一株枯草芽孢杆菌及其应用的制作方法

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株枯草芽孢杆菌及其应用。

背景技术：

枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)，是芽孢杆菌属的一种，广泛分布在土壤及腐败的有机物中，其应用广泛，关于其应用现有的报道包括对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用；自身合成消化性酶类，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶等，在消化道中与内源酶共同发挥作用，提高饲料消化率；还能合成多种维生素，提高动物体内干扰素和巨噬细胞的活性等。

腈水解酶广泛存在于微生物群体内，在敏捷食酸菌(acidovoraxfacilis)、粪产碱杆菌(alcaligenesfaecalis)、苍白芽孢杆菌(bacilluspallidus)等微生物中均有发现，在植物中也发现有腈水解酶的存在。大量的研究发现，腈水解酶的底物谱带广，几乎所有的腈都可以被其中的某种微生物的腈水解酶催化形成相应的酸，有研究者从土壤中分离到一株腈水解酶产生菌能够催化对甲氧基苯乙腈生成对甲氧基苯乙酸。腈水解酶能够生物催化邻氯扁桃腈生成r-邻氯扁桃酸。在农药领域，腈水解酶能够催化生产草甘膦中间体和l-草铵膦。因此腈水解酶具有重要的应用价值。挖掘和探索不同微生物来源的腈水解酶具有非常重要的意义。其中来源于枯草芽孢杆菌腈水解酶已经有相关文献报道，其中公开号为cn107254429a的中国发明专利公开了一种高产重组腈水解酶的枯草芽孢杆菌及其应用方法，并具体公开了该枯草芽孢杆菌能表达重组腈水解酶、并转化3-氰基吡啶合成烟酸；公开号为cn101037658a的中国发明专利公开了一种枯草芽孢杆菌菌株zjb-063及其应用，并具体公开了该枯草芽孢杆菌zjb-063可以对对羟基苯乙腈水解转化成对羟基苯乙酸。虽然上述专利报道了一些枯草芽孢杆菌产生的腈水解酶对一些腈类化合物具有水解作用，但是不同菌株对不同腈类化合物的水解作用存在巨大差异。所以关于枯草芽孢杆菌在其它方面的应用还有待于进一步的挖掘。

技术实现要素：

本发明的目的之一在于提供一株枯草芽孢杆菌菌株ld003(bacillussubtilis)。

本发明提供的枯草芽孢杆菌菌株ld003(bacillussubtilis)，分离自烟台地区化工厂附近土壤中，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)，保藏日期为2020年6月16日，保藏编号为cgmccno.20097，保藏地址为中国北京

进一步地，所述菌株的16srdna基因序列如seq.no.1所示。

本发明的目的之二在于提供上述菌株在制备3-吲哚丙酸、2-氨基丁酸或肉桂酸中的应用。

其中，所述3-吲哚丙酸、2-氨基丁酸或肉桂酸的制备方法为：

（1）菌株活化：挑取菌种划线接种至固体保藏培养基，于恒温培养箱28~30℃下培养14~20h；

（2）液体种子制备：挑取活化菌株接种于装有种子培养基的容器中，纱布封口，于26~37℃，160~200r/min下摇床振荡培养12~24h，得液体种子；

（3）液体发酵：按体积比5~10%接种量向发酵培养基接入步骤（2）制备的液体种子，转速200~700r/min，溶氧控制20~50%，ph7.0~7.5，温度26~37℃，通气培养24~48h，得到产腈水解酶的发酵液，8000r/min离心20min收集湿菌体细胞，贮存于-80℃的冰箱中；

（4）催化制备产物：将10~30g的3-吲哚丙腈、2-氨基丁腈或肉桂腈加入1l50mm、ph6.0～8.0的磷酸缓冲液中，搅拌均匀，加入步骤（3）收集的湿菌体细胞10~30g，温度20~30℃，维持转速在50~100r/min，反应1~5h，即得3-吲哚丙酸、2-氨基丁酸或肉桂酸。

具体地，上述制备方法中，所述固体保藏培养基为：酵母浸粉5g/l，蛋白胨10g/l，nacl5g/l，琼脂20g/l；ph7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min；

上述制备方法中，所述液体种子培养基为：酵母浸粉5g/l，蛋白胨10g/l，nacl5g/l，ph7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min；

上述制备方法中，所述发酵培养基为：葡萄糖10g/l，蛋白胨5~20g/l，酵母浸粉1~5g/l，mgso40.1~0.5g/l，硫酸铵2~7g/l，kh2po40.1~1g/l，cocl250~100mg/l；ph7.0，115℃高压蒸汽灭菌20min。

本发明具有如下优点：

1、这是一株高效产腈水解酶的菌株，培养方法简单，生长速度快，不易变异，遗传稳定性好，培养基成分简单，原料成本低，产生的腈水解酶活力高，底物广谱，对3-吲哚丙腈、2-氨基丁腈、肉桂腈、丙烯腈具有较高的酶活性，可以直接用于酶法制备3-吲哚丙酸、2-氨基丁酸、肉桂酸等，具有很高的工业应用优势。

2、本发明采用生物催化法生产3-吲哚丙酸、2-氨基丁酸和肉桂酸，条件易于控制，操作简单，反应迅速，拓宽了其生物制备方法，其产物3-吲哚丙酸、2-氨基丁酸、肉桂酸绿色安全、浓度高。

附图说明

图1是枯草芽孢杆菌ld003的系统发育树。

具体实施方式

下面将通过具体实施例来对本发明进行进一步的解释，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。

如无特殊说明，本发明所采用的各种材料和试剂均能通过商业方式获得。同样，所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1枯草芽孢杆菌ld003的分离与鉴定

1、菌株的分离

自烟台地区化工厂附近土壤中取适量土样，取其中1g加入到50ml富集培养基中，此处所述富集培养基为：3-吲哚丙腈1-20ml/l、cacl22.0g/l、葡萄糖5.0g/l、feso40.02g/l、nacl0.1g/l、mgso41.0g/l、kh2po41.0g/l，ph7.0；将含有土样的富集培养基置于28℃摇床，150r/min，培养3-4天。然后以1：100的接种量转接到新的富集培养基中，培养基中的3-吲哚丙腈逐次增加，分别为0.1%，0.2%，0.5%，1.0%和2.0%。

取上述培养液500μl,稀释不同倍数后涂布于固体筛选培养基上，此处所述的固体筛选培养基为：3-吲哚丙腈20ml/l、cacl22.0g/l、葡萄糖5.0g/l、feso40.02g/l、nacl0.1g/l、mgso41.0g/l、kh2po41.0g/l，1.5%琼脂粉；ph7.0；。28℃黑暗培养3-4天后，挑取菌体进行分离纯化得到单菌落。

将初筛获得的菌体接入发酵培养基，此处所述的发酵培养基为：3-吲哚丙腈2g/l,葡萄糖10g/l，蛋白胨5g/l，酵母浸粉1g/l，mgso40.1g/l，硫酸铵2g/l，kh2po40.3g/l，cocl250mg/l；ph7.0，115℃高压蒸汽灭菌20min。28℃摇床培养2天后离心收集菌体，将适量菌体加入到500μl50mm、ph7.5的磷酸缓冲液中，同时加入适量3-吲哚丙腈，在温度25℃、维持转速在50r/min的摇床中反应3h，hplc检测3-吲哚丙酸的生成。液相色谱条件为c18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)，柱温25℃；检测波长：280nm；流动相：甲醇：甲酸-甲酸铵缓冲液（ph3.20）（70:30，v/v）；流速：1.0ml/min。

根据生成的3-吲哚丙酸的量比较筛选菌株酶活的高低，选择水解3-吲哚丙腈能力最高的菌株ld003作为试验菌株。

2、菌株的鉴定

1）菌种特性

在保藏培养基上菌落呈污白或微黄色，近圆形、表面粗糙不透明、边缘不规则；通过显微镜观察，菌体呈杆状，有芽孢、能运动，革兰氏阳性；生理生化指标如下所示：

项目ld003项目ld003

甘油+vp试验+

蔗糖+甲基红试验+

d-甘露醇+氧化酶-

l-阿拉伯糖+触酶试验+

硝酸盐还原+柠檬酸利用+

丙二酸盐利用-吲哚试验-

吲哚实验-7%nacl生长+

明胶水解+酪蛋白分解-

穿刺实验+磷酸酶+

2）菌株鉴定

以菌株ld003的基因组dna为模板，以如下引物进行pcr扩增测序得1457bp16srdna序列，序列如seqidno.1所示。

其引物序列为：

27f：5'-agagtttgatcctggctcag-3'；

1492r：5'-tacggctaccttgttacgactt-3'；

在genbank上进行blast比对，得出该菌株与bacillussubtilisstraindp12（hq536001.1）碱基相似性达99%，系统发育树见图1。

3）菌株的遗传稳定性

采用划线法将枯草芽孢杆菌ld003在固体培养基上连续传代50次，测定菌体形态、生长速度及转化3-吲哚丙腈、2-氨基丁酸或肉桂酸的速度和转化率，与原代菌株无明显差异，遗传稳定性良好。

实施例2菌株培养与3-吲哚丙酸合成

1）菌株活化：挑取菌种划线接种至固体保藏培养基(酵母浸粉5g/l，蛋白胨10g/l，nacl5g/l，琼脂20g/l；ph7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min)，于28℃恒温培养箱培养20h；

2）液体种子制备：挑取一环活化菌株接种于装有50ml种子培养基(酵母浸粉5g/l，蛋白胨10g/l，nacl5g/l，ph7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min)的500ml三角瓶中，八层纱布封口，于28℃，160r/min摇床振荡培养18h，得液体种子；

3）液体发酵：按5%接种量向发酵培养基(葡萄糖10g/l，蛋白胨5g/l，酵母浸粉1g/l，mgso40.1g/l，硫酸铵2g/l，kh2po40.3g/l，cocl250mg/l；ph7.0，115℃高压蒸汽灭菌20min)接入液体种子，转速200r/min，溶氧控制在20～30%，ph7.0，温度28℃，通气培养36h，得到腈水解酶的发酵液，8000r/min离心20min收集菌体细胞；

4）催化制备3-吲哚丙酸：将30g的3-吲哚丙腈加入1l50mm、ph7.5的磷酸缓冲液中，搅拌均匀，加入步骤3）收集的菌体细胞30g，温度25℃、维持转速在50r/min，反应5h，hplc测定3-吲哚丙酸含量，液相色谱条件为c18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)，柱温25℃；检测波长：280nm；流动相：甲醇：甲酸-甲酸铵缓冲液（ph3.20）（70:30，v/v）；流速：1.0ml/min。结果：3-吲哚丙酸含量为31.7g/l，对3-吲哚丙腈摩尔转化率为95.5%。

实施例3菌株培养与2-氨基丁酸合成

1）菌株活化：挑取菌种划线接种至固体保藏培养基(酵母浸粉5g/l，蛋白胨10g/l，nacl5g/l，琼脂20g/l；ph7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min；)，于30℃恒温培养箱培养14h；

2）液体种子制备：挑取1环活化菌株接种于装有50ml种子培养基(此处所述种子培养基的成分见发明内容)的500ml三角瓶中，八层纱布封口，于37℃，160r/min摇床振荡培养12h，得液体种子；

3）液体发酵：按8%接种量向发酵培养基(葡萄糖10g/l，蛋白胨10g/l，酵母浸粉2g/l，mgso40.3g/l，硫酸铵4g/l，kh2po40.7g/l，cocl280mg/l；ph7.0，115℃高压蒸汽灭菌20min)接入液体种子，转速700r/min，溶氧控制20～30%，ph7.0，温度30℃，通气培养36h，得到腈水解酶的发酵液，8000r/min离心20min收集菌体细胞；

4）催化制备2-氨基丁酸：将30g的3-吲哚丙腈加入1l50mm、ph7.5的磷酸缓冲液中，搅拌均匀，加入步骤3）收集的菌体细胞30g，温度25℃、维持转速在50r/min，反应5h，hplc测定2-氨基丁酸含量，检测方法：使用2,4-二硝基氟苯衍生化-hplc法测定化合物。液相色谱条件为c18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)，色谱条件：色谱柱c18柱(4.6mm×250mm，5m)；柱温25℃；检测波长360nm；流动相0.02mol/l磷酸氢二钠缓冲液(pbs，ph7.2)：乙腈(70∶30)；流速1.0ml/min。

结果：2-氨基丁酸含量为36.1g/l，对2-氨基丁腈摩尔转化率为98.2%。

实施例4菌株培养与肉桂酸的合成

1）菌株活化：挑取菌种划线接种至固体保藏培养基(酵母浸粉5g/l，蛋白胨10g/l，nacl5g/l，琼脂20g/l；ph7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min)，于28℃恒温培养箱培养20h；

2）液体种子制备：挑取1环活化菌株接种于装有50ml种子培养基(酵母浸粉5g/l，蛋白胨10g/l，nacl5g/l，ph7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min)的500ml三角瓶中，八层纱布封口，于26℃，180r/min摇床振荡培养24h，得液体种子；

3）液体发酵：按10%接种量向发酵培养基(葡萄糖10g/l，蛋白胨20g/l，酵母浸粉5g/l，mgso40.5g/l，硫酸铵7g/l，kh2po41g/l，cocl2100mg/l；ph7.0，115℃高压蒸汽灭菌20min)接入液体种子，转速700r/min，溶氧控制在20～30%，ph7.0，温度28℃，通气培养36h，得到腈水解酶的发酵液，8000r/min离心20min收集菌体细胞；

4）催化制备肉桂酸：将30g的肉桂腈加入1l50mm、ph7.5的磷酸缓冲液中，搅拌均匀，加入步骤3）收集的菌体细胞30g，温度25℃、维持转速在50r/min，反应5h，hplc测定肉桂酸含量，液相色谱条件为c18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)，柱温25℃；检测波长：285nm；流动相：乙腈：0.1%磷酸溶液(35:65，v/v）；流速：1.0ml/min。

结果：肉桂酸含量为31.7g/l，对肉桂腈摩尔转化率为92.3%。

实施例5底物特异性鉴定

1）菌株活化：挑取菌种划线接种至固体保藏培养基(酵母浸粉5g/l，蛋白胨10g/l，nacl5g/l，琼脂20g/l；ph7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min)，于28℃恒温培养箱培养20h；

2）液体种子制备：挑取1环活化菌株接种于装有50ml种子培养基(酵母浸粉5g/l，蛋白胨10g/l，nacl5g/l，ph7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min)的500ml三角瓶中，八层纱布封口，于28℃，200r/min摇床振荡培养18h，得液体种子；

3）液体发酵：按5%接种量向发酵培养基(葡萄糖10g/l，蛋白胨15g/l，酵母浸粉4g/l，mgso40.3g/l，硫酸铵5g/l，kh2po40.6g/l，cocl270mg/l；ph7.0，115℃高压蒸汽灭菌20min)接入液体种子，转速200～700r/min，溶氧控制20～30%，ph7.0，温度28℃，通气培养36h，得到腈水解酶的发酵液，8000r/min离心20min收集菌体细胞；

4）底物特异性鉴定：将30g的腈类化合物加入1l50mm、ph7.5的磷酸缓冲液中，搅拌均匀，加入步骤3）收集的菌体细胞30g，温度25℃、维持转速在50r/min，反应5h，hplc测定物质含量，下面显示本发明的枯草芽孢杆菌菌株ld003产生的腈水解酶对不同腈类化合物的水解效果。

底物相对酶活(100%)

3-吲哚丙腈100

2-氨基丁腈112.2±2.5

肉桂腈92.3±1.7

苯乙腈62.2±4.4

丙烯腈105.1±2.3

4-氰基吡啶23.3±10.1

3-氰基吡啶15.1±5.2

从以上对比可以看出，本发明的枯草芽孢杆菌菌株产生的腈水解酶对多种腈类化合物具有较强的水解作用，具有较宽的底物谱，其中包括3-吲哚丙腈、2-氨基丁腈、肉桂腈以及丙烯腈，但是对4-氰基吡啶和3-氰基吡啶水解效果不是很好，可见本发明的枯草芽孢杆菌菌株具有一定的特异性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>鲁东大学

<120>一株枯草芽孢杆菌及其应用

<130>2020

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1457

<212>dna

<213>bacillussubtilis

<400>1

gtgcaggcgggtgctaatacatgcaagtcgagcggacagatgggagcttgctccctgatg60

ttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccg120

ggaaaccggggctaataccggatggttgtttgaaccgcatggttcaaacataaaaggtgg180

cttcggctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggct240

caccaaggcaacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagac300

acggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctg360

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taactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgg540

gcgtaaagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggg600

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gaaggtgacaaataagt1457