一种同时分离提取刺五加甙B和刺五加甙E的方法与流程

一种同时分离提取刺五加甙b和刺五加甙e的方法
技术领域
[0001]
本发明属于植物根茎提取加工领域，具体涉及一种同时分离提取刺五加甙b和刺五加甙e的方法。


背景技术：

[0002]
刺五加(acanthopanax senticosus)为五加科植物，生于森林或灌丛中，喜温暖湿润气候，耐寒、耐荫蔽，主要分布于黑龙江、吉林、辽宁、河北以及山西等地。
[0003]
刺五加甙b和甙e是刺五加根茎的主要活性成分。在药理上，刺五加甙b具有止血、抗肝毒、改善肝功能的作用；刺五加甙e具有免疫调节、固本强体、抗疲劳、提高机体适应能力、改善血液循环、预防精囊和前列腺萎缩的作用。临床上，包含刺五加甙b和刺五加甙e的刺五加注射液已经被广泛用于短暂性脑缺血、脑动脉硬化、脑血栓、脑栓塞等疾病的治疗。但是，现在临床应用的刺五加注射液为混合物，除主要活性成分甙b和甙e外，还含有甙a、甙b1、甙c、甙d和甙e等；使用刺五加注射液时，可能会由于成分复杂而出现不明原因的不良反应。因此将刺五加甙b和刺五加甙e分离提取，以针对性的应用于临床，具有提升用药效果、降低临床应用风险的重要意义。
[0004]
相关技术常采用醇水溶液提取，并经大孔树脂纯化的方式，获取刺五加混甙，但是未将其中主要活性成分，刺五加甙b和刺五加甙e分离提取，给刺五加提取物的临床应用带来了不安全性。或者只提取部分刺五加甙b，而舍弃了其他活性成分，造成了资源的浪费。


技术实现要素：

[0005]
本发明旨在至少解决现有技术中存在的上述技术问题之一。为此，本发明提供了一种同时分离提取刺五加甙b和刺五加甙e的方法。
[0006]
一种同时分离提取刺五加甙b和刺五加甙e的方法，包括以下步骤：
[0007]
s1.以乙醇水溶液a回流提取刺五加根茎粉，获取提取液；
[0008]
s2.减压浓缩所述提取液，得浓缩提取液，冷却后，所述浓缩提取液固液分离，得一次清液；
[0009]
s3.将所述一次清液过非极性树脂，并依次用纯水、乙醇水溶液b洗脱，收集乙醇水洗脱液；
[0010]
s4.减压浓缩所述乙醇水洗脱液至浸膏状，得刺五加浸膏；
[0011]
s5.在所述刺五加浸膏中加入醇溶液搅拌、降温后，固液分离，得渣和二次清液；
[0012]
s6.减压浓缩所述二次清液，得浓缩析出物；
[0013]
s7.以热的乙醇水溶液c溶解所述浓缩析出物，冷却结晶，晶体干燥后，即为所述刺五加甙b；
[0014]
s8.以热的乙醇水溶液d溶解所述的渣，冷却结晶，晶体干燥后，即为所述刺五加甙e；
[0015]
所述的刺五加甙b，纯度≥97.65％，收率≥88.3％；
[0016]
所述的刺五加甙e，纯度≥95.31％，收率≥89.5％。
[0017]
根据本发明的一种实施方式，步骤s1所述的乙醇水溶液a，乙醇的体积浓度为40～90％。
[0018]
根据本发明的一种实施方式，步骤s1所述的乙醇水溶液a，添加量为：每克所述刺五加根茎粉添加8～12ml所述乙醇水溶液a。
[0019]
根据本发明的一种实施方式，步骤s1所述的回流提取，温度为60～85℃。
[0020]
根据本发明的一种实施方式，步骤s1所述的回流提取，提取次数为2～3次，单次提取时间为1～2h。
[0021]
根据本发明的一种实施方式，步骤s1所述的提取液，为各次回流提取液的混合液。
[0022]
根据本发明的一种实施方式，若所述乙醇水溶液a的浓度＜40％，所述回流提取温度＜60℃，所述提取次数＜2，则不能完全提取刺五加根茎粉中的有效成分；若所述乙醇水溶液a的浓度＞90％，所述回流提取温度＞85℃，所述提取次数＞3，会导致溶剂浪费，成本提高，并且未提升刺五加根茎粉中的有效成分的提取效率。
[0023]
根据本发明的一种实施方式，步骤s2所述的减压浓缩，终点为浓缩提取液中无醇味，即以酒精计检测，测试值约为0。
[0024]
根据本发明的一种实施方式，步骤s2所述的冷却，温度为4～30℃。
[0025]
根据本发明的一种优选的实施方式，步骤s2所述的冷却，温度为4～20℃。
[0026]
所述冷却的目的是，降低所述浓缩提取液中杂质的溶解度，并通过所述固液分离的操作，达到一次除杂的目的。
[0027]
根据本发明的一种实施方式，步骤s2所述的固液分离为重力沉降、离心、过滤中的一种。
[0028]
根据本发明的一种实施方式，步骤s3所述的非极性树脂，为d101、lx-100b等大孔非极性树脂。
[0029]
根据本发明的一种实施方式，步骤s3所述的纯水，体积用量为1～3bv。
[0030]
步骤s3所述的纯水，洗脱的主要成分为刺五加多糖；所述纯水洗脱的目的是，去除刺五加多糖杂质，达到二次除杂的目的。
[0031]
根据本发明的一种实施方式，步骤s3所述的乙醇水溶液b，乙醇的体积浓度为40～70％。
[0032]
根据本发明的一种实施方式，步骤s3所述的乙醇水溶液b，体积用量为2～4bv。
[0033]
根据本发明的一种实施方式，步骤s4所述的刺五加浸膏，密度为1.1～1.3g/cm3。
[0034]
根据本发明的一种优选的实施方式，步骤s4所述的刺五加浸膏，密度为1.25～1.3g/cm3。
[0035]
根据本发明的一种实施方式，步骤s5所述的醇溶液，为体积浓度是50％～100％的甲醇水溶液或体积浓度是30％～70％的乙醇水溶液。
[0036]
若所述甲醇水溶液浓度＜50％或乙醇水溶液浓度＜30％，则刺五加甙e的析出效果变差，不能有效分离刺五加甙b和甙e。
[0037]
根据本发明的一种实施方式，步骤s5所述的醇溶液，添加量为：每克所述刺五加浸膏，添加5～10ml所述醇溶液。
[0038]
根据本发明的一种优选的实施方式，步骤s5所述的醇溶液，添加量为：每克所述刺
五加浸膏，添加8～10ml所述醇溶液。
[0039]
根据本发明的一种实施方式，步骤s5所述的固液分离为重力沉降、离心、过滤中的一种。
[0040]
步骤s5中，当所述的固液分离方法为所述的重力沉降时，所述降温后，体系需静置20～30min，以达到固液分层的目的。
[0041]
根据本发明的一种实施方式，步骤s5所述的降温，温度为4～40℃。
[0042]
根据本发明的一种实施方式，步骤s5所述的降温，温度为4～20℃。
[0043]
根据本发明的一种实施方式，步骤s5所述的降温，若温度＞40℃，则会导致刺五加甙e随刺五加甙b一起溶解，达不到分离效果。
[0044]
根据本发明的一种实施方式，步骤s5所述的搅拌，时间为5～10min。
[0045]
根据本发明的一种实施方式，刺五加甙b和刺五加甙e分离的原因是，在4～40℃温度下，刺五加甙e难溶于体积浓度为50％～100％的甲醇或体积浓度为30％～70％的乙醇水溶液，而刺五加甙b则易溶于所述醇溶液。
[0046]
根据本发明的一种实施方式，步骤s7所述的乙醇水溶液c，温度为50～70℃，乙醇的体积浓度为90～100％。
[0047]
根据本发明的一种实施方式，步骤s7所述的乙醇水溶液c，添加量为：每克所述浓缩析出物，添加5～10ml所述乙醇水溶液c。
[0048]
根据本发明的一种实施方式，步骤s7所述的冷却结晶，条件为将体系冷却至室温并静置12～24h。
[0049]
根据本发明的一种实施方式，步骤s8所述的乙醇水溶液d，温度为50～70℃，乙醇的体积浓度为90～100％。
[0050]
根据本发明的一种实施方式，步骤s8所述的乙醇水溶液d，添加量为：每克所述渣，添加5～10ml所述乙醇水溶液d。
[0051]
根据本发明的一种实施方式，步骤s8所述的冷却结晶，条件为将体系冷却至室温。
[0052]
所述冷却结晶的作用是，进一步分别纯化刺五加甙b和刺五加甙e，达到三次除杂的目的。
[0053]
根据本发明的一种实施方式，所述的减压浓缩，浓缩温度为50℃～70℃，压力为-0.06mpa～-0.1mpa。
[0054]
根据本发明的一种实施方式，所述的减压浓缩，蒸出的醇，均回收利用。
[0055]
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
[0056]
(1)本发明采用简单的加醇分离法，利用刺五加甙e与刺五加甙b在特定浓度醇溶液中溶解度不同的特点，高效分离了刺五加甙b和刺五加甙e。
[0057]
(2)本发明步骤s3采用非极性树脂纯化一次清液，得到的乙醇水洗脱液中，刺五加总甙含量＞74.87％。
[0058]
(3)本发明通过步骤s2固液分离的一次除杂，步骤s3纯水洗脱的二次除杂，以及步骤s7和s8冷却结晶的三次除杂，提供了纯度高达98.24％的刺五加甙b以及纯度高达96.12％的五加甙e。
[0059]
(4)通过控制回流提取以及分离提纯的过程参数，使刺五加甙b的收率高达92.7％，刺五加甙e的收率高达92.1％。
[0060]
(5)本发明所用的醇与水均可回收利用，降低了生产成本。
[0061]
(6)本发明提供的方法，可操作性强，成本低，易工业化生产，且仅用到了溶剂甲醇、乙醇和水，对环境友好。
附图说明
[0062]
图1是本发明的流程示意图。
[0063]
图2是刺五加甙b和刺五加甙e的结构式。
[0064]
图3是实施例3所得刺五加甙e的高效液相色谱图。
[0065]
图4是实施例3所得刺五加甙b的高效液相色谱图。
具体实施方式
[0066]
以下是本发明的具体实施例，并结合实施例和附图对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
[0067]
以下所述各实施例的刺五加原料购自亳州地区，其中刺五加甙b为0.79％，刺五加甙e含量为0.3％；所用d101、lx-100b大孔非极性树脂购自西安蓝晓科技新材料股份有限公司。
[0068]
实施例1
[0069]
本例提供一种同时分离提取刺五加甙b和刺五加甙e的方法，具体包括以下步骤：
[0070]
s1.向100g刺五加根茎粉中，添加800ml体积浓度为40％的乙醇水溶液；并于80℃下，对刺五加根茎粉进行2次回流提取，每次提取时间为2h；收集所有提取液；
[0071]
s2.将步骤s1所得提取液减压浓缩至无醇味后，静置冷却至4℃，重力沉降，固液分层，取上清液备用；蒸出的乙醇回收利用；
[0072]
s3.将步骤s3所得上清液上d101大孔非极性树脂后，依次用3bv的纯水，和2bv体积浓度为40％乙醇水溶液进行洗脱，弃去水洗脱液，收集乙醇水洗脱液，刺五加总甙含量为75.32％；
[0073]
s4.减压浓缩步骤s3所得乙醇水洗脱液，得密度为1.3g/cm3的刺五加浸膏；
[0074]
s5.在步骤s5所得的刺五加浸膏中，加入体积浓度为80％的甲醇水溶液，其中甲醇水溶液的添加量为：每克刺五加浸膏，加8ml甲醇水溶液；充分搅拌5min后，冷却至4℃，放置20min后，重力沉降，固液分层，分别收集上清液和渣；
[0075]
s6.60℃下，减压浓缩步骤s5所得上清液至晶体析出；蒸出的甲醇回收利用；
[0076]
s7.70℃下，以95％的乙醇水溶液搅拌溶解步骤s6所得的晶体，其中乙醇水溶液添加量为：每克晶体添加5ml乙醇水溶液；放置12h后，晶体结晶析出，收集晶体并干燥即得刺五加甙b；
[0077]
s8.50℃下，向步骤s5所得的渣中，加入浓度为95％的乙醇水溶液，其中乙醇水溶液添加量为：每克渣添加8ml乙醇水溶液；充分搅拌后，放置冷却结晶，结晶物干燥即得刺五加甙e。
[0078]
具体的操作流程如图1所示。
[0079]
实施例2
[0080]
本例提供一种同时分离提取刺五加甙b和刺五加甙e的方法，具体包括以下步骤：
[0081]
s1.向100g刺五加根茎粉中，添加800ml体积浓度为80％的乙醇水溶液；并于60℃下，对刺五加根茎粉进行3次回流提取，每次提取时间为1h；收集所有提取液；
[0082]
s2.将步骤s1所得提取液减压浓缩至无醇味后，静置冷却至10℃，重力沉降，固液分层，取上清液备用；蒸出的乙醇回收利用；
[0083]
s3.将步骤s3所得上清液上d101大孔非极性树脂后，依次用2bv的纯水，和3bv体积浓度为70％乙醇水溶液进行洗脱，弃去水洗脱液，收集乙醇水洗脱液，刺五加总甙含量为74.87％；
[0084]
s4.减压浓缩步骤s3所得乙醇水洗脱液，得密度为1.3g/cm3的刺五加浸膏；
[0085]
s5.在步骤s5所得的刺五加浸膏中，加入体积浓度为70％的甲醇水溶液，其中甲醇水溶液的添加量为：每克刺五加浸膏，加8ml甲醇水溶液；充分搅拌5min后，冷却至10℃，放置20min后，重力沉降，固液分层，分别收集上清液和渣；
[0086]
s6.60℃下，减压浓缩步骤s5所得上清液至晶体析出；蒸出的甲醇回收利用；
[0087]
s7.70℃下，以95％的乙醇水溶液搅拌溶解步骤s6所得的晶体，其中乙醇水溶液添加量为：每克晶体添加10ml乙醇水溶液；放置24h后，晶体结晶析出，收集晶体并干燥即得刺五加甙b；
[0088]
s8.50℃下，向步骤s5所得的渣中，加入浓度为95％的乙醇水溶液，其中乙醇水溶液添加量为：每克渣添加8ml乙醇水溶液；充分搅拌后，放置冷却结晶，结晶物干燥即得刺五加甙e。
[0089]
实施例3
[0090]
本例提供一种同时分离提取刺五加甙b和刺五加甙e的方法，具体包括以下步骤：
[0091]
s1.向100g刺五加根茎粉中，添加1200ml体积浓度为50％的乙醇水溶液；并于70℃下，对刺五加根茎粉进行2次回流提取，每次提取时间为1h；收集所有提取液；
[0092]
s2.将步骤s1所得提取液减压浓缩至无醇味后，静置冷却至15℃，重力沉降，固液分层，取上清液备用；蒸出的乙醇回收利用；
[0093]
s3.将步骤s3所得上清液上d101大孔非极性树脂后，依次用3bv的纯水，和4bv体积浓度为50％乙醇水溶液进行洗脱，弃去水洗脱液，收集乙醇水洗脱液，刺五加总甙含量为75.16％；
[0094]
s4.减压浓缩步骤s3所得乙醇水洗脱液，得密度为1.25g/cm3的刺五加浸膏；
[0095]
s5.在步骤s5所得的刺五加浸膏中，加入体积浓度为90％的甲醇水溶液，其中甲醇水溶液的添加量为：每克刺五加浸膏，加9ml甲醇水溶液；充分搅拌10min后，冷却至20℃，放置20min后，重力沉降，固液分层，分别收集上清液和渣；
[0096]
s6.60℃下，减压浓缩步骤s5所得上清液至晶体析出；蒸出的甲醇回收利用；
[0097]
s7.70℃下，以95％的乙醇水溶液搅拌溶解步骤s6所得的晶体，其中乙醇水溶液添加量为：每克晶体添加10ml乙醇水溶液；放置24h后，晶体结晶析出，收集晶体并干燥即得刺五加甙b；
[0098]
s8.60℃下，向步骤s5所得的渣中，加入浓度为95％的乙醇水溶液，其中乙醇水溶液添加量为：每克渣添加8ml乙醇水溶液；充分搅拌后，放置冷却结晶，结晶物干燥即得刺五加甙e。
[0099]
本例所得刺五加甙e的高效液相色谱图如图3所示，刺五加甙b的高效液相色谱图
如图4所示。
[0100]
实施例4
[0101]
本例提供一种同时分离提取刺五加甙b和刺五加甙e的方法，具体包括以下步骤：
[0102]
s1.向100g刺五加根茎粉中，添加1200ml体积浓度为90％的乙醇水溶液；并于85℃下，对刺五加根茎粉进行3次回流提取，每次提取时间为2h；收集所有提取液；
[0103]
s2.将步骤s1所得提取液减压浓缩至无醇味后，静置冷却至20℃，离心，固液离，取上清液备用；蒸出的乙醇回收利用；
[0104]
s3.将步骤s3所得上清液上d101大孔非极性树脂后，依次用2bv的纯水，和4bv体积浓度为70％乙醇水溶液进行洗脱，弃去水洗脱液，收集乙醇水洗脱液，刺五加总甙含量为74.89％；
[0105]
s4.减压浓缩步骤s3所得乙醇水洗脱液，得密度为1.25g/cm3的刺五加浸膏；
[0106]
s5.在步骤s5所得的刺五加浸膏中，加入体积浓度为100％的甲醇水溶液，其中甲醇水溶液的添加量为：每克刺五加浸膏，加5ml甲醇水溶液；充分搅拌10min后，冷却至4℃，放置30min后，重力沉降，固液分层，分别收集上清液和渣；
[0107]
s6.60℃下，减压浓缩步骤s5所得上清液至晶体析出；蒸出的甲醇回收利用；
[0108]
s7.70℃下，以95％的乙醇水溶液搅拌溶解步骤s6所得的晶体，其中乙醇水溶液添加量为：每克晶体添加8ml乙醇水溶液；放置17h后，晶体结晶析出，收集晶体并干燥即得刺五加甙b；
[0109]
s8.60℃下，向步骤s5所得的渣中，加入浓度为95％的乙醇水溶液，其中乙醇水溶液添加量为：每克渣添加8ml乙醇水溶液；充分搅拌后，放置冷却结晶，结晶物干燥即得刺五加甙e。
[0110]
对比例1
[0111]
本例提供一种同时分离提取刺五加甙b和刺五加甙e的方法，具体步骤与实施例4的区别为：
[0112]
步骤s4中，减压浓缩步骤s3所得乙醇水洗脱液，得密度为1.01g/cm3的刺五加浸膏。
[0113]
对比例2
[0114]
本例提供一种同时分离提取刺五加甙b和刺五加甙e的方法，具体步骤与实施例4的区别为：
[0115]
步骤s5：在步骤s4所得的刺五加浸膏中，加入体积浓度为40％的甲醇水溶液，其中甲醇水溶液的添加量为：每克刺五加浸膏，加8ml甲醇水溶液。
[0116]
检测例
[0117]
本例提供实施例1～4以及对比例1～2所得刺五加甙b和刺五加甙e的表征。
[0118]
其中刺五加甙b和刺五加甙e的结构式如图2所示。
[0119]
采用2020版的《中国药典刺五加浸膏含量检测》所提供的方法，检测实施例1～4以及对比例1～2所得刺五加甙b和刺五加甙e的纯度。
[0120]
依据式(1)所示公式计算，实施例1～4以及对比例1～2所得刺五加甙b和刺五加甙e的收率。
[0121][0122]
其中m
(实收甙)
为经步骤s1～s8分离提纯后，获取的刺五加甙b或刺五加甙e的质量与相应纯度的乘积；
[0123]
m
(根茎粉)
为试验所用根茎粉的质量；
[0124]
wt％为原料根茎粉中，对应的刺五加甙b或刺五加甙e的质量含量百分数。
[0125]
测试结果如表1所示。
[0126]
表1实施例1～4以及对比例1～2所得刺五加甙b和刺五加甙e的测试结果。
[0127][0128][0129]
由实施例1～4步骤s3可知，经大孔非极性树脂纯化后，得到的乙醇水洗脱液中，刺五加总甙含量＞74.87％，说明大孔非极性树脂纯化步骤，可有效去除刺五加洗脱液中的水溶性杂质，提升刺五加甙b和刺五加甙e的纯度。
[0130]
根据表1所示结果可知：(1)本发明提供的加醇溶液分离的方法，可有效分离刺五加甙b和刺五加甙e，其中刺五加甙b的纯度高达98.24％；刺五加甙e的纯度高达96.12％；(2)若刺五加浸膏的密度不在本发明提供的范围内(对比例1)，则会影响刺五加甙b和刺五加甙e加醇分离的效果；(3)若醇溶液的浓度不在本发明提供的范围内(对比例2)，同样会影响刺五加甙b和刺五加甙e加醇分离的效果。
[0131]
综上，本发明提供的，同时分离提取刺五加甙b和刺五加甙e的方法，在保证收率的前提下，可将两者有效分离；其中刺五加甙b的收率高达92.7％，纯度高达98.24％；刺五加甙e的收率高达92.26％，纯度高达96.12％。
[0132]
上面结合实施例对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。