:31139471-31139591,chrx:31140475-31140595,chrx:31144475-31144595,chrx:31152501-31152621,chrx:31164474-31164594,chrx:31165472-31165592,chrx:31187475-31187595,chrx:31190600-31190720,chrx:31191470-31191590,chrx:31195475-31195595,chrx:31196665-31196785,chrx:31198475-31198595,chrx:31200475-31200595,chrx:31222424-31222544,chrx:31224664-31224784,chrx:31227475-31227595,chrx:31241464-31241584,chrx:31279439-31279559,chrx:31284475-31284595,chrx:31341389-31341509,chrx:31366615-31366735,chrx:31462541-31462661,chrx:31496444-31496564,chrx:31497425-31497545,chrx:31514499-31514619,chrx:31525475-31525595,chrx:31526475-31526595,chrx:31645497-31645617,chrx:31676453-31676573,chrx:31697475-31697595,chrx:31747433-31747553,chrx:31792530-31792650,chrx:31838515-31838635,chrx:31854489-31854609,chrx:31893384-31893504,chrx:31947527-31947647,chrx:31950484-31950604,chrx:31986475-31986595,chrx:32173475-32173595,chrx:32234629-32234749,chrx:32305613-32305733,chrx:32328289-32328409,chrx:32360417-32360537,chrx:32361314-32361434,chrx:32364410-32364530,chrx:32366521-32366641,chrx:32380562-32380682,chrx:32382475-32382595,chrx:32383642-32383762,chrx:32398600-32398720,chrx:32404459-32404579,chrx:32407540-32407660,chrx:32408363-32408483,chrx:32429493-32429613,chrx:32430393-32430513,chrx:32456417-32456537,chrx:32459498-32459618,chrx:32466496-32466616,chrx:32472449-32472569,chrx:32481475-32481595,chrx:32482475-32482595,chrx:32486585-32486705,chrx:32490356-32490476,chrx:32503475-32503595,chrx:32509475-32509595,chrx:32519584-32519704,chrx:32536576-32536696,chrx:32563461-32563581,chrx:32583475-32583595,chrx:32591548-32591668,chrx:32592587-32592707,chrx:32601531-32601651,chrx:32613409-32613529,chrx:32632444-32632564,chrx:32659367-32659487,chrx:32662386-32662506,chrx:32663657-32663777,chrx:32716475-32716595,chrx:32717501-32717621,chrx:32827561-32827681,chrx:32834528-32834648,chrx:32841482-32841602,chrx:32862555-32862675,chrx:32868323-32868443,chrx:33038429-33038549,chrx:33146475-33146595,chrx:33229510-33229630,chrx:33357475-33357595；

组iii：

chrx:31645497-31645617,chrx:31676453-31676573,chrx:31697475-31697595,chrx:31747433-31747553,chrx:31792530-31792650,chrx:31838515-31838635,chrx:31854489-31854609,chrx:31893384-31893504,chrx:31947527-31947647,chrx:31950484-31950604,chrx:31986475-31986595,chrx:32519584-32519704,chrx:32536576-32536696,chrx:32563461-32563581,chrx:32583475-32583595,chrx:32591548-32591668,chrx:32592587-32592707,chrx:32601531-32601651,chrx:32613409-32613529,chrx:32632444-32632564,chrx:32659367-32659487,chrx:32662386-32662506,chrx:32663657-32663777,chrx:32716475-32716595,chrx:32717501-32717621,chrx:32827561-32827681,chrx:32834528-32834648,chrx:32841482-32841602,chrx:32862555-32862675,chrx:32868323-32868443,chrx:33038429-33038549,chrx:33146475-33146595,chrx:33229510-33229630。

其中，所述染色体区域为人dystrophin基因(或称dmd基因)上的区域，其参考序列为人类参考基因组版本hg19(chrx:31137344-33357726)。

1.样品基因组dna提取及质量评估

取待检测样品外周血0.5～1ml，采用bloodgenomicdnaminikit(北京康为世纪生物科技有限公司，外周血)进行基因组dna提取。通过琼脂糖凝胶电泳检测基因组的完整性，用qubit(lifetechnologies，美国)对基因组进行浓度测定。选取基因组相对完整且浓度≥25ng/μl的dna样品进行文库构建。

2.捕获文库的构建

2.1基因组dna打断

使用covarise220非接触式超声破碎仪打断基因组dna，根据基因组片段化平均长度5k设定参数，具体如下：duration600sec、peakincidentpower3瓦、dutyfactor20％、cyclesperburst1000。

使用0.6倍体积的ampurepb磁珠进行纯化，制得片段化基因组dna。

2.2样本末端修复、加接头

2.2.1末端修复，加“a”

使用nebnextultraendrepair/da-tailingmodule试剂盒。

体系如下表1所示：

表1

反应条件如下表2所示：

表2

2.2.2接头连接

使用nebnextultraiiligationmodule试剂盒。

体系如下表3所示：

表3

于pcr仪中，20℃反应15min。随后，使用0.6倍体积的ampurexp磁珠进行纯化，获得文库溶液。

其中，接头由a序列与b序列组合成，a序列为：

5'-pgatcggaagagcacacgtctgaactnnnnnnnnnnagggacgtgcgccatagaag-3'(seqidno:1)；其中n为a、c、t或g中的任意一种；

b序列为：

5'-cttccagaagaggccatagcagatnnnnnnnnnnnnnnnnagttcagacgtgtgctcttccgatct/3spc3/-3'(seqidno:2)；其中n为a、c、t或g中的任意一种；上述序列中的p代表磷酸化修饰；n代表a/g/c/t四种碱基的任意一种；/3spc3/代表硫代磷酸键修饰；a序列nnnnnnnnnn及b序列nnnnnnnnnnnnnnnn用于识别不同样品构建的文库。

2.3文库的预扩增，反应体系如下表4所示：

表4

其中，primer即为文库预扩增的引物，具体为：

primerf：5'-cttctatggcgcacgtccct-3'(seqidno:5)，

primer-r：5'-cttccagaagaggccatagca-3'(seqidno:6)。

反应条件如下表5所示：

表5

使用0.6倍体积的ampurexp磁珠回收pcr产物。

2.4杂交捕获靶序列

2.4.1捕获准备

将需要进行捕获的样品等量混合，dna总量为1μg。

加入4μlindex封闭试剂(indexablock、indexbblock)，其目的在于分别封闭文库构建中用到的接头a序列和b序列，防止文库上的这两个接头序列和探针杂交。其序列如下：

indexablock序列为：

5'-cttctatggcgcacgtccctnnnnnnnnnnagttcagacgtgtgctcttccgatc–3'(seqidno:3)；其中n为a、c、t或g中的任意一种；

indexbblock序列为：

5'-agatcggaagagcacacgtctgaactnnnnnnnnnnnnnnnnatctgctatggcctcttctggaag–3'(seqidno:4)；其中n为a、c、t或g中的任意一种。

上述序列中n代表a/g/c/t四种碱基的任意一种，其中,indexablock与接头a序列反向互补；indexbblock与接头b序列反向互补。

震荡混匀，然后，开盖60℃真空浓缩至蒸干。

2.4.2捕获

按照试剂盒xgenlockdownreagentkit(idt,货号：1072281)的使用说明配制杂交buffer，具体体系为下表6所示：

表6

将上述杂交buffer加入蒸干的样品中，震荡混匀，短暂离心，于pcr仪上95℃，10min。

反应结束后，离心，将13μl样品全部转移至含有体积4μl、浓度0.75pmol/ul的捕获探针的pcr管中，用移液器吹吸混匀。于pcr仪上65℃，16小时。

2.5杂交洗脱

2.5.1按照试剂盒xgenlockdownreagentkit(idt,货号：1072281)的使用说明配制洗脱试剂如下表7所示：

表7

2.5.2捕获磁珠处理

a)吸取50μlm280磁珠至离心管中，将离心管置于磁力架上待上清完全澄清，弃上清。

b)加入200μl1×beadwashbuffer(vial7)，混匀，离心，置于磁力架上待上清完全澄清，弃上清。

c)重复步骤b一次。

d)加入100μl1×beadwashbuffer(vial7)，混匀，转移至pcr管中，置于磁力架上待上清完全澄清，弃上清。

2.5.3磁珠和目标文库的结合

将17μl杂交体系加入到有磁珠的pcr管中，上下缓慢吹吸混匀，于pcr仪上65℃孵育45min。

2.5.4洗脱

a)加入100μl65℃1×washbufferi(vial1)，混匀。置于磁力架上，待上清完全澄清，弃上清。

b)加入200μl65℃1×stringentwashbuffer(vial4)，混匀转移到预热的大离心管中。置于温育仪上，65℃5min。置于磁力架上，待上清完全澄清，弃上清。

c)加入200μl常温1×washbufferi(vial1)，混匀。置于磁力架上，待上清完全澄清，弃上清。

d)加入200μl常温1×washbufferii(vial2)，混匀1。置于磁力架上，待上清完全澄清，弃上清。

e)加入200μl常温1×washbufferiii(vial3)，混匀。置于磁力架上，待上清完全澄清，弃上清.

f)短暂离心，使用10μl吸头移去少量剩余液体。

g)使用25μlnuclease-freewater悬浮磁珠于-20℃保存。

2.6杂交文库扩增

上一步得到的m280磁珠探针混悬液，取25μl/文库按照下表8在200mlpcr管中进行pcr扩增体系配制：

表8

上表所述primer与上文文库预扩增的引物一致：

primerf：5'-cttctatggcgcacgtccct-3'(seqidno:5)，

primer-r：5'-cttccagaagaggccatagca-3'(seqidno:6)。

pcr反应程序如下表9所示：

表9

反应结束后，使用0.6倍体积的ampurexp磁珠进行纯化，最后使用te溶液洗脱磁珠，转移至新的离心管内，进入下一步操作，或者放在-80℃中备用。

2.7文库质检

文库进行qbuit检测及agilent2100bioanalyzer检测，检测合格文库进行下一步三代测序文库构建。

3.三代测序文库构建及测序

3.1使用pacbiosequal测序

3.1.1使用建库试剂盒进行建库

3.1.1.1将混好的文库进行修复

修复溶液配制如下表10所示：

表10

混匀，离心，放入pcr热循环仪中，进行修复反应，具体条件如下表11：

表11

3.1.1.2纯化

使用0.45倍样品体积的pb磁珠进行纯化，最后使用双蒸水洗脱磁珠，-20℃冰箱保存。

3.1.1.3接头连接

连接溶液体系如下表12：

表12

混匀，离心，于pcr热循环仪中进行连接反应，具体条件如下表13：

表13

3.1.1.4纯化

使用0.45倍样品体积的pb磁珠进行纯化，最后使用双蒸水洗脱磁珠，-20℃冰箱保存。

3.1.2引物退火及binding反应

按照pacbio官方网页给出标准操作方式进行。

3.1.3三代测序

按照pacbiosequal仪器标准操作规范进行测序。

3.2使用oxfordnanoporepromethion测序

3.2.1样本末端修复

取dna，置于冰上，加入neb末端修复/加a尾试剂，混匀。20℃孵育40分钟，65℃孵育20分钟。

3.2.2dna纯化

将1×ampurebeads加入dna中，室温孵育15min，室温磁力架吸附5min，吸弃上清。

加入80％乙醇，磁力架吸附，弃上清，重复一次。室温晾干。

添加ultrapurewater，37℃下吹打洗脱。

磁力架上静置5min，吸取上清，即为纯化后的dna。

3.2.3接头连接

加入nebt4dna快速连接buffer、nebt4dna快速连接酶和接头，混匀，20℃孵育20min。

3.2.4dna纯化

同步骤3.2.2

3.2.5引物退火及loading反应

按照oxfordnanoporepromethion官方网页给出标准操作方式进行。

3.2.6三代测序

按照oxfordnanoporepromethion仪器标准操作规范进行测序。

生物信息学分析

4.1拆分各样品数据

若下机数据为多样品混测，根据各样品的标签序列拆分出每个样品的数据。

4.2数据过滤

根据各平台数据特点，生成高质量数据。

ont平台过滤掉质量值较低的数据。pacbio平台采用官方软件生成高质量的一致性序列。

4.3数据评估

将高质量的数据比对到人类全基因组参考序列，采取唯一比对(即单条序列只能唯一比对到基因组的一个位置)。

统计目标区域的序列数，评估捕获效率、目标区域覆盖深度、覆盖完整性。若数据不合格(合格的标准是：靶区域的测序覆盖度，要求30倍覆盖度不低于95％)，根据情况进行补测数据。

4.4变异检测

检测目标区域的单核苷酸位点变异、小片段插入与缺失、染色体结构变异(snv/indel、sv)等；并对变异进行各数据库的注释，以筛选致病性高的变异。

4.5变异的验证。

将筛选出的高致病性变异进行一代验证。

已有报道表明，二代测序捕获很难检测到患者样本中发现的许多致病变异，包括大的插入缺失(indel)、拷贝数变异、均聚物或结构变异。并且，二代测序除了探针合成成本高之外，使用不同平台不同流程，对于相同的复杂变异检测时，二代测序捕获检测结果并不一致，进一步说明二代测序捕获方法存在缺陷。mlpa仅可以检出dmd基因外显子缺失和重复，不能检测微小的缺失、重复及点突变，检出率约60％，存在明显漏检。尽管sanger测序可以检测点突变、倒位、异位、微小重复、缺失变异，但无法检测大片段重复；尤其是鉴于sanger测序通量低，为实现超长基因dmd的全基因测序，需要开展三千多个测序反应，成本高、工作量大。因此，临床上sanger测序仅作为对二代捕获测序结果发现突变的进一步精确验证手段。另外，需要注意的是，上述mlpa法、二代测序，对内含子区域均存在漏检。其中，微小重复是指重复区域小于20bp，大片段重复是指重复区域大于20bp。

对收集的多个样本，经观测临床表现、肌肉病例活检，对dmd的患病情况进行了确认。同时，对上述样本使用本发明所述的方法、mlpa、sanger测序、二代捕获测序、mlpa和二代捕获测序联合使用的方法进行了检测。该过程中，实验人员、数据分析人员均不知道样本的基因型及表现型，以确保结果的可信性。

对37个样本利用本发明所述技术方案进行检测，其结果如下表14所示。其中，“ex”表示外显子，“c.”表示cdna，“p.”表示蛋白质；“del”表示缺失型变异，“dup”表示重复型变异，“inv”表示倒位型变异，“tra”表示易位型变异；“het”表示为杂合子，“hemi”表示为半合子。

表14

9、21及32号样本未检出致病变异位点，所述样本为2个健康人标准样品及1例健康人样本，与实际情况吻合。28和37号样本，检出致病变异位点，但是二代测序结果显示未检出致病变异位点；进一步，使用一代测序对所述两个样本进行了验证，结果显示一代测序结果与本结果一致；同时经临床观察及肌肉病例活检，均为dmd典型表现。其他样本检出结果均与二代测序结果一致，均检出致病变异位点，且变异类型、位点均一致，且具有dmd的临床表现。此外，将检测出的dup及del变异类型的样本同时进行了mlpa实验验证，验证结果也全部吻合一致。结果显示：

1.本发明可以检出大片段重复、倒位、异位类型的结构变异；例如上述28、37号样本；

2.本发明的检出率高于其他技术手段；使用本发明所述方法实现了有临床表现的35份样本致病变异位点的全部检出；

3.本发明可以检出大量突变，为发现新的致病突变提供分子生物学依据。

实施例2

tscl和tsc2均为对细胞增殖与分化产生负调节作用的抑癌基因，其典型特征为累及除外周神经、骨骼肌和松果体外的其他所有系统和器官的良性肿瘤。tsc1和tsc2基因突变或缺失可导致结节性硬化症(tuberoussclerosiscomplex，tsc)又称bourneville病，是一种临床上较为常见的常染色体显性遗传性神经皮肤综合征。发病率相对较高，为1/10000-1/6000，60％-70％为散发性病例，无家族史可寻，表现出较高的自发突变率。男女发病之比2:1，无明显种族差异。目前研究发现由于tsc1和tsc2基因异常导致了其转录产物错构瘤蛋白和马铃薯蛋白功能的异常，从而影响了正常的细胞生成、分化和移行过程，病理上主要表现为细胞的形态、数量、位置以及结构排列异常而形成瘤样病变。tsc2突变占tsc患者的3/5，而tsc1突变占tsc患者的3/10，部分临床确诊患者检测不出突变，可能突变位于未检测的非编码区(utr)，或远离编码外显子的调控区域等。同时tsc1和tsc2突变表型间有一定差异：总的来说，tsc2变异的患者具有较重的临床表现，病人更多的累及肾脏及智能减退，并有更明显的大脑和面部损害。tsc2变异者肾囊肿出现的年龄较tsc1变异者早，囊肿的数量多、体积大。另外，所有具有多囊肾的tsc病人均有tsc2基因突变，tsc2基因距多囊肾基因(pkd1)仅60bp，基因分析发现，这些病人中90％为tsc2和相邻的pkd1基因的同时缺失，10％为tsc2和pkd1基因的其他类型突变，说明tsc2的缺失可影响临近基因，导致比邻性(contigous)基因缺失综合征。

对tsc1和tsc2使用本发明方法确定探针平均间隔范围，将基因组片段化平均长度l设定为5kb，每条探针平均长度p设为100bp，代入公式代入公式n＝(l+2)×p±3×p计算探针平均间隔n的范围为400bp-1000bp。在该范围内选定500bp为探针平均间隔。设计时，需同时保证探针gc含量值适中、无发夹结构；并进一步与ncbi等数据库进行blast比对，确保探针避开基因组上的重复区域，以确保探针的特异性。最终确定的探针序列为“tsc1和tsc2探针”信息中所示。

tsc1和tsc2探针情况如“tsc探针组”中所示。

1.样品基因组dna提取及质量评估

取待检测样品外周血0.5～1ml，采用bloodgenomicdnaminikit(北京康为世纪生物科技有限公司，外周血)进行基因组dna提取。通过琼脂糖凝胶电泳检测基因组的完整性，用qubit(lifetechnologies，美国)对基因组进行浓度测定。选取基因组相对完整且浓度≥25ng/μl的dna样品进行文库构建。

2.捕获文库的构建

2.1基因组dna打断

使用covarisg-tube(10)520079e220高速离心打断基因组dna，参数设置如下：genecompanylimited离心机1524，转速选择20000g，时间30s，质量1-1.5ug的gdna，体积100ul，重复上下各三次(打断4-6次)，制得片段化基因组dna.

2.2样本末端修复、加接头

2.2.1末端修复，加“a”

使用nebnextultraendrepair/da-tailingmodule试剂盒。

体系为表15所示：

表15

反应条件为表16所示：

表16

2.2.2接头连接

使用nebnextultraiiligationmodule试剂盒。

体系为表17所示：

表17

在pcr仪中反应第二步接头连接反应(或4℃过夜连接)条件如表18所示：

表18

随后，使用0.5倍体积的ampurexp磁珠进行纯化，获得文库溶液条件如表19所示。

2.3文库的预扩增，反应体系如表19所示：

表19

其中，primer即为文库预扩增的引物，具体为：

primerf：5'-cttctatggcgcacgtccct-3'(seqidno:5)，

primer-r：5'-cttccagaagaggccatagca-3'(seqidno:6)。

反应条件如下表20所示：

表20

使用0.5倍体积的ampurepb磁珠回收pcr产物。

2.4杂交捕获靶序列

2.4.1捕获准备

将需要进行捕获的样品等量混合，dna总量为1μg。

加入4μlindex封闭试剂(indexablock、indexbblock)，其目的在于分别封闭文库构建中用到的接头a序列和b序列，防止文库上的这两个接头序列和探针杂交。其序列如下：

indexablock序列为：

5'-cttctatggcgcacgtccctnnnnnnnnnnagttcagacgtgtgctcttccgatc–3'(seqidno:3)；

indexbblock序列为：

5'-agatcggaagagcacacgtctgaactnnnnnnnnnnnnnnnnatctgctatggcctcttctggaag–3'(seqidno:4)。

上述序列中n代表a/g/c/t四种碱基的任意一种，其中,indexablock与接头a序列反向互补；indexbblock与接头b序列反向互补。

震荡混匀，然后，开盖60℃真空浓缩至蒸干。

2.4.2捕获

按照试剂盒xgenlockdownreagentkit(idt,货号：1072281)的使用说明配制杂交buffer，具体体系如表21所示：

表21

将上述杂交buffer加入蒸干的样品中，震荡混匀，短暂离心，于pcr仪上95℃，10min。

反应结束后，离心，将13μl样品全部转移至含有4μl捕获探针的pcr管中，用移液器吹吸混匀。于pcr仪上65℃，16小时。

2.5杂交洗脱

2.5.1按照试剂盒xgenlockdownreagentkit(idt,货号：1072281)的使用说明配制洗脱试剂，如表22所示：

表22

2.5.2捕获磁珠处理

a)吸取50μlm280磁珠至离心管中，将离心管置于磁力架上待上清完全澄清，弃上清。

b)加入200μl1×beadwashbuffer(vial7)，混匀，离心，置于磁力架上待上清完全澄清，弃上清。

c)重复步骤b一次。

d)加入100μl1×beadwashbuffer(vial7)，混匀，转移至pcr管中，置于磁力架上待上清完全澄清，弃上清。

2.5.3磁珠和目标文库的结合

将17μl杂交体系加入到有磁珠的pcr管中，上下缓慢吹吸混匀，于pcr仪上65℃孵育45min。

2.5.4洗脱

a)加入100μl65℃1×washbufferi(vial1)，混匀。置于磁力架上，待上清完全澄清，弃上清。

b)加入200μl65℃1×stringentwashbuffer(vial4)，混匀转移到预热的大离心管中。置于温育仪上，65℃5min。置于磁力架上，待上清完全澄清，弃上清。

c)加入200μl常温1×washbufferi(vial1)，混匀。置于磁力架上，待上清完全澄清，弃上清。

d)加入200μl常温1×washbufferii(vial2)，混匀1。置于磁力架上，待上清完全澄清，弃上清。

e)加入200μl常温1×washbufferiii(vial3)，混匀。置于磁力架上，待上清完全澄清，弃上清.

f)短暂离心，使用10μl吸头移去少量剩余液体。

g)使用25μlnuclease-freewater悬浮磁珠于-20℃保存。

2.6杂交文库扩增

上一步得到的m280磁珠探针混悬液，取25μl/文库按照下表23在200mlpcr管中进行pcr扩增体系配制：

表23

上表所述primer与上文文库预扩增的引物一致：

primerf：5'-cttctatggcgcacgtccct-3'(seqidno:5)，

primer-r：5'-cttccagaagaggccatagca-3'(seqidno:6)。

pcr反应程序如表24所示：

表24

反应结束后，使用0.6倍体积的ampurexp磁珠进行纯化，最后使用te溶液洗脱磁珠，转移至新的离心管内，进入下一步操作，或者放在-80℃中备用。

2.7文库质检

文库进行qbuit检测及agilent2100bioanalyzer检测，检测合格文库进行下一步三代测序文库构建。

3.三代测序文库构建及测序

3.1使用pacbiosequal测序

3.1.1使用建库试剂盒进行建库

3.1.1.1将混好的文库进行修复

修复溶液配制如表25所示：

表25

混匀，离心，放入pcr热循环仪中，进行修复反应，具体条件如下表26所示：

表26

3.1.1.2纯化

使用0.45倍样品体积的pb磁珠进行纯化，最后使用双蒸水洗脱磁珠，-20℃冰箱保存。

3.1.1.3接头连接

连接溶液体系如下表27所示：

表27

混匀，离心，于pcr热循环仪中进行连接反应，具体条件如下表28所示：

表28

3.1.1.4纯化

使用0.45倍样品体积的pb磁珠进行纯化，最后使用双蒸水洗脱磁珠，-20℃冰箱保存。

3.1.2引物退火及binding反应

按照pacbio官方网页给出标准操作方式进行。

3.1.3三代测序

按照pacbiosequal仪器标准操作规范进行测序。

3.2使用oxfordnanoporepromethion测序

3.2.1样本末端修复

取dna，置于冰上，加入neb末端修复/加a尾试剂，混匀。20℃孵育40分钟，65℃孵育20分钟。

3.2.2dna纯化

将1×ampurebeads加入dna中，室温孵育15min，室温磁力架吸附5min，吸弃上清。

加入80％乙醇，磁力架吸附，弃上清，重复一次。室温晾干。

添加ultrapurewater，37℃下吹打洗脱。

磁力架上静置5min，吸取上清，即为纯化后的dna。

3.2.3接头连接

加入nebt4dna快速连接buffer、nebt4dna快速连接酶和接头，混匀，20℃孵育20min。

3.2.4dna纯化

同步骤3.2.2

3.2.5引物退火及loading反应

按照oxfordnanoporepromethion官方网页给出标准操作方式进行。

3.2.6三代测序

按照oxfordnanoporepromethion仪器标准操作规范进行测序。

生物信息学分析

4.1拆分各样品数据

若下机数据为多样品混测，根据各样品的标签序列拆分出每个样品的数据。

4.2数据过滤

根据各平台数据特点，生成高质量数据。

ont平台过滤掉质量值较低的数据。pacbio平台采用官方软件生成高质量的一致性序列。

4.3数据评估

将高质量的数据比对到人类全基因组参考序列，采取唯一比对(即单条序列只能唯一比对到基因组的一个位置)。

统计目标区域的序列数，评估捕获效率、目标区域覆盖深度、覆盖完整性。若数据不合格(合格的标准是：靶区域的测序覆盖度，要求30倍覆盖度不低于95％)，根据情况进行补测数据。

4.4变异检测

检测目标区域的单核苷酸位点变异、小片段插入与缺失、染色体结构变异(snv/indel、sv)等；并对变异进行各数据库的注释，以筛选致病性高的变异。

4.5变异的验证。

将筛选出的高致病性变异进行一代验证。

目前已有多种方法应用于结节性硬化症突变检测：例如fish(荧光原位杂交)、pfge(脉冲场凝胶电泳)、southern杂交这些方法只能发现一小部分(<10％)tsc患者中比较大片段的基因突变；mlpa(多重连接依赖性探针扩增)，该技术仅可以检出基因外显子缺失和重复，不能检测微小的缺失、重复及点突变，或存在明显漏检。仅适用于tsc基因大片段缺失或重排检测，需与其它检测方法相结合，因此不适宜鲜有大片段基因缺失或基因重排的tsc1基因的突变检测；聚合酶链反应-单链构象多态性分析(pcr-sscp)，可以较大程度地提高突变的检出率，但对大片段的缺失或重排具有一定的局限性，敏感性较其他方法低，操作费时费力。dhplc(变性高效液相色谱分析)可以较大程度地提高突变的检出率，但对大片段的缺失或重排具有一定的局限性，需要特殊仪器，而且检测周期较长，不能区别不同类型(变异型和野生型)的纯合子。sanger测序：该方法为tsc基因突变检测的金标准，但是测序通量低，一个测序反应仅可以检测600～800bp，需要开展多个测序反应，大大增加了检测周期；同时成本极高，患者的费用负担较重。因此，大多数sanger测序也仅仅针对tsc1和tsc2基因的外显子区，同样对内含子区变异存在漏检，对tsc基因点突变和小片段移码突变具有很好的检测效能，但是不能检测tsc基因大片段缺失与重排，对于嵌合体检测的敏感性也较低。二代测序(next-generationsequencing，ngs)：这种高准确性、高通量、高灵敏度及低运行成本高通量测序技术，与传统测序技术相比，更加省时，可以检测点突变、20bp以内的插入缺失及微小重复。对于长片段重复、倒位等结构变异检测效果不佳。此外，由于二代测序读长短，平均约300bp～400bp，靶向捕获测序需要间隔小于300bp设计探针，为实现全基因捕获测序，需要合成的捕获探针成本高。因此。只能检出部分突变类型，检出率低。对于可疑的突变一般需进行sanger法测序验证，所以ngs和sanger测序技术结合使用目前是研究中经常使用的技术。

其中，微小重复是指重复区域小于20bp，大片段重复是指重复区域大于20bp。上述mlpa、二代捕获测序仅针对tsc1和tsc2基因外显子区，假如对内含子开展，将使整个检测成本升高100余倍，高昂的检测费致使患者无法承受。已有报道表明，二代测序捕获很难检测到患者样本中发现的许多致病变异，包括大的插入缺失(indel)、拷贝数变异、均聚物或结构变异。并且，使用不同平台不同流程，对于相同的复杂变异检测时，二代测序捕获检测结果并不一致，进一步说明二代测序捕获方法存在缺陷。另外，需要注意的是，尽管sanger测序可以检测点突变、倒位、异位、微小重复、缺失变异，但无法检测大片段重复；尤其是鉴于sanger测序通量低，成本高、工作量大。因此，临床上sanger测序仅作为对二代捕获测序结果发现突变的进一步精确验证手段。

对收集的多个样本，经观测临床表现，对患者患病情况进行了确认。同时，对上述样本使用本发明所述的方法、mlpa、sanger测序、二代捕获测序、mlpa和二代捕获测序联合使用的方法进行了检测。该过程中，实验人员、数据分析人员均不知道样本的基因型及表现型，以确保结果的可信性。

结果显示：

1.本发明可以检出大片段重复、倒位、异位类型的结构变异；

2.本发明的检出率高于其他技术手段；

3.本发明可以检出大量突变，为发现新的致病突变提供分子生物学依据。

实施例3

杂交探针有效间隔长度测试

0.5×平均覆盖深度的序列所占百分比，是一种比较常见评估捕获均一性的参数，用于考察低覆盖深度带来的局限性。如果90％以上的靶区域呈现超过0.5×的平均覆盖深度，则panel的覆盖均一性较好。

以实施例1中所述dmd基因捕获为例，在实施例1中“2.1基因组dna打断”步骤中，通过设定不同参数，实现基因组dna不同长度的片段化，2kb、5kb的片段化与实施例1相同使用超声进行片段化，8kb的片段化使用离心的方式，片段化大小及具体参数如下表29和表30所示：

表29

表30

每条探针平均长度p为120bp，对于每一种片段化大小，分别测试平均间隔0bp(n＝0p)、平均间隔1个探针长度120bp(n＝1p)、平均间隔4个探针长度480bp(n＝4p)、平均间隔7个探针长度840bp(n＝7p)，直至平均间隔19个探针长度2280bp(n＝19p)的间隔距离对靶区域覆盖均一性的影响。其具体的实验步骤如实施例1所述。

表31

针对基因组片段化平均长度为2kb的捕获dna片段：

采用pacbio平台测试结果，具体数值如上表31所示，0.5×平均覆盖深度占比情况如图2所示，平均间隔0p～1p的距离对靶区域覆盖均一性几乎无影响；平均间隔1p～7p的距离对靶区域覆盖均一性有微弱影响，0.5×平均覆盖深度靶区域占比呈微弱下滑趋势，但占比仍然均超过90％；平均间隔7p以上的距离对靶区域覆盖均一性有显著影响，0.5×平均覆盖深度靶区域占比呈显著下滑趋势，且占比均低于90％。因此，针对基因组片段化平均长度为2kb的捕获dna片段，杂交探针有效间隔长度n宜控制在7p以内。由公式n＝(l+2)×p±3×p计算获得的探针平均间隔范围为1p～7p，与实验结果相吻合。

表32

针对基因组片段化平均长度为5kb的捕获dna片段：

采用pacbio平台测试结果，具体数值如上表32所示，0.5×平均覆盖深度占比情况如图1所示，平均间隔0p～4p的距离对靶区域覆盖均一性几乎无影响；平均间隔4p～10p的距离对靶区域覆盖均一性有微弱影响，0.5×平均覆盖深度靶区域占比呈微弱下滑趋势，但占比仍然均超过90％；平均间隔10p以上的距离对靶区域覆盖均一性有显著影响，0.5×平均覆盖深度靶区域占比呈显著下滑趋势，且占比均低于90％。因此，针对基因组片段化平均长度为5kb的捕获dna片段，杂交探针有效间隔长度n宜控制在10p以内。由公式n＝(l+2)×p±3×p计算获得的探针平均间隔范围为4p～10p，与实验结果相吻合。

表33

针对基因组片段化平均长度为8kb的捕获dna片段：

采用pacbio平台测试结果，具体数值如上表33所示，0.5×平均覆盖深度占比情况如图3所示，平均间隔0p～7p的距离对靶区域覆盖均一性几乎无影响；平均间隔7p～13p的距离对靶区域覆盖均一性有微弱影响，0.5×平均覆盖深度靶区域占比呈微弱下滑趋势，但占比仍然均超过90％；平均间隔13p以上的距离对靶区域覆盖均一性有显著影响，0.5×平均覆盖深度靶区域占比呈显著下滑趋势，且占比均低于90％。因此，针对基因组片段化平均长度为8kb的捕获dna片段，杂交探针有效间隔长度n宜控制在13p以内。由公式n＝(l+2)×p±3×p计算获得的探针平均间隔范围7p～13p，与实验结果相吻合。

实施例4

探针添加量与捕获中靶率测试

目的片段的捕获中靶率与捕获探针的浓度紧密相关，其中捕获中靶率指捕获结果中，目的片段的碱基数占下机总碱基数的比例。为此，测试了平均间隔7个探针长度(n＝7p)的捕获探针的添加量与目的片段的捕获中靶率的关系。

以实施例1中所述dmd基因捕获为例，测试捕获探针的添加量与目的片段的捕获中靶率的关系。实施例1中，探针平均长度120bp，探针平均间隔为1kb。具体的，在实施1，2.4.2步骤中进行探针添加量的梯度设置(3、0.3、0.03、0.003)，其他步骤均与实施例1相同，采用pacbio平台测试结果，具体数据如下表34所示：

表34

如图4所示，随着捕获探针的添加量的减小，目的片段的捕获中靶率逐渐下降。因此，为实现50％以上的捕获中靶率，n＝7p的捕获探针的添加量应控制在0.3pmol及以上。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。