犬圆环病毒实时荧光定量PCR引物组、探针及试剂盒

犬圆环病毒实时荧光定量pcr引物组、探针及试剂盒
技术领域
1.本发明涉及一种病毒检测引物组，含有该引物组的试剂盒及其应用，特别涉及一种用于犬圆环病毒检测的引物组，含有该引物组的试剂盒及其应用。本发明属于病毒检测技术领域。


背景技术：

2.圆环病毒属为球形，无囊膜的病毒，带有环状单链dna，基因组大小为2kb左右。基因组包含两个开放阅读框(orf)，orf1编码复制酶(v1)和orf2编码衣壳(c1)蛋白。在两个主要orf的5
′
和3
′
末端之间有两个非编码基因间区域(ir)。2012年，美国首次从205份犬血清检测到6株犬圆环病毒1型(canine circovirus genotype1，cacv1)阳性，随后欧洲、北美洲及亚洲等地区陆续从腹泻犬中发现该病毒，证明其在世界范围内广泛流行。临床上发现，犬圆环病毒(canine circovirus)是导致犬发生肉芽性淋巴结炎和坏死性血管炎的主要病原体，可引起胃肠炎、出血性腹泻等临床症状。
3.因此，建立灵敏且高度特异性的快速诊断方法变得势在必行。带有荧光探针系统的实时pcr具有快速，简单和可重现的特点，被广泛用于病毒检测。然而，迄今为止，还没有关于基于taqman方法的caninecv诊断方法的报道。在这项研究中，建立了基于taqman的实时pcr检测caninecv，随后也用于评估临床样品。
4.因此，急需建立一种诊断犬圆环病毒的高特异性的检测方法。


技术实现要素：

5.本发明旨在提供一种实时荧光定量pcr检测犬圆环病毒的引物组和探针。
6.本发明采取的技术方案是：一种犬圆环病毒实时荧光定量pcr引物组和探针，包括cacv-f：5
’-
gagatcgggaacaaggac-3’(seq id no.1)、cacv-r：5
’-
cataaattggggaacaggaata-3’(seq id no.2)和探针cacv-p：fam-5
′-
tctatcggcgtctcactcttatca-3
′-
bhq1(seq id no.3)。所述引物是根据genbank上公布的caninecv的rep基因全基因组序列的保守区序列所设计的。
7.本发明的引物组可以用于制备犬圆环病毒实时荧光定量pcr检测试剂盒，从而对犬圆环病毒进行病毒含量的检测。该试剂盒包括阳性对照标准品、pcr反应液和阴性对照；所述阳性对照标准品为含有犬圆环病毒rep基因序列的重组质粒pmd-19t-rep-cacv；所述pcr反应液包括提取的模板dna，如前所述的引物组和探针，酶和ddh2o。
8.用本发明的引物组制备的犬圆环病毒实时荧光定量pcr检测试剂盒，检测方法简便快捷，重复性好，敏感性高，特异性强，可以对犬圆环病毒进行快速的、高敏感的实时荧光定量pcr检测。
附图说明
9.图1是荧光定量pcr标准曲线；
图2是荧光定量pcr特异性实验图，其中标号1为阳性标准品，2-8分别为阴性对照，犬瘟热病毒，犬细小病毒，犬冠状病毒，犬库布病毒和犬星状病毒；图3是连续10个稀释度标准样品的灵敏性实验扩增曲线图。
具体实施方式
10.下面通过具体实施方式结合附图对本发明做进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。
11.实施例11、实时荧光定量pcr引物组及探针的设计针对犬圆环病毒rep基因设计特异性引物序列：上游引物：5
’-
gagatcgggaacaaggac-3’下游引物：5
’-
cataaattggggaacaggaata-3’探针：fam-5
’-
tctatcggcgtctcactcttatca-3
’-
bhq1上下游引物及探针由上海生工生物工程股份有限公司合成。
12.2、毒株实验中所使用犬圆环病毒样本收集于安徽省合肥市及马鞍山市某动物医院。
13.3、病毒核酸的提取将采取的样本按照天根基因组试剂盒(天根生物技术有限公司)说明书提取病毒基因组。
14.实施例2实时荧光定量pcr反应及标准曲线绘制利用核酸浓度测定仪测定重组质粒pmd-19t-rep-cacv的浓度，并计算得重组质粒拷贝数为2.056
×
10
11
copies/μl，将重组质粒10倍浓度梯度稀释建立标准曲线，横坐标代表质粒拷贝数的对数(x)，纵坐标为ct值(y)；在此基础上得到的相应的回归方程为y＝-3.129x+38.432，回归方程与标准曲线的相关系数r2为0.998，结果如图1所示。且在扩增过程当中无引物二聚体和非特异性扩增产物出现，所建立pcr方法的引物特异性好。
15.实施例3特异性、灵敏性以及重复性试验1、特异性实验采用建立的实时荧光定量pcr方法对犬圆环病毒阳性标准品、犬瘟热病毒(cdv)，犬细小病毒(cpv)、犬冠状病毒(ccv)、犬库布病毒(cakov)以及犬星状病毒(castv)的核酸进行扩增，同时设立阴性对照，结果如图2所示，除阳性标准品外均无扩增曲线，表明该方法具有良好的特异性。
16.2、灵敏性实验将已计算出拷贝数的重组质粒10倍梯度稀释，每个梯度浓度的重组质粒分别作为模板，在最佳反应条件下进行荧光定量pcr扩增，结果见图3。由图3可知，能检测出来最低的拷贝数为1
×
101copies/μl。
17.3、重复性实验以107、105和103copies/μl 3个浓度的重组治理样品作为模板，以最佳反应条件进行实
时荧光定量pcr的重复性实验，结果见表1。由表1可知，在重复性实验中变异系数均小于5％，表明建立的实时荧光定量pcr方法具有良好的重复性。
18.表1 荧光定量pcr重复性实验荧光定量pcr是在pcr反应过程中连续监测荧光型号的强弱来实时测定特异性产物的量，并据此推断监测病料的初始含毒量，不仅具有常规pcr技术的扩增高效率的特点，还具有高度特异性、光谱技术的高敏感性和精确性等特点，同时避免了后续电泳等步骤，减少了污染和人为操作带来的误差。并且在该实验过程中，证明了该方法具有高度的灵敏性和特异性，同时还要良好的重复性。同时可以根据标准曲线来进行准确的定量，即检测样品中所含有的初始病毒量。


技术特征：
1.一种用于犬圆环病毒检测得荧光定量pcr引物组和探针，所述引物由上游引物、下游引物和探针组成，所述的上游引物、下游引物和探针的核苷酸序列所示在可读序列表中。2.权利要求1所述的荧光定量pcr引物组和探针在制备检测犬圆环病毒试剂中的用途。3.一种用于犬圆环病毒检测的荧光定量pcr试剂盒，其特征在于，含有权利要求1中所述的引物组和探针。4.标准曲线的制作：利用一系列不同浓度梯度的阳性标准器作为模板，并以标准品拷贝数的对数作为x轴，ct值作为y轴绘制标准曲线。5.样本中病毒含量的计算：根据建立的标准曲线分别计算样本中的病毒拷贝数。

技术总结
本发明通过建立一种犬圆环病毒实时荧光定量PCR引物组、探针及试剂盒，该发明属于病毒分子生物学检测领域。该方法可快速检测犬圆环病毒。该方法简单快速，对单个样本检测时间为60分钟，其灵敏度可达10拷贝数/ul，针对较大的样本量可做到同时检测，具有良好的灵敏性、重复性、特异性以及稳定性，可实现对犬圆环病毒快速准确检测的目的。快速准确检测的目的。


技术研发人员：王勇 叶雨濛 李叶秋 崔佣楸
受保护的技术使用者：安徽农业大学
技术研发日：2020.10.24
技术公布日：2022/5/16