一种前白蛋白检测分子印迹聚合物及其用途和检测试剂盒的制作方法

本申请涉及分子印迹技术领域，尤其涉及一种前白蛋白检测分子印迹聚合物及其用途和检测试剂盒。

背景技术：

前白蛋白(pa)是一种负急性时相反应蛋白，当人体出现营养不良或炎症时，血清中的pa浓度明显下降。研究表明，当血清中的pa浓度大于170μg/ml时，代表人体没有出现疾病的风险或者风险很小；当pa浓度在之间时，表明人体有可能会出现营养不良或其他疾病，需要预防；当血清中pa浓度小于110μg/ml时，表明人体出现疾病的风险很大，此时应该及时检查治疗。pa的半衰期很短，在人体内的代谢很迅速，其转化率每日可达36.6％，因此，pa对营养状况的急性改变很敏感，在蛋白质摄入量降低或热能缺乏的情况下(如营养不良、肝功能损伤、外伤及感染等症状的出现)血清中的pa浓度迅速降低，当蛋白质或热能摄入增加时，pa浓度在3天内就会有明显的回升。pa浓度降低的幅度与营养不良、肝实质损害的程度等密切相关，对于了解人体蛋白质营养不良和肝功能障碍等有重要作用，可以作为监测营养状况及肝功能受损的重要诊断指标。

荧光检测方法由于其响应速度快，灵敏度高，已成功用于蛋白质分析。然而，荧光生物传感系统常常受到可能影响荧光强度的共存物质的干扰。分子印迹聚合物是一种通过以特定的目标分子为模板，制备具有与模板分子互补的预定结合位点的人造受体，具有高选择性。分子印迹聚合物还具有稳定性高，亲和力强，易于制备等显著的优点。目前，分子印迹聚合物已被应用于抗体模拟物，固相萃取，化学/生物传感和药物输送等方面。

近年来，荧光型分子印迹聚合物因其灵敏度高，选择性高，取样少，操作简便等特点，成为蛋白质检测领域的研究热点。常用于制备荧光型分子印迹聚合物的荧光材料有有机染料和量子点。但有机染料光稳定性较差并具有潜在的毒性。量子点由于其良好的光学性能和较高的化学稳定性，已经成为制备荧光分子印迹聚合物最广泛使用的荧光材料之一。尽管基于量子点的分子印迹聚合物具有高光学效率和低检测限，但量子点仍然存在固有的潜在毒性和环境危害性。因此，开发生态友好的新型荧光型分子印迹是目前发展趋势之一。

技术实现要素：

为了解决上述的技术问题，本申请的目的是提供一种前白蛋白检测分子印迹聚合物，与血液中的前白蛋白能够发生特异性结合，导致纳米晶荧光猝灭，荧光强度变化幅度与前白蛋白的浓度密切相关，通过拟合纳米晶荧光强度和前白蛋白浓度的关系曲线，能够很好的应用于前白蛋白的定量检测，具有毒性小、生物相容性好、选择性高、非接触式与高准确度的优势。

为了实现上述的目的，本申请采用了以下的技术方案：

一种前白蛋白检测分子印迹聚合物，该分子印迹聚合物分子式如下：ca0.2sr0.8er3f11@mip，以ca0.2sr0.8er3f11纳米晶为载体，3-氨基丙基三乙氧基硅烷为功能单体，四乙氧基硅烷为交联剂，前白蛋白为模板分子制备而成。

优选，所述纳米晶材料为水溶性纳米晶材料，其由油性纳米晶材料通过hcl溶液处理去除表面的油酸配体。

进一步，本申请提供了一种前白蛋白检测分子印迹聚合物的制备方法，该方法包括以下的步骤：

1)0.2毫摩尔乙酸钙，0.8毫摩尔乙酸锶，3毫摩尔乙酸铒，9毫摩尔氟化铵，15毫升油酸和25毫升十八烯加入到三口烧瓶中，在氮气保护气氛条件下，于120℃搅拌并保温40分钟，迅速升温至310℃，并保温90分钟；

2)待溶液冷却至室温后，产物用乙醇和环己烷的混合液洗涤3-5次，并将纳米晶分散在4毫升环己烷溶液中备用；

3)取100μl氨水溶液(25％，w/v)和100μl四乙氧基硅烷加入到20ml水性纳米晶溶液中，在室温下搅拌1h，然后将20mg前白蛋白和80μl3-氨基丙基三乙氧基硅烷加入到上述混合液中，室温下搅拌2h；

4)将所得产物进行离心分离，获得固体产物，用1mnacl溶液反复洗涤，直到上清液中检测不到模板蛋白，最后将分子印迹聚合物在60℃真空干燥8h。

优选，该方法还包括以下表面处理步骤：将10-100mg油性氟氯化物纳米晶分散在1-3ml乙醇与0.2mol/lhcl0.5-1ml的混合液中，将混合液超声5-10min，室温搅拌10-15小时，然后加入乙醇洗涤、离心以及烘干等处理后即可获得水性纳米晶。

进一步，本申请提供了所述纳米晶材料在血液里的前白蛋白检测中的应用。

进一步，本申请提供了一种前白蛋白荧光检测试剂盒，该试剂盒包括所述的纳米晶材料。

本文通过共沉淀法与表面处理工艺，制备出不含配体的ca0.2sr0.8er3f11纳米晶，然后以该纳米晶为载体，3-氨基丙基三乙氧基硅烷(aptes)为功能单体，四乙氧基硅烷(teos)为交联剂，前白蛋白为模板分子制备出ca0.2sr0.8er3f11@mip分子印迹聚合物。基于上转换纳米晶材料，该分子印迹聚合物在808纳米激光器激发条件下能产生明亮的上转换发光，且对生物组织细胞的损伤较小。在与含前白蛋白的血液样品混合后，能够选择特异性结合前白蛋白，从而导致荧光强度大幅下降，发生荧光猝灭现象，且荧光强度下降的幅度与前白蛋白的浓度密切相关，因此能够很好的应用于前白蛋白的定量检测，具有良好的发展前景。

附图说明

图1(a)和(b)分别为产物的xrd图谱和透射电子显微镜图。

图2产物在808纳米激光器激发条件下的上转换发射谱。

图3左图与右图分别为ca0.2sr0.8er3f11纳米晶与srer3f11纳米晶溶液的上转换荧光照片。

图4ca0.2sr0.8er3f11@mip和ca0.2sr0.8er3f11@nip的荧光强度随孵育时间的变化曲线。

图5ca0.2sr0.8er3f11@mip的荧光强度随前白蛋白浓度变化的曲线。

图6ca0.2sr0.8er3f11@mip和ca0.2sr0.8er3f11@nip对前白蛋白，球蛋白(igg)，血红蛋白(hgb)吸附性能。

具体实施方式

1实验部分

1.1主要仪器和试剂：乙酸钙(99.0％)，乙酸锶(99.0％)，乙酸铒(99.0％)，氟化铵，油酸(90.0％)，十八烯(90.0％)，前白蛋白，球蛋白(igg)和血红蛋白(hgb)购买于sigma-aldrich公司；环己烷，无水乙醇和浓盐酸购买于国药集团化学试剂有限公司；3-氨基丙基三乙氧基硅烷(aptes)为功能单体，四乙氧基硅烷(teos)和氨水溶液(nh3·h2o)购自长沙化学试剂公司。

1.2ca0.2sr0.8er3f11纳米晶的制备

0.2毫摩尔乙酸钙，0.8毫摩尔乙酸锶，3毫摩尔乙酸铒，9毫摩尔氟化铵，15毫升油酸和25毫升十八烯加入到三口烧瓶中，在氮气保护气氛条件下，于120℃搅拌并保温40分钟，迅速升温至310℃，并保温90分钟。待溶液冷却至室温后，产物用乙醇和环己烷的混合液洗涤3-5次，并将纳米晶分散在4毫升环己烷溶液中备用。

纳米晶表面处理：将10-100mg油性氟氯化物纳米晶分散在1-3ml乙醇与hcl(0.2mol/l,0.5-1ml)的混合液中，将混合液超声5-10min，室温搅拌10-15小时，然后加入乙醇洗涤、离心以及烘干等处理后即可获得水性纳米晶。

1.3表征仪器

x射线衍射图谱(brukerd8advance，cu-kα)，透射电子显微镜(tem,feitecnaig2f20)，光谱仪(flurohub-b,horibajobinyvon)，功率为50w的紫外灯。

x射线衍射样品的制备：将烘干的纳米晶铺满样品支架的凹槽；

透射电子显微镜样品的制备：将每次合成的全部纳米晶溶于4毫升乙醇溶液中，超声5分钟后，滴3-6滴液体于超薄碳膜上。

1.4ca0.2sr0.8er3f11@mip分子印迹聚合物的制备

取100μlnh3·h2o(25％，w/v)和100μlteos加入到20ml水性纳米晶溶液中，在室温下搅拌1h，然后将20mgpa和80aptes加入到上述混合液中，室温下搅拌2h；将所得产物进行离心分离，获得固体产物，用1mnacl溶液反复洗涤，直到上清液中检测不到模板蛋白，最后将分子印迹聚合物在60℃真空干燥8h。

在不加入模板分子，其他条件相同的情况下，制备非印迹聚合物(ca0.2sr0.8er3f11@nip)。

1.5前白蛋白检测

将ca0.2sr0.8er3f11@mip分子印迹聚合物溶于水溶液中，分成若干份，加入不同浓度的前白蛋白，在808纳米激光器激发条件下，表征产物的上转换发光性能，并拟合分子印迹聚合物的荧光强度比随前白蛋白浓度变化的关系曲线。

1.6样品检测

以正常成年人血液作为实际样品，首先用磷酸缓冲液(pbs，0.2m，ph8.0)将人血液稀释至100倍(v/v)，在室温下静置。然后将20mgca0.2sr0.8er3f11@mip加入到8ml已经稀释后的血液样品中，震荡吸附16min。用荧光光谱仪检测其荧光强度。采用加标回收法进一步验证ca0.2sr0.8er3f11@mip的实际应用能力，加标浓度分别为0.05，0.10，0.15μm，总体积控制为8ml。

2.数据分析与讨论

ca0.2sr0.8er3f11纳米晶的x射线衍射图谱如图1a所示，所有衍射峰均与标准pdf卡片jcpds53-1219号一一对应，且无多余的衍射峰，表明我们得到的产物为纯六方相。透射电子显微镜分析结果表明产物为均匀的六方形块状，分散性很好。需要说明的是，表面修饰后的纳米晶晶体结构没有发生改变。

在808纳米近红外光激发条件下，产物在绿光(中心波长约为540nm)和红光区域(中心波长包含654nm)表现出很强的上转换发光(图2)，绿光对应于er³⁺离子²h11/2,⁴s3/2→⁴i15/2的跃迁，红光对应于⁴f9/2→⁴i15/2的跃迁。980纳米波长的光子容易被水吸收，产生大量的热，容易对无生物组织细胞造成损伤，而水对808纳米波长的光子吸收很弱，更适合生物分子的检测^[11]；目前808纳米激发的纳米材料主要是通过多层核壳结构掺杂nd³⁺-yb³⁺-er³⁺三种离子来实现，制备过程繁琐，需要逐层包覆壳层纳米晶，而本文提出的纳米晶材料采用一步合成法，无需壳层包覆，制备工艺简单。

为了说明基质中ca²⁺离子掺杂的重要性，我们制备了纯srer3f11纳米晶，产物在808纳米激光器激发条件下，肉眼不能看见上转换发光(图3右)，而在同样的激发功率条件下，ca0.2sr0.8er3f11纳米晶能明显看到绿色上转换发光(图3左)。以上现象的解释如下：er³⁺离子的发光源于4f-4f能级的跃迁，而4f电子受外层5d电子能级的保护，且属于禁阻跃迁，ca²⁺离子与sr²⁺离子的离子半径相差较大，ca²⁺离子掺杂能够使基质晶格产生一定的畸变，增大晶场强度，从而在一定程度上增大4f-4f能级的电子跃迁几率。因此，ca²⁺离子掺杂能够显著提高er³⁺离子在808纳米激发条件下的上转换发光。

图4显示了ca0.2sr0.8er3f11@mip和ca0.2sr0.8er3f11@nip对pa荧光检测的响应时间。在ca0.2sr0.8er3f11@mip溶液中加入pa，观察到荧光强度降低，并在16分钟后荧光强度保持稳定。相比之下，ca0.2sr0.8er3f11@nip的荧光强度以较快的速度下降，在孵育14分钟后达到恒定值。这归因于ca0.2sr0.8er3f11@nip对pa的吸附是表面的非特异性吸附。因此，选择16分钟作为实验的最佳响应时间。

如图5所示，在pa浓度范围为50-400μg/ml时，随着pa的浓度增加，ca0.2sr0.8er3f11@mip的荧光强度逐渐降低，且ca0.2sr0.8er3f11@mip的荧光强度与pa的浓度之间存在线性关系，相关系数为0.991，公式为y＝-2.9183x+1475.3。

为了评估ca0.2sr0.8er3f11@mip的选择性，用浓度为5μm的pa，igg和hgb溶液进行吸附研究。如图6所示，pa对ca0.2sr0.8er3f11@mip的荧光猝灭远远高于igg和hgb，并且对ca0.2sr0.8er3f11@nip荧光影响不大。igg和hgb对ca0.2sr0.8er3f11@mip和ca0.2sr0.8er3f11@nip的荧光强度影响相近。结果表明，ca0.2sr0.8er3f11@mip对pa的选择性很强。ca0.2sr0.8er3f11@mip的高特异性可能是由于印迹聚合物中的印迹孔穴只适合于模板分子pa。因此，其他类似物不能被紧紧地束缚在印迹孔穴内。

可再生性是评价ca0.2sr0.8er3f11@mip的实际应用价值中的一个重要参数。使用相同批次的ca0.2sr0.8er3f11@mip研究其在pa溶液(8.0μm)和100倍稀释的血液中的吸附和解吸附后的荧光强度。结果表明经过5次循环后ca0.2sr0.8er3f11@mip分别保持了原始荧光强度的97.1％和96.8％，这表明ca0.2sr0.8er3f11@mip具有了良好的回收效率。重现性对于ca0.2sr0.8er3f11@mip的实际应用价值也是重要的指标。重复性实验是通过使用五个不同时间通过相同过程制备的ca0.2sr0.8er3f11@mip来进行的。通过对每个批次制备的ca0.2sr0.8er3f11@mip进行三次平行测定，结果显示ca0.2sr0.8er3f11@mip具有令人满意的重现性，rsd小于1.7％。

为了验证ca0.2sr0.8er3f11@mip从实际样品中灵敏检测目标蛋白质的实际应用能力，100倍稀释度正常成年人血液作为实际样品。首先通过hplc和ca0.2sr0.8er3f11@mip检测100倍稀释度中的pa浓度，结果分别为0.0289±0.005μm和0.0301±0.02μm。结果相近表明ca0.2sr0.8er3f11@mip可用于检测pa。如表1所示，血液中pa的回收率范围为进一步说明ca0.2sr0.8er3f11@mip成功应用于生物样品中pa的检测。

表1100倍稀释正常成年人血液中pa的分析结果(n＝5)

3.结论

本文以一种新型上转换纳米晶为荧光载体，aptes为功能单体，teos为交联剂，通过溶胶凝胶法成功制备新型荧光印迹聚合物。在808纳米激光器激发条件下，能够产生明亮的上转换发光。在分子印迹聚合物溶液中加入前白蛋白后，上转换发光强度减弱，降低的幅度与加入的前白蛋白的浓度有关，前白蛋白浓度越高，荧光强度下降幅度越大，并且在一定浓度范围内存在良好的线性关系，能够很好地应用于前白蛋白的定量检测。这种荧光检测法具有生物相容性好、选择性高、准确度高以及响应快等优势。

以上为对本申请实施例的描述，通过对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本申请。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的。本文中所定义的一般原理可以在不脱离本申请的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本申请将不会被限制于本文所示的这些实施列，而是要符合与本文所公开的原理和新颖点相一致的最宽的范围。