高效秸秆纤维素分解菌的筛选及应用的制作方法

技术领域：

本发明涉及生物领域，具体是涉及高效秸秆纤维素分解菌的筛选及应用。

背景技术：
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随着我国畜牧业的迅速发展，虽取得巨大的成绩，但却面临着人畜争粮的局面，使得粮食问题形势严峻。如果不及时调整畜牧业结构，减轻畜牧业对粮食依赖，今后的发展必然会受到极大的限制。目前，有关利用农作物秸秆做饲料解决畜牧粮食问题的研究报道较多。

采用微生物技术处理农作物秸秆是当前研究最多的一种秸秆处理方法。自然界中的一类纤维素分解菌可将秸秆等纤维素分解为糖类，同时菌体本身又是很好的蛋白质，即单细胞蛋白。这个过程的有效利用则可望为农业、畜牧业、发酵工业以及化学工业等持续提供廉价的原料，同时在环境污染的防治、良性生态系统的建立上也会发挥重要的作用。而这一应用前景的前提是要首先分离到能够有效分解纤维素的微生物菌种，但目前得到的纤维素酶无论是来自动物、植物还是微生物，都不能满足大规模工业生产的需要。一直以来各方面的学者在提高纤维素的利用方面展开了诸多研究，这些研究主要集中在两个方向：一是提高反刍动物对粗纤维的降解率；二是利用微生物所产纤维素酶将纤维素降解成可溶性糖后进一步用于生产。

技术实现要素：
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针对现有技术存在的不足，本发明实施例的目的在于提供高效秸秆纤维素分解菌的筛选及应用，以解决上述背景技术中的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

高效秸秆纤维素分解菌的筛选，包括：

步骤s1：采用羧甲基纤维素钠平板法初筛纤维分解菌，通过刚果红染色法和滤纸分解速率初步测定菌株分解纤维素的能力；

步骤s2：通过对初筛菌株进行滤纸酶活和羧甲基纤维素酶活的测定来继续判定降解纤维素的能力；

步骤s3：对纤维素分解菌进行鉴定并优化高产纤维素酶菌株的产酶条件。

优选，步骤s1具体包括，纤维素分解菌的初筛：采用羧甲基纤维素钠平板法初筛纤维分解菌，通过刚果红染色法和滤纸分解速率初步测定菌株分解纤维素的能力。

优选，步骤s2具体包括，纤维素分解菌的复筛：通过对初筛菌株进行滤纸酶活(fpa)和羧甲基纤维素酶活(cmc)的测定，进一步判定菌株降解纤维素的能力。

优选，步骤s3具体包括，纤维素分解菌的鉴定：对筛选的纤维素分解菌进行形态学、不同温度和不同ph条件下生长特性以及16srdna鉴定，以确定菌株的阴阳性及种属；以及高产纤维素酶菌株的产酶条件优化：通过对筛选具有高产纤维素酶的菌株优化培养温度及初始ph，观察其产酶能力。

在本发明中，本发明纤维素分解菌从大别山黄牛瘤胃液中分离，无生物安全问题，对玉米秸秆发酵效果良好。经过实验室分离筛选，获得的分解菌可以耐受不同温度和酸碱环境，而保持较高的酶活。经过临床试验证实，本纤维素分解菌可以有效促进玉米秸秆的发酵，提高还原糖含量和蛋白质含量，增强适口性，易于消化吸收。

优选，在本发明中，步骤s1具体包括：

本发明选用的试剂及耗材如下：

无水碳酸钠、1mol/l福林酚试剂b、纯化琼脂粉、葡萄糖、蛋白胨、pbs缓冲液、细菌基因组dna提取试剂盒、3,5-二硝基水杨酸(dns)试剂、富集培养基、液体发酵培养基、产酶发酵培养基、固体发酵培养基。

益生菌分离鉴定包括：瘤胃液采自望江县小月山农业发展有限公司养殖的大别山黄牛，从屠宰后的牛瘤胃中采取新鲜的瘤胃液接入已灭菌预热的保温瓶中，带回实验室进行处理。

纤维素分解菌初筛：匀浆过滤处理后的样品取0.1ml接入100ml富集培养基中，37℃培养2～3d。取富集后的培养液100μl进行梯度(10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6)稀释；取10^-4、10^-5、10^-6稀释的菌液100μl涂布于羧甲基纤维素钠平板上，37℃倒置培养24～48h；待长出菌后菌落计数，然后挑选菌落形态差异比较明显的菌落，重复划线接种于羧甲基纤维素钠琼脂平板上，直至纯化得到单菌落，然后转接于相应的琼脂斜面上，4℃保存备用。

菌株的透明圈大小测定：将保藏的菌种点种于羧甲基纤维素钠平板上，37℃倒置培养24～48h；用1mg/ml的刚果红浸染15min，倾去染液，再以1mol/l的氯化钠水溶液脱色，观察水解圈大小。

菌株对滤纸的分解率测定：将分离纯化的菌株分别接种到把滤纸当做唯一碳源的液体培养基中，在温度为37℃，120r/min的恒温摇床中振荡培养7d，察看滤纸的崩解状况，以“+”的多少来反应滤纸崩解程度：(+)滤纸没有断裂，滤纸出现毛边；(++)滤纸出现断裂，滤纸没有成糊状；(+++)滤纸出现断裂，震荡发现有碎片糊状。

优选，在本发明中，步骤s2中具体包括：菌株的复筛；

首先，葡萄糖标准曲线的制作，取8支20ml的试管并进行编号，然后按照表1，把1号试管作为空白对照组，其他7支试管含量分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4的葡萄糖，再分别用1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.8、0.6ml的蒸馏水配制成7组不同浓度的葡萄糖溶液。向每支试管中各加入1.5ml配制好的dns试剂，充分混匀后沸水浴加热5min。冷却后使用蒸馏水定容至刻度线，用分光光度计在540nm波长下测定光密度值(od值)，记录结果。以od540nm值为纵坐标，葡萄糖含量(mg)为横坐标，绘制出葡萄糖的标准曲线y＝ax+b；

表1葡萄糖标准曲线制作

发酵液的制备包括：

将初筛菌株分别接种到液体发酵培养基中，在37℃、150r/min条件下振荡培养120h，将培养液于4℃，8000r/min，离心10min，用移液器吸出的上清液为发酵液。

滤纸酶活(fpa)测定包括：采用dns比色法测定fpa酶活。取4支(1支为对照组，另外3支为试验组)清洗干净的20ml试管，编号，分别加入1.5ml柠檬酸缓冲液(0.05mol/l，ph为4.5)和发酶液0.5ml，其次，先向1号试管中加入1.5mldns显色液去终止酶反应，以作为空白对照组，用于后面的调零用。而2、3、4号试管均于50℃的水浴锅预热5～10min，加入经去除淀粉的(1×6cm)新华定量滤纸，放入50℃恒温水浴锅中进行水浴1h。再次，向这3支试管中分别加入1.5mldns显色液以终止酶促反应，充分摇匀后沸水浴5min，待冷却至室温后用去离子水将其定容至刻度线，测定od540nm值，计算平均值，从制作的标准葡萄糖曲线中计算出相对应的葡萄糖含量，计算出fpa酶活力(u/ml)＝5.56×葡萄糖含量(mg)/[时间(h)×反应液中酶液的加入量

(ml)]，5.56表示1mg葡萄糖物质的量，每小时由底物生成1μmol的葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位(u)。

羧甲基纤维素酶活(cmc)测定包括：

采用dns比色法对cmc酶活进行测定。取4支(1支为对照组，另外3支为试验组)清洗干净的20ml试管，编号，分别加入发酶液0.5ml。其次，先向1号试管加入1.5mldns显色去液终止酶反应，用来作为空白对照。而2、3、4号试管均于50℃水浴锅预热5-10min，然后加入1.5ml含有0.5％cmc-na的(0.05mol/lph4.5)柠檬酸缓冲液，放入50℃的恒温水浴锅中进行水浴30min，向3支试管中分别放入1.5mldns显色液用于终止酶促反应，充分混匀后沸水浴5min，待冷却后使用蒸馏水将其定容至刻度线，测定od540nm值，计算平均值，从制作的标准葡萄糖曲线中计算出相对应的葡萄糖含量，计算cmc酶活力(u/ml)＝5.56×葡萄糖含量(mg)/[时间(h)×反应液中酶液的加入量(ml)]。

优选，在本发明中，步骤s3中对纤维素分解菌进行鉴定包括：形态学鉴定；生长特性鉴定；分子生物学鉴定；

具体如下：

形态学鉴定：将分离纯化获得的菌落接种到cmc-na平板上，在温度为37℃的恒温培养箱培养24～48h，观察菌落的透明度、颜色、大小、边缘、是否光滑等特征；取纯化后的单菌落做革兰氏染色，使用生物显微镜观察菌体革兰氏阴性或阳性及形态。以淡红色则表明是革兰氏阴性细菌，用g^-表示；以深紫色则表明是革兰氏阳性细菌，用g⁺表示。

生长特性鉴定：

菌株在不同ph下生长情况：通过设置成5种ph变量：4.0、5.0、6.0、7.0和8.0，将分离纯化的菌株分别接种到不同变量ph的cmc-na培养基中，在37℃恒温箱中倒置培养24～48h后，观察各菌株的生长情况。

菌株在不同温度下生长情况：将筛选获得的纯化菌株分别接种到cmc-na培养基中，然后在4℃、25℃、30℃、37℃、45℃四种不同温度下培养24～48h，观察菌株的生长情况。

分子生物学鉴定：

模板dna的提取：按照细菌基因组dna提取试剂盒(郑州百基生物科技有限公司)说明书的步骤进行操作。

基于16srdna基因序列的pcr扩增：根据16srdna基因的高保守区设计通用引物，引物由南京金斯瑞生物公司合成。正向引物f:5'-agagtttgatcctggctcag-3'；反向引物r:5'-tacggttaccttgttacgactt-3'，片段的长度为1500bp。

pcr扩增反应体系：总体积25μl，包括无菌去离子水5.5μl、上、下游引物各1μl，dna模板5.0μl、2×taqmastermix12.5μl；pcr反应条件见表2。

表216srdna的pcr条件

凝胶电泳鉴定

第一步：制胶

用电子天平称取1.0g琼脂粉溶于100mltae缓冲液，并放置于微波炉中加热2～3min。待溶液温度冷却到大约60℃时，滴加2～3滴溴化乙锭溶液，并充分混匀。

第二步：胶版制备

将制胶玻璃板放到干净的制胶槽中，把梳子固定住，将制备好的琼脂糖溶液缓缓均匀的倒入玻璃板上，静置等溶液全部凝固，然后轻拨梳子，将凝胶及玻璃板轻放到电泳槽中，添加稀释的1×tae电泳缓冲液到完全盖住胶板才停止。

第三步：加样

用10μl微量移液枪分别吸取7μlpcr扩增产物加到点样孔中，待样品添加完毕，最后加入5μldnamarker。

第四步：电泳

加完样后开始电泳，设置电压是120v，电流是120ma，功率是50w，时间设置为30min。

第五步：成像观察

电泳结束后，关闭电源，将凝胶连同内槽玻璃板放入凝胶成像仪上观察电泳带及其位置，判定结果并拍照记录。

16srdna序列分析和系统进化树的构建：选择与扩增目的条带一致，单一且明亮的pcr产物，送到通用生物检测技术有限公司进行测序。将生物返回的测序结果进行拼接后，输入美国国立生物技术信息中心(ncbi)网站的nucleotideblast进行序列比对，结合细菌染色形态，判定细菌种属。将测序得到的16srdna序列在genbank数据库里面经blast搜索同源序列，用clustalx进行序列比对，最后用mega4.0构建系统发育进化树。

优选，在本发明中，步骤s3中优化高产纤维素酶菌株的产酶条件包括：不同ph对菌株纤维素分解酶活力的影响；不同温度对菌株纤维素分解酶活力的影响，具体如下：

不同ph对菌株纤维素分解酶活力的影响：将发酵培养基的ph设为5.0、5.5、6.0、7.0和8.0这样的5个变量，将筛选出的产酶能力较高的菌株分别接种到产酶发酵液体培养基中，在37℃、160r/min条件下振荡培养5d，按照dns法测定其fpa酶活及cmc酶活，每个变量重复3次操作，取平均值。

不同温度对菌株纤维素分解酶活力的影响：在最适ph条件下，将筛选出的产酶能力较高的菌株分别接种到发酵液体培养基，在25℃、30℃、37℃、40℃和45℃条件下，160r/min振荡培养5d，按dns法测定其fpa酶活及cmc酶活，每个变量重复3次操作，取平均值。

在本发明中，还包括高效秸秆纤维素分解菌的应用，利用筛选的高产纤维素分解菌，以优化的培养温度及初始ph对玉米秸秆发酵，测定发酵后玉米秸秆还原糖和可溶性蛋白成分的变化，以验证其应用性；具体如下：

瘤胃液中纤维素降解菌的临床效果研究包括：玉米秸秆发酵后的还原糖和可溶性蛋白测定，分别吸取10ml固体发酵培养液放入8支20ml试管，121℃，灭菌30min。挑取cmc-na培养基上生长好且产酶能力较高的菌株并接种于富集培养基，37℃、160r/min振荡培养3d。吸取1ml富集培养液接种到事前高压好的固体发酵培养基，37℃、160r/min振荡培养0d、3d、5d、7d，用dns显色法和福林-酚试剂法测定发酵前后秸秆中的还原糖、可溶性蛋白含量。

综上所述：本发明纤维素分解菌从大别山黄牛瘤胃液中分离，无生物安全问题，对玉米秸秆发酵效果良好。经过实验室分离筛选，获得的分解菌可以耐受不同温度和酸碱环境，而保持较高的酶活。经过临床试验证实，本发明纤维素分解菌可以有效促进玉米秸秆的发酵，提高还原糖含量和蛋白质含量，增强适口性，易于消化吸收。

为更清楚地阐述本发明的特征和功效，下面结合附图与具体实施例来对本发明进行详细说明。

附图说明：

图1为本发明中葡萄糖标准曲线示意图；

图2为本发明中菌株凝胶电泳检测结果示意图，其中m:dl2000dnamarker；1-6:1-6号纤维素分解菌；

图3为本发明中基于牛瘤胃液中纤维素降解菌16srdna基因的系统进化树构建示意图。

具体实施方式：

参照图1-图3所示，本发明纤维素分解菌从大别山黄牛瘤胃液中分离，无生物安全问题，对玉米秸秆发酵效果良好。经过实验室分离筛选，获得的分解菌可以耐受不同温度和酸碱环境，而保持较高的酶活。经过临床试验证实，本发明纤维素分解菌可以有效促进玉米秸秆的发酵，提高还原糖含量和蛋白质含量，增强适口性，易于消化吸收。

通过一下方案来实现：

本发明提供了高效秸秆纤维素分解菌的筛选，包括

步骤s1：采用羧甲基纤维素钠平板法初筛纤维分解菌，通过刚果红染色法和滤纸分解速率初步测定菌株分解纤维素的能力；

步骤s2：通过对初筛菌株进行滤纸酶活和羧甲基纤维素酶活的测定来继续判定降解纤维素的能力；

步骤s3：对纤维素分解菌进行鉴定并优化高产纤维素酶菌株的产酶条件。

进一步优选，在步骤s1具体包括：从屠宰后的牛瘤胃中采取新鲜的瘤胃液接入已灭菌预热的保温瓶中；对采集的瘤胃液进行处理得到单菌落并进行接种，然后进行初步的分解率测定。

进一步优选，在步骤s2中具体包括：采用dns比色法测定fpa酶活，以及采用dns比色法对cmc酶活进行测定来继续判定降解纤维素的能力。

进一步优选，在步骤s3中具体包括：对筛选的纤维素分解菌进行形态学、不同温度和不同ph条件下生长特性以及16srdna鉴定，以确定菌株的阴阳性及种属；以及通过对筛选具有高产纤维素酶的菌株优化培养温度及初始ph，观察其产酶能力。步骤s3中对纤维素分解菌进行鉴定包括：形态学鉴定；生长特性鉴定；分子生物学鉴定；以及步骤s3中优化高产纤维素酶菌株的产酶条件包括：不同ph对菌株纤维素分解酶活力的影响；不同温度对菌株纤维素分解酶活力的影响。

在本发明中，高效秸秆纤维素分解菌的应用，包括利用筛选的高产纤维素分解菌，以优化的培养温度及初始ph对玉米秸秆发酵，测定发酵后玉米秸秆还原糖和可溶性蛋白成分的变化，以验证其应用性。

以下提供本发明一具体实施例

实施例1

高效秸秆纤维素分解菌的筛选，包括以下步骤：

菌株的初筛，如上述中的，纤维素分解菌初筛：匀浆过滤处理后的样品取0.1ml接入100ml富集培养基中，37℃培养2～3d。取富集后的培养液100μl进行梯度(10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6)稀释；取10^-4、10^-5、10^-6稀释的菌液100μl涂布于羧甲基纤维素钠平板上，37℃倒置培养24～48h；待长出菌后菌落计数，然后挑选菌落形态差异比较明显的菌落，重复划线接种于羧甲基纤维素钠琼脂平板上，直至纯化得到单菌落，然后转接于相应的琼脂斜面上，4℃保存备用。

将富集培养的菌液进行10^-4、10^-5、10^-6梯度稀释后涂布到cmc-na培养基，结合刚果红染色法，共初筛到6株纤维素分解菌，编号设置为1、2、3、4、5、6。测量这些菌株在刚果红染色培养基上的透明圈直径与菌落的直径之比(d/d)并观察滤纸条崩解程度。结果显示，1号和2号菌株的透明圈直径最大，分别为17mm和18mm，d/d均＞5.0，且滤纸溃烂度为“+++”，说明其降解纤维素的能力比较强；而4号和5号菌株的透明圈直径均为15mm，d/d均为4.5，滤纸溃烂度均为“+”；3号和6号菌株的透明圈直径分别为14mm、10mm，但d/d均＜4.55，滤纸溃烂度均为“++”(见表3)

表3初筛菌株透明圈及菌落直径与滤纸溃烂程度

注：d：透明圈的直径(mm)；d：菌落的直径(mm)；d/d：透明圈的直径与菌落的直径之比；

表中“+”滤纸没有断裂，滤纸出现毛边；“++”滤纸出现断裂，滤纸没有成糊状；“+++”滤纸出现断裂，震荡出现碎片糊状

菌株的复筛包括：

(1)葡萄糖标准曲线的制作

不同葡萄糖含量相应的od540nm值结果如表4所示。根据od540nm值与葡萄糖的含量，可制作葡萄糖标准曲线y＝0.6469x+0.0065，r²＝0.9982，如图3所示。

表4不同葡萄糖含量对应的od540nm值

(2)fpa酶活、cmc酶活测定

按照dns法对初筛获得的6株纤维素降解菌进行fpa酶活和cmc酶活测定。结果显示，不同的菌株之间fpa酶活力有所不同，其中1号和2号菌株的fpa酶活力最强，皆为>9.0u/h；其他细菌fpa酶活大小依次为3、4、5和6号菌株，均在5.0-6.5u/h之间。此外，不同菌株之间的cmc酶活也有差异，其中1号和2号菌株的cmc酶活力皆为>12.0u/h，为最强；其他细菌cmc酶活大小依次为3、4、5和6号菌株范围在6.0-8.0u/h。(见表5、表6)结合初筛结果，判定1号和2号纤维素分解菌为高产纤维素酶的菌株。

表5菌株fpa酶活的测定结果

表6菌株cmc酶活的测定结果

瘤胃纤维素分解菌的鉴定

形态学鉴定

对分离筛选获得的6株纤维素降解菌进行形态学鉴定，结果显示，1号和2号菌株形成边缘整齐、有粘性、不透明、圆形隆起、中间突起黄色菌落，镜检是g-短杆菌；3号和6号菌株形成边缘整齐、半透明和不透明、光滑湿润、圆形隆起的黄绿色菌落，镜检为g-短杆菌；4号和5号菌株形成边缘不整、不透明和半透明、表面湿润、圆形隆起的淡黄色菌落，镜检为g+细杆菌，两端钝圆，有芽胞。

生长特性鉴定

6株纤维素分解菌均在25℃～37℃、ph5.0～7.0条件下生长较好；在4℃条件下均不能生长；而在45℃条件下，只有部分菌株能生长；当ph值低于5.0时，均不能生长，而当ph值为8.0时，只有部分菌株能生长。见表7，8。

表7菌株在不同温度下的生长情况

注：表中“-”表示不能生长；“+”表示可以生长。

表8菌株在不同ph值下的生长情况

分子生物学鉴定

pcr扩增获得的目的片段与预期相符合为1500bp左右(见图2)。根据16srdna基因序列分析法及系统发育进化树的结果显示，从牛瘤胃液中分离出的6株纤维素分解菌分别属于3个属5个种。其中1号和2号纤维素分解菌分别与寡养单胞菌m11(stenotrophomonassp.m11)、嗜麦芽寡养单胞菌(stenotrophomonasmaltophilia)在同一分支中，相似度分别为99.69％和99.47％，确定上述菌为寡养单胞菌属(stenotrophomonas)；3号和6号纤维素降解菌分别与鞘氨醇杆菌p6(sphingobacteriumsp.p6)、营养鞘氨醇杆菌(sphingobacteriumalimentarium)处于同一分支中，相似度分别为99.88％和99.69％，确定上述菌为鞘氨醇杆菌属(sphingobacterium)；4和5号纤维素分解菌均与短小芽孢杆菌(empedobacterbrevis)处于同一分支中，相似度分别为100％和99.79％，确定上述菌为芽孢杆菌属(empedobacter)。(见图3)

高产纤维素酶菌株产酶条件的优化

不同ph对纤维素分解菌酶活力的影响

对筛选出高产纤维素酶的1号和2号菌株进行初始ph的优化，观察产酶能力。结果表明，当1号和2号菌株ph分别为6.0，5.5时，fpa酶活力和cmc酶活力达到最高，故为最适初始ph。见表9至表12。

表91号菌在不同ph条件下fpa酶活测定

表101号菌在不同ph条件下cmc酶活测定

表112号菌在不同ph条件下fpa酶活测定

表122号菌在不同ph条件下cmc酶活测定

不同温度对菌株纤维素分解酶活力的影响

按照最适ph值结果，对筛选的高产纤维素酶的的1号和2号菌株进行培养温度的优化，观察其产酶能力。结果表明，当1号和2号菌株培养温度均是37℃时，fpa酶活力和cmc酶活力达到最高，故为最适培养温度。见表13至表16。

表131号菌在不同培养温度条件下fpa酶活测定

表141号菌在不同培养温度条件下cmc酶活测定

表152号菌在不同培养温度条件下fpa酶活测定

表162号菌在不同培养温度条件下cmc酶活测定

瘤胃纤维素分解菌的临床效果研究

发酵秸秆中还原糖含量和可溶性蛋白含量的测定结果

1号和2号菌株发酵玉米秸秆后，还原糖和可溶性蛋白含量比未发酵前明显提高，并在第3天时达到高峰期。见表17至表19。

表171号菌株发酵玉米秸秆后还原糖成分的变化

表182号菌株发酵玉米秸秆后还原糖成分的变化

表191号、2号菌株分别发酵玉米秸秆后可溶性蛋白成分的变化

综上所述，本纤维素分解菌从大别山黄牛瘤胃液中分离，无生物安全问题，对玉米秸秆发酵效果良好。经过实验室分离筛选，获得的分解菌可以耐受不同温度和酸碱环境，而保持较高的酶活。经过临床试验证实，本纤维素分解菌可以有效促进玉米秸秆的发酵，提高还原糖含量和蛋白质含量，增强适口性，易于消化吸收。

以上结合具体实施例描述了本发明的技术原理，仅是本发明的优选实施方式。本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。本领域的技术人员不需要付出创造性的劳动即可联想到本发明的其它具体实施方式，这些方式都将落入本发明的保护范围之内。