IL7Rα的截短体及其在制备治疗肿瘤的药物中的用途的制作方法

文档序号：26139573发布日期：2021-08-03 14:23阅读：170来源：国知局

本公开涉及医药生物技术领域，具体地，涉及一种il7rα的截短体、其编码核酸、表达载体、细胞、药物组合物和它们的用途。

背景技术：

嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor，car)是人工合成的t细胞受体，由抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域组成。抗原结合结构域位于t细胞膜外，包括单链抗体或配体，用于特异性地结合靶抗原。胞内信号传导结构域位于t细胞膜内，用于向t细胞内传导信号以刺激t细胞产生免疫反应。

car能够靶向识别肿瘤细胞表面的靶抗原，因此，表达car的t细胞能够用于靶向杀伤肿瘤细胞。然而，现有的表达嵌合抗原受体car的t细胞对肿瘤细胞的杀伤能力仍然较弱。

技术实现要素：

本公开的目的是克服现有的表达嵌合抗原受体car的t细胞对肿瘤细胞的杀伤能力仍然较弱的问题，提供一种il7rα的截短体。

为了实现上述目的，第一方面，本公开提供一种il7rα的截短体，该il7rα的截短体的氨基酸序列包括seqidno.1所示的序列。

第二方面，本公开提供一种核酸，该核酸编码第一方面所述的il7rα的截短体；优选地，所述核酸具有seqidno.2所示的核苷酸序列。

第三方面，本公开提供一种融合蛋白，所述融合蛋白含有依次连接的抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域；所述胞内信号传导结构域的氨基酸序列包括第一方面所述的il7rα的截短体的氨基酸序列；优选地，所述抗原结合结构域包括抗cd44的单链抗体和/或抗cd133的单链抗体，所述胞内信号传导结构域包括il7rα的截短体；更优选地，所述融合蛋白具有seqidno.3所示的氨基酸序列。

第四方面，本公开提供一种融合核酸，所述融合核酸编码第三方面所述的融合蛋白；优选地，所述融合核酸具有seqidno.4所示的核苷酸序列。

第五方面，本公开提供一种表达载体，所述表达载体插入有表达框，所述表达框包括编码抗原结合分子的第一核酸片段和编码胞内信号传导分子的第二核酸片段，所述胞内信号传导分子中含有第一方面所述的il7rα的截短体，所述第一核酸片段与所述第二核酸片段之间插入有ires元件或2a肽编码序列；优选地，所述表达框为第四方面所述的融合核酸。

第六方面，本公开提供一种表达嵌合抗原受体的细胞，该表达嵌合抗原受体的细胞由宿主细胞转染第五方面所述的表达载体后得到，所述嵌合抗原受体中含有第一方面所述的il7rα的截短体。

可选地，所述宿主细胞为t细胞。

第七方面，本公开提供第一方面所述的il7rα的截短体、第二方面所述的核酸、第三方面所述的融合蛋白、第四方面所述的融合核酸、第五方面所述的表达载体、第六方面所述的表达嵌合抗原受体的细胞在制备治疗肿瘤的药物中的用途。

可选地，所述肿瘤为脑胶质瘤。

第八方面，本公开提供一种药物组合物，该药物组合物的有效成分包括第六方面所述的表达含有il7rα截短体的嵌合抗原受体的细胞。

通过上述技术方案，本公开提供的表达含有上述il7rα截短体的嵌合抗原受体的t细胞，能够有效杀伤肿瘤细胞。

本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：

图1是本公开实施例提供的car-t1细胞的流式细胞仪检测结果图；

图2是本公开实施例提供的car-t2细胞的流式细胞仪检测结果图；

图3是本公开实施例提供的car-t3细胞的流式细胞仪检测结果图；

图4是本公开实施例提供的car-t4细胞的流式细胞仪检测结果图。

具体实施方式

以下结合附图对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。

本公开的第一方面提供一种il7rα的截短体，该il7rα的截短体的氨基酸序列包括seqidno.1所示的序列。

其中，seqidno.1所示的序列如下所示：

kkrikpivwpslpdhkktlehlckkprknlnvsfnpesfldcqihrvddiqardevegflqdtfpqqleesekqrllgsnqeeayvtmssfyqnq。

本公开发明人发现，上述il7rα的截短体能够有效增加活化后t细胞的存活期，因此，表达含有上述il7rα截短体的嵌合抗原受体的t细胞的存活期较长，能够有效杀伤肿瘤细胞。

本公开的第二方面提供一种核酸，该核酸编码第一方面所述的il7rα的截短体；优选地，所述核酸具有seqidno.2所示的核苷酸序列。

其中，seqidno.2所示的核苷酸序列如下所示：

aaaaaaaggattaagcctatcgtatggcccagtctccccgatcacaagaagactctggaacacctttgtaagaaaccaagaaaaaatttaaatgtgagtttcaatcctgaaagtttcctggactgccagattcatagggtggatgacattcaagctagagatgaagtggaaggttttctgcaagatacgtttcctcagcaactagaagaatctgagaagcagaggcttctgggatcaaatcaagaagaagcatatgtcaccatgtccagcttctaccaaaaccag。

本公开的第三方面提供一种融合蛋白，所述融合蛋白含有依次连接的抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域；所述胞内信号传导结构域的氨基酸序列包括第一方面所述的il7rα的截短体的氨基酸序列。优选地，所述抗原结合结构域包括抗cd44的单链抗体和/或抗cd133的单链抗体，所述胞内信号传导结构域包括il7rα的截短体。更优选地，所述融合蛋白具有seqidno.3所示的氨基酸序列。

其中，seqidno.3所示的融合蛋白由抗cd44的单链抗体、抗cd133的单链抗体、cd28、il7rα的截短体和cd3组成。

其中，seqidno.3所示的氨基酸序列如下所示：

qvqlvesgggvvqpgrslrlscaasgftfssygmhwvrqapgkglewvaviwydgsnkfyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarrsdyrgyygmdvwgqgttvtvssgstsgggsgggsggggsseivltqspatlslspgeratlscrasqsvinylawyqqkpgqaprlliydasnrasgiparfsgsgsgtdftltisslepedfavyycqqrrnwpltfgggtkveikggggsggggsggggsqvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftdfemhwvrqapgqglewmgdidpgtgdtaynlkfkgrvtmttdtststaymelrslrsddtavyycalgafvywgqgtlvtvssgstsgggsgggsggggssdvvmtqsplslpvtpgepasiscrssqslansygntylswylqkpgqspqlliygisnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyyclqgthqpytfgqgtkleiktttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlycrskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrskkrikpivwpslpdhkktlehlckkprknlnvsfnpesfldcqihrvddiqardevegflqdtfpqqleesekqrllgsnqeeayvtmssfyqnqrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr。

本公开的第四方面提供一种融合核酸，所述融合核酸编码第三方面所述的融合蛋白。优选地，所述融合核酸具有seqidno.4所示的核苷酸序列。

其中，seqidno.4所示的核苷酸序列用于编码seqidno.3所示的氨基酸序列。

其中，seqidno.4所示的核苷酸序列如下所示：

caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcgtctggattcaccttcagtagctatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatggtatgatggaagtaataaattctatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgaggagaagtgactacaggggctactacggtatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcaggcagtactagcggtggtggctccgggggcggttccggtgggggcggcagcagcgaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttatcaactacttagcctggtaccaacagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatgatgcatccaacagggcctctggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagcctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagcgtcgcaactggccgctcactttcggcggagggaccaaggtggagatcaaaggaggtggtggatccggaggtggtggctccggaggtggtggatcccaggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggttacacctttaccgactttgaaatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggagatattgatcctggaactggtgatactgcctacaatctgaagttcaagggcagagtcaccatgaccacagacacatccacgagcacagcctacatggagctgaggagcctgaggtctgacgacacggccgtgtattactgtgcgttgggggcctttgtttactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcaggcagtactagcggtggtggctccgggggcggttccggtgggggcggcagcagcgatgttgtgatgactcagtctccactctccctgcccgtcacccctggagagccggcctccatctcctgcaggtctagtcagagtcttgcaaacagttatgggaacacctatttgtcttggtacctgcagaagccagggcagtctccacagctcctgatctatgggatttccaacagattttctggggtccctgacaggttcagtggcagtggatcaggcacagattttacactgaaaatcagcagagtggaggctgaggacgttggggtttattactgcttacaaggtacacatcagccgtacacgtttggccaggggaccaagctggagatcaaaaccactaccccagcaccgaggccacccaccccggctcctaccatcgcctcccagcctctgtccctgcgtccggaggcatgtagacccgcagctggtggggccgtgcatacccggggtcttgacttcgcctgcgatatctacatttgggcccctctggctggtacttgcggggtcctgctgctttcactcgtgatcactctttactgtaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccaaaaaaaggattaagcctatcgtatggcccagtctccccgatcacaagaagactctggaacacctttgtaagaaaccaagaaaaaatttaaatgtgagtttcaatcctgaaagtttcctggactgccagattcatagggtggatgacattcaagctagagatgaagtggaaggttttctgcaagatacgtttcctcagcaactagaagaatctgagaagcagaggcttctgggatcaaatcaagaagaagcatatgtcaccatgtccagcttctaccaaaaccagcgcgtgaaattcagccgcagcgcagatgctccagcctacaagcaggggcagaaccagctctacaacgaactcaatcttggtcggagagaggagtacgacgtgctggacaagcggagaggacgggacccagaaatgggcgggaagccgcgcagaaagaatccccaagagggcctgtacaacgagctccaaaaggataagatggcagaagcctatagcgagattggtatgaaaggggaacgcagaagaggcaaaggccacgacggactgtaccagggactcagcaccgccaccaaggacacctatgacgctcttcacatgcaggccctgccgcctcgg。

本公开的第五方面提供一种表达载体，所述表达载体插入有表达框，所述表达框包括编码抗原结合分子的第一核酸片段和编码胞内信号传导分子的第二核酸片段，所述胞内信号传导分子中含有第一方面所述的il7rα的截短体，所述第一核酸片段与所述第二核酸片段之间插入有ires元件或2a肽编码序列；优选地，所述表达框为第四方面所述的融合核酸。

本公开的第六方面提供一种表达嵌合抗原受体的细胞，该表达嵌合抗原受体的细胞由宿主细胞转染第五方面所述的表达载体后得到，所述嵌合抗原受体中含有第一方面所述的il7rα的截短体。

可选地，所述宿主细胞为t细胞。

本公开的第七方面提供第一方面所述的il7rα的截短体、第二方面所述的核酸、第三方面所述的融合蛋白、第四方面所述的融合核酸、第五方面所述的表达载体、第六方面所述的表达嵌合抗原受体的细胞在制备治疗肿瘤的药物中的用途。

可选地，所述肿瘤为脑胶质瘤。

本公开的第八方面提供一种药物组合物，该药物组合物的有效成分包括第六方面所述的表达含有il7rα截短体的嵌合抗原受体的细胞。

下面通过实施例来进一步说明本公开，但是本公开并不因此而受到任何限制。

实施例1

本实施例用于说明表达载体的构建。

(1)采用全序列合成方法，分别合成如seqidno4、seqidno.5和seqidno.6所示的核苷酸序列。seqidno.4所示的核苷酸序列用于编码seqidno.3所示的融合蛋白。seqidno.5所示的核苷酸序列用于编码seqidno.7所示的融合蛋白。seqidno.6所示的核苷酸序列用于编码seqidno.8所示的融合蛋白。其中，seqidno.3、seqidno.7和seqidno.8所示的融合蛋白的组成如下：

g1：seqidno.3所示的融合蛋白由抗cd44的单链抗体、抗cd133的单链抗体、cd28、il7rα截短体和cd3组成；

g2：seqidno.7所示的融合蛋白由抗cd44的单链抗体、抗cd133的单链抗体、cd28和cd3组成；

g3：seqidno.8所示的融合蛋白由抗cd44的单链抗体、抗cd133的单链抗体、cd28、il7rα和cd3组成。

其中，seqidno.7所示的融合蛋白的氨基酸序列如下所示：

qvqlvesgggvvqpgrslrlscaasgftfssygmhwvrqapgkglewvaviwydgsnkfyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarrsdyrgyygmdvwgqgttvtvssgstsgggsgggsggggsseivltqspatlslspgeratlscrasqsvinylawyqqkpgqaprlliydasnrasgiparfsgsgsgtdftltisslepedfavyycqqrrnwpltfgggtkveikggggsggggsggggsqvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftdfemhwvrqapgqglewmgdidpgtgdtaynlkfkgrvtmttdtststaymelrslrsddtavyycalgafvywgqgtlvtvssgstsgggsgggsggggssdvvmtqsplslpvtpgepasiscrssqslansygntylswylqkpgqspqlliygisnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyyclqgthqpytfgqgtkleiktttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlycrskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrsrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr。

seqidno.5所示的核苷酸序列如下所示：

caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcgtctggattcaccttcagtagctatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatggtatgatggaagtaataaattctatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgaggagaagtgactacaggggctactacggtatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcaggcagtactagcggtggtggctccgggggcggttccggtgggggcggcagcagcgaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttatcaactacttagcctggtaccaacagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatgatgcatccaacagggcctctggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagcctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagcgtcgcaactggccgctcactttcggcggagggaccaaggtggagatcaaaggaggtggtggatccggaggtggtggctccggaggtggtggatcccaggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggttacacctttaccgactttgaaatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggagatattgatcctggaactggtgatactgcctacaatctgaagttcaagggcagagtcaccatgaccacagacacatccacgagcacagcctacatggagctgaggagcctgaggtctgacgacacggccgtgtattactgtgcgttgggggcctttgtttactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcaggcagtactagcggtggtggctccgggggcggttccggtgggggcggcagcagcgatgttgtgatgactcagtctccactctccctgcccgtcacccctggagagccggcctccatctcctgcaggtctagtcagagtcttgcaaacagttatgggaacacctatttgtcttggtacctgcagaagccagggcagtctccacagctcctgatctatgggatttccaacagattttctggggtccctgacaggttcagtggcagtggatcaggcacagattttacactgaaaatcagcagagtggaggctgaggacgttggggtttattactgcttacaaggtacacatcagccgtacacgtttggccaggggaccaagctggagatcaaaaccactaccccagcaccgaggccacccaccccggctcctaccatcgcctcccagcctctgtccctgcgtccggaggcatgtagacccgcagctggtggggccgtgcatacccggggtcttgacttcgcctgcgatatctacatttgggcccctctggctggtacttgcggggtcctgctgctttcactcgtgatcactctttactgtaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctcccgcgtgaaattcagccgcagcgcagatgctccagcctacaagcaggggcagaaccagctctacaacgaactcaatcttggtcggagagaggagtacgacgtgctggacaagcggagaggacgggacccagaaatgggcgggaagccgcgcagaaagaatccccaagagggcctgtacaacgagctccaaaaggataagatggcagaagcctatagcgagattggtatgaaaggggaacgcagaagaggcaaaggccacgacggactgtaccagggactcagcaccgccaccaaggacacctatgacgctcttcacatgcaggccctgccgcctcgg。

seqidno.8所示的融合蛋白的氨基酸序列如下所示：

qvqlvesgggvvqpgrslrlscaasgftfssygmhwvrqapgkglewvaviwydgsnkfyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarrsdyrgyygmdvwgqgttvtvssgstsgggsgggsggggsseivltqspatlslspgeratlscrasqsvinylawyqqkpgqaprlliydasnrasgiparfsgsgsgtdftltisslepedfavyycqqrrnwpltfgggtkveikggggsggggsggggsqvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftdfemhwvrqapgqglewmgdidpgtgdtaynlkfkgrvtmttdtststaymelrslrsddtavyycalgafvywgqgtlvtvssgstsgggsgggsggggssdvvmtqsplslpvtpgepasiscrssqslansygntylswylqkpgqspqlliygisnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyyclqgthqpytfgqgtkleiktttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlycrskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrskkrikpivwpslpdhkktlehlckkprknlnvsfnpesfldcqihrvddiqardevegflqdtfpqqleesekqrlggdvqspncpsedvvitpesfgrdssltclagnvsacdapilspsrsldcresgkngphvyqdlllslgttnstlpppfslqsgiltlnpvaqgqpiltslgsnqeeayvtmssfyqnqrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr。

seqidno.6所示的核苷酸序列如下所示：

caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcgtctggattcaccttcagtagctatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatggtatgatggaagtaataaattctatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgaggagaagtgactacaggggctactacggtatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcaggcagtactagcggtggtggctccgggggcggttccggtgggggcggcagcagcgaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttatcaactacttagcctggtaccaacagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatgatgcatccaacagggcctctggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagcctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagcgtcgcaactggccgctcactttcggcggagggaccaaggtggagatcaaaggaggtggtggatccggaggtggtggctccggaggtggtggatcccaggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggttacacctttaccgactttgaaatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggagatattgatcctggaactggtgatactgcctacaatctgaagttcaagggcagagtcaccatgaccacagacacatccacgagcacagcctacatggagctgaggagcctgaggtctgacgacacggccgtgtattactgtgcgttgggggcctttgtttactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcaggcagtactagcggtggtggctccgggggcggttccggtgggggcggcagcagcgatgttgtgatgactcagtctccactctccctgcccgtcacccctggagagccggcctccatctcctgcaggtctagtcagagtcttgcaaacagttatgggaacacctatttgtcttggtacctgcagaagccagggcagtctccacagctcctgatctatgggatttccaacagattttctggggtccctgacaggttcagtggcagtggatcaggcacagattttacactgaaaatcagcagagtggaggctgaggacgttggggtttattactgcttacaaggtacacatcagccgtacacgtttggccaggggaccaagctggagatcaaaaccactaccccagcaccgaggccacccaccccggctcctaccatcgcctcccagcctctgtccctgcgtccggaggcatgtagacccgcagctggtggggccgtgcatacccggggtcttgacttcgcctgcgatatctacatttgggcccctctggctggtacttgcggggtcctgctgctttcactcgtgatcactctttactgtaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccaaaaaaaggattaagcctatcgtatggcccagtctccccgatcataagaagactctggaacatctttgtaagaaaccaagaaaaaatttaaatgtgagtttcaatcctgaaagtttcctggactgccagattcatagggtggatgacattcaagctagagatgaagtggaaggttttctgcaagatacgtttcctcagcaactagaagaatctgagaagcagaggcttggaggggatgtgcagagccccaactgcccatctgaggatgtagtcatcactccagaaagctttggaagagattcatccctcacatgcctggctgggaatgtcagtgcatgtgacgcccctattctctccccttccaggtccctagactgcagggagagtggcaagaatgggcctcatgtgtaccaggacctcctgcttagccttgggactacaaacagcacgctgccccctccattttctctccaatctggaatcctgacattgaacccagttgctcagggtcagcccattcttacttccctgggatcaaatcaagaagaagcatatgtcaccatgtccagcttctaccaaaaccagcgcgtgaaattcagccgcagcgcagatgctccagcctacaagcaggggcagaaccagctctacaacgaactcaatcttggtcggagagaggagtacgacgtgctggacaagcggagaggacgggacccagaaatgggcgggaagccgcgcagaaagaatccccaagagggcctgtacaacgagctccaaaaggataagatggcagaagcctatagcgagattggtatgaaaggggaacgcagaagaggcaaaggccacgacggactgtaccagggactcagcaccgccaccaaggacacctatgacgctcttcacatgcaggccctgccgcctcgg。

(2)采用plvx-ires-δngfr(购自clontech公司，货号为631982)作为载体，采用常规方法分别插入步骤(1)中合成的3种核苷酸序列，得到本实施例的3种慢病毒表达载体。

实施例2

本实施例用于说明表达嵌合抗原受体的t细胞的制备和检测。

(1)将实施例1构建的3种慢病毒表达载体和plvx-ires-δngfr空载体分别进行慢病毒包装，然后按照下述方法分别进行t细胞的体外培养、转染和扩增。

(2)按照下述方法分离血液中的t细胞：将1ml无菌pbs与1ml血液混匀，然后缓慢加入到淋巴细胞分离液ficoll的上层，并于4℃、400g条件下离心30min，加减速分别设置为0。离心结束后，去掉上层血浆，吸取中间白膜层细胞，加入pbs重悬洗涤，并于100g条件下离心10min，加减速正常。离心结束后，去掉上层洗涤液，加入1ml的1640+10％fbs+1％双抗+1×glutamine培养基重悬细胞，然后利用抗人cd3/cd28磁珠(购自thermofisher公司)刺激扩增，其中，重悬后细胞浓度为1×10⁶细胞/ml，磁珠加入量为100μl，再加入100iu/mlrhil-2(peprotech)，刺激培养2天，得到t细胞。

(3)按照下述方法进行慢病毒转染：取4份上述分离得到的t细胞，分别加入步骤(1)包装好的慢病毒，然后加入终浓度为6μg/ml的polybrene，混匀，并于32℃、800g的条件下离心100min。离心结束后放入培养箱中继续培养24h。培养结束后将培养物于1500rpm的条件下离心15min，并将离心得到的细胞以1×10⁶/ml的密度接种于培养板内，以rhil2-100iu/ml刺激培养，以后每2-3天换液一次，直至2-4周，得到转染后的t淋巴细胞car-t1、car-t2、car-t3和car-t4。其中，car-t1转染有seqidno.4所示的核苷酸序列，能够表达seqidno.3所示的融合蛋白；car-t2转染有seqidno.5所示的核苷酸序列，能够表达seqidno.7所示的融合蛋白；car-t3转染有seqidno.6所示的核苷酸序列，能够表达seqidno.8所示的融合蛋白；car-t4转染有空载体。

培养结束后，用pbs重悬细胞，并用流式细胞仪检测上述4种转染后的t淋巴细胞的比例及表面car蛋白的表达。检测方法为：分别离心收集转染后的待检测t细胞，pbs洗涤1次后弃上清，按抗体说明书加入相应检测量的单抗避光30min后，利用pbs洗涤、重悬，过膜后采用流式细胞仪进行夹心法检测，检测时使用的抗体为his-tag标记的cd44和pe标记的抗his-tag的抗体的混合物。结果如图1～4所示。

图1是本公开实施例提供的car-t1细胞的流式细胞仪检测结果图；

图2是本公开实施例提供的car-t2细胞的流式细胞仪检测结果图；

图3是本公开实施例提供的car-t3细胞的流式细胞仪检测结果图；

图4是本公开实施例提供的car-t4细胞的流式细胞仪检测结果图。

从图1～3可以看出，car-t1细胞、car-t2细胞和car-t3细胞中均检测出区别于正常t淋巴细胞的其它细胞；由图4可以看出，car-t4细胞并未检测出区别于正常t淋巴细胞的其它细胞。由此说明本实施例中转染有融合基因的car-t细胞均已成功表达目标融合蛋白。

实施例3

本实施例用于验证实施例2构建的car-t细胞的扩增能力和生存期。

分别取实施例2中转染并培养得到的4种car-t细胞，分别与cd44和cd133阳性的胶质瘤干细胞gsc20按照效靶比＝10(t细胞数量：胶质瘤干细胞数量)混合。将混合后的细胞置于24孔板中进行培养，其中，每孔中含有胶质瘤干细胞10⁵个，每孔反应体系为1ml。培养条件包括：37℃，5％co2，饱和湿度孵箱孵育。此后0、4、8、12、18、26天用细胞计数板为不同car-t细胞进行计数，探究不同car-t在靶细胞刺激下的扩增情况

表1

由表1可以看出，表达有上述il7rα的截短体的car-t细胞具备更强的扩增能力和更长的生存期。

对比例

取实施例2中转染并培养得到car-t1细胞，以及靶向经典肿瘤靶点egfrviii的传统第二代car-t细胞(egfrviii-cd28-cd3)，分别与cd44阳性和cd133阳性的胶质瘤干细胞gsc20按照不同的效靶比(t细胞数量：胶质瘤干细胞数量)混合。将混合后的细胞置于96孔板中进行培养，其中，每孔中含有胶质瘤干细胞4×10⁴个，每孔反应体系为200μl。培养条件包括：37℃，5％co2，饱和湿度孵箱孵育4小时。

乳酸脱氢酶活性测定：离心结束后，每孔吸取上清液100μl置于96孔酶标板中，同时，每孔加入100μlldh底物，室温避光反应30min。反应结束后，每孔加50μl终止液终止酶促反应。在酶标仪490nm测定光密度值(od)。计算各组平均光密度值(od)，按下式计算每种t细胞对胶质瘤干细胞的裂解率。结果如表1所示。

裂解率％＝(实验组od-胶质瘤干细胞自发释放od-效应细胞自然释放od)/(胶质瘤干细胞最大释放od-胶质瘤干细胞自发释放od)

检测结果见表2。

表2

由表2可以看出，靶向经典肿瘤干细胞靶点egfrviii的传统第二代car-t细胞对胶质瘤干细胞的杀伤力不如本公开提供的表达il7rα截短体的t细胞。

以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。

序列表

<110>北京市神经外科研究所

<120>il7rα的截短体及其在制备治疗肿瘤的药物中的用途

<130>17159bjni-lgz

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>95

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

lyslysargilelysproilevaltrpproserleuproasphislys

151015

lysthrleugluhisleucyslyslysproarglysasnleuasnval

202530

serpheasnprogluserpheleuaspcysglnilehisargvalasp

354045

aspileglnalaargaspgluvalgluglypheleuglnaspthrphe

505560

proglnglnleuglugluserglulysglnargleuleuglyserasn

65707580

glngluglualatyrvalthrmetserserphetyrglnasngln

859095

<210>2

<211>285

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

aaaaaaaggattaagcctatcgtatggcccagtctccccgatcacaagaagactctggaa60

cacctttgtaagaaaccaagaaaaaatttaaatgtgagtttcaatcctgaaagtttcctg120

gactgccagattcatagggtggatgacattcaagctagagatgaagtggaaggttttctg180

caagatacgtttcctcagcaactagaagaatctgagaagcagaggcttctgggatcaaat240

caagaagaagcatatgtcaccatgtccagcttctaccaaaaccag285

<210>3

<211>822

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

glnvalglnleuvalgluserglyglyglyvalvalglnproglyarg

151015

serleuargleusercysalaalaserglyphethrphesersertyr

202530

glymethistrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

354045

alavaliletrptyraspglyserasnlysphetyralaaspserval

505560

lysglyargphethrileserargaspasnserlysasnthrleutyr

65707580

leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys

859095

alaargargserasptyrargglytyrtyrglymetaspvaltrpgly

100105110

glnglythrthrvalthrvalserserglyserthrserglyglygly

115120125

serglyglyglyserglyglyglyglysersergluilevalleuthr

130135140

glnserproalathrleuserleuserproglygluargalathrleu

145150155160

sercysargalaserglnservalileasntyrleualatrptyrgln

165170175

glnlysproglyglnalaproargleuleuiletyraspalaserasn

180185190

argalaserglyileproalaargpheserglyserglyserglythr

195200205

aspphethrleuthrileserserleugluprogluaspphealaval

210215220

tyrtyrcysglnglnargargasntrpproleuthrpheglyglygly

225230235240

thrlysvalgluilelysglyglyglyglyserglyglyglyglyser

245250255

glyglyglyglyserglnvalglnleuvalglnserglyalagluval

260265270

lyslysproglyalaservallysvalsercyslysalaserglytyr

275280285

thrphethrasppheglumethistrpvalargglnalaproglygln

290295300

glyleuglutrpmetglyaspileaspproglythrglyaspthrala

305310315320

tyrasnleulysphelysglyargvalthrmetthrthraspthrser

325330335

thrserthralatyrmetgluleuargserleuargseraspaspthr

340345350

alavaltyrtyrcysalaleuglyalaphevaltyrtrpglyglngly

355360365

thrleuvalthrvalserserglyserthrserglyglyglysergly

370375380

glyglyserglyglyglyglyserseraspvalvalmetthrglnser

385390395400

proleuserleuprovalthrproglygluproalaserilesercys

405410415

argserserglnserleualaasnsertyrglyasnthrtyrleuser

420425430

trptyrleuglnlysproglyglnserproglnleuleuiletyrgly

435440445

ileserasnargpheserglyvalproaspargpheserglysergly

450455460

serglythraspphethrleulysileserargvalglualagluasp

465470475480

valglyvaltyrtyrcysleuglnglythrhisglnprotyrthrphe

485490495

glyglnglythrlysleugluilelysthrthrthrproalaproarg

500505510

proprothrproalaprothrilealaserglnproleuserleuarg

515520525

proglualacysargproalaalaglyglyalavalhisthrarggly

530535540

leuaspphealacysaspiletyriletrpalaproleualaglythr

545550555560

cysglyvalleuleuleuserleuvalilethrleutyrcysargser

565570575

lysargserargleuleuhisserasptyrmetasnmetthrproarg

580585590

argproglyprothrarglyshistyrglnprotyralaproproarg

595600605

aspphealaalatyrargserlyslysargilelysproilevaltrp

610615620

proserleuproasphislyslysthrleugluhisleucyslyslys

625630635640

proarglysasnleuasnvalserpheasnprogluserpheleuasp

645650655

cysglnilehisargvalaspaspileglnalaargaspgluvalglu

660665670

glypheleuglnaspthrpheproglnglnleuglugluserglulys

675680685

glnargleuleuglyserasnglngluglualatyrvalthrmetser

690695700

serphetyrglnasnglnargvallyspheserargseralaaspala

705710715720

proalatyrlysglnglyglnasnglnleutyrasngluleuasnleu

725730735

glyargarggluglutyraspvalleuasplysargargglyargasp

740745750

proglumetglyglylysproargarglysasnproglngluglyleu

755760765

tyrasngluleuglnlysasplysmetalaglualatyrsergluile

770775780

glymetlysglygluargargargglylysglyhisaspglyleutyr

785790795800

glnglyleuserthralathrlysaspthrtyraspalaleuhismet

805810815

glnalaleuproproarg

820

<210>4

<211>2466

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactc60

tcctgtgcagcgtctggattcaccttcagtagctatggcatgcactgggtccgccaggct120

ccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatggtatgatggaagtaataaattctat180

gcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtat240

ctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgaggagaagt300

gactacaggggctactacggtatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcc360

tcaggcagtactagcggtggtggctccgggggcggttccggtgggggcggcagcagcgaa420

attgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctc480

tcctgcagggccagtcagagtgttatcaactacttagcctggtaccaacagaaacctggc540

caggctcccaggctcctcatctatgatgcatccaacagggcctctggcatcccagccagg600

ttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagcctagagcctgaa660

gattttgcagtttattactgtcagcagcgtcgcaactggccgctcactttcggcggaggg720

accaaggtggagatcaaaggaggtggtggatccggaggtggtggctccggaggtggtgga780

tcccaggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaag840

gtctcctgcaaggcttctggttacacctttaccgactttgaaatgcactgggtgcgacag900

gcccctggacaagggcttgagtggatgggagatattgatcctggaactggtgatactgcc960

tacaatctgaagttcaagggcagagtcaccatgaccacagacacatccacgagcacagcc1020

tacatggagctgaggagcctgaggtctgacgacacggccgtgtattactgtgcgttgggg1080

gcctttgtttactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcaggcagtactagcggt1140

ggtggctccgggggcggttccggtgggggcggcagcagcgatgttgtgatgactcagtct1200

ccactctccctgcccgtcacccctggagagccggcctccatctcctgcaggtctagtcag1260

agtcttgcaaacagttatgggaacacctatttgtcttggtacctgcagaagccagggcag1320

tctccacagctcctgatctatgggatttccaacagattttctggggtccctgacaggttc1380

agtggcagtggatcaggcacagattttacactgaaaatcagcagagtggaggctgaggac1440

gttggggtttattactgcttacaaggtacacatcagccgtacacgtttggccaggggacc1500

aagctggagatcaaaaccactaccccagcaccgaggccacccaccccggctcctaccatc1560

gcctcccagcctctgtccctgcgtccggaggcatgtagacccgcagctggtggggccgtg1620

catacccggggtcttgacttcgcctgcgatatctacatttgggcccctctggctggtact1680

tgcggggtcctgctgctttcactcgtgatcactctttactgtaggagtaagaggagcagg1740

ctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcat1800

taccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccaaaaaaaggattaag1860

cctatcgtatggcccagtctccccgatcacaagaagactctggaacacctttgtaagaaa1920

ccaagaaaaaatttaaatgtgagtttcaatcctgaaagtttcctggactgccagattcat1980

agggtggatgacattcaagctagagatgaagtggaaggttttctgcaagatacgtttcct2040

cagcaactagaagaatctgagaagcagaggcttctgggatcaaatcaagaagaagcatat2100

gtcaccatgtccagcttctaccaaaaccagcgcgtgaaattcagccgcagcgcagatgct2160

ccagcctacaagcaggggcagaaccagctctacaacgaactcaatcttggtcggagagag2220

gagtacgacgtgctggacaagcggagaggacgggacccagaaatgggcgggaagccgcgc2280

agaaagaatccccaagagggcctgtacaacgagctccaaaaggataagatggcagaagcc2340

tatagcgagattggtatgaaaggggaacgcagaagaggcaaaggccacgacggactgtac2400

cagggactcagcaccgccaccaaggacacctatgacgctcttcacatgcaggccctgccg2460

cctcgg2466

<210>5

<211>2181

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5