一种发酵合成四氢嘧啶的酿酒酵母工程菌株的制作方法

本发明涉及一种发酵合成四氢嘧啶的酿酒酵母工程菌株，属于生物工程技术领域。

背景技术：

四氢嘧啶(ectoine)是一种极性、易溶、生理ph范围内不带电荷的小分子有机物。研究表明，四氢嘧啶是好氧中度嗜盐细菌中最常见的渗透压调控物；对蛋白质的构象和活性有积极的影响，可以提高它们的功能性；对细菌细胞处于极端环境(干旱、冷冻、高盐碱、高温、射线等)中的核酸、蛋白质、酶等起到保护作用；广泛应用于医药，化妆品，酶工业等领域。

四氢嘧啶的合成主要有两种方法：化学合成法和生物合成法。其中，生物合成法主要采用酶催化法和发酵法。化学合成法存在着很多问题，包括生产过程复杂，合成产率低，副产物多且与目标产物的化学性质相似，下游分离纯化难度很高等。酶催化法，需要诱导表达并提取酶，操作复杂，成本较高。传统发酵法常采用的是一种叫做“细菌挤奶”的方法，通过循环控制培养环境中盐浓度的增加与降低来分别实现halomonaselongata中四氢嘧啶的合成与分泌。该方法存在高盐的发酵废液对生产设备腐蚀严重，对环境压力大等缺点。此外，现有技术也有公开产四氢嘧啶的重组大肠杆菌，但该基因工程菌的构建依赖于具有特定基因型的大肠杆菌，同时该类菌为氨基酸缺陷型菌，一定程度上会抑制菌体生长，给菌体造成一定的压力，进而影响四氢嘧啶的生产。

酵母作为单细胞真核微生物，菌体培养和基因操作相对容易。同时，酵母无内毒素，因此，酵母在分子改造方面获得了广泛的应用。酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)在现代分子和细胞生物学中被用作真核模式生物，具有遗传背景清晰、遗传操作简单成熟和易于规模扩大化培养等优点，是发酵合成四氢嘧啶的优势平台。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供四氢嘧啶合成基因簇(ectabc)的dna分子，含有seqidno.1所示的核苷酸序列。

本发明的第二个目的是提供携带所述dna分子的重组表达载体。

在一种实施方式中，所述重组表达载体为枯草芽孢杆菌、大肠杆菌与酿酒酵母的三穿梭质粒pebs。

在一种实施方式中，所述pebs的构建方法公开于论文yangs,liuq,zhangy,etal.constructionandcharacterizationofbroad-spectrumpromotersforsyntheticbiology.[j].acssyntheticbiology,2017,7(1):287-291.中。

本发明的第三个目的是提供一种产四氢嘧啶的酿酒酵母，所述酿酒酵母表达seqidno.1所示的ectabc基因簇。

在一种实施方式中，所述酿酒酵母宿主为s.cerevisiaecen.pk2-1c。

在一种实施方式中，所述ectabc基因簇进行了rbs优化，所述rbs优化是采用seqidno.2～4任一所示的核苷酸序列替换ectabc基因簇中ecta、ectb或ectc的rbs序列。

在一种实施方式中，所述ectabc基因簇进行了启动子优化，所述启动子优化是采用seqidno.5～7任一所示的核苷酸序列替换ectabc基因簇中ecta、ectb或ectc的启动子序列。

在一种实施方式中，ecta基因通过seqidno.5所示的启动子调控表达。

在一种实施方式中，ectb基因通过seqidno.5所示的启动子调控表达，且ectb基因上游还融合seqidno.4所示的rbs序列。

本发明的第四个目的是提供所述酿酒酵母在生产四氢嘧啶中的应用。

在一种实施方式中，所述应用是将所述酿酒酵母在培养基中，于28～35℃发酵至少24h。

在一种实施方式中，发酵培养基组分为(g/l)：酵母粉10；蛋白胨20；葡萄糖40；磷酸钾缓冲液100mmol/l，ph6.0，mnso42，100×氨基酸混合液10ml/l；其中100×氨基酸混合液为：l-组氨酸，l-谷氨酸、l-谷氨酰胺、l-蛋氨酸、l-赖氨酸、l-亮氨酸和l-异亮氨酸各0.5g共同溶于100ml水中，过滤除菌。

有益效果：本发明以酿酒酵母为宿主，以枯草芽孢杆菌、大肠杆菌与酿酒酵母的三穿梭质粒pebs为表达载体，引入来源于伸长盐单胞菌的ectabc基因簇，再进行ecta，ectb，ectc单基因rbs优化、启动子优化以及单基因rbs和启动子双优化等策略，实现了高效生物合成四氢嘧啶。本发明能够使酿酒酵母重组菌在摇瓶上培养96h四氢嘧啶积累量高达2.3g/l，在工业上具有潜在而广泛的应用价值。

附图说明

图1所示为伸长盐单胞菌来源的ectabc基因簇表达的构建示意图；

图2所示为ecta,ectb,ectc单基因rbs优化、启动子优化示意图；

图3所示为单基因rbs和启动子双优化示意图。

具体实施方式

实施例涉及的核苷酸序列信息：

(1)seqidno.1序列信息为来源于伸长盐单胞菌的ectabc基因簇密码子优化后核苷酸序列；

(2)seqidno.2序列信息为rbs1(r1)核苷酸序列；

(3)seqidno.3序列信息为rbs2(r2)核苷酸序列；

(4)seqidno.4序列信息为rbs3(r3)核苷酸序列；

(5)seqidno.5序列信息为组成型启动子cyc100-1(p1)核苷酸序列；

(6)seqidno.6序列信息为组成型启动子cyc100-2(p2)核苷酸序列；

(7)seqidno.7序列信息为组成型启动子cyc100-3(p3)核苷酸序列；

样品的处理及高效液相色谱(hplc)法分析四氢嘧啶产量：取1ml发酵液离心(13000rpm，2min)，将获得的上清使用超纯水稀释适当倍数，再经0.22μm的水系微孔滤膜过滤后打入液相瓶中待测；沉淀用等体积去离子水悬浮后进行超声破碎，将裂解物离心(13000rpm，2min)，裂解后的上清经0.22μm的水系微孔滤膜过滤后打入液相瓶中待测，四氢嘧啶产量为胞内和胞外四氢嘧啶含量之和。

hplc检测条件：使用agilent1260高效液相色谱仪测定样品中的四氢嘧啶。设置进样量为5μl，色谱柱为ods-2c18色谱柱，柱温30℃，流动相为2％乙腈，流速0.6ml/min，紫外检测波长210nm。测量析出四氢嘧啶峰面积。以四氢嘧啶标准品标定各菌株产量。

发酵培养基(g/l)：酵母粉10；蛋白胨20；葡萄糖40；磷酸钾缓冲液100mmol/l，ph6.0，mnso42，100×氨基酸混合液10ml/l。

其中100×氨基酸混合液为：l-组氨酸，l-谷氨酸、l-谷氨酰胺、l-蛋氨酸、l-赖氨酸、l-亮氨酸和l-异亮氨酸各0.5g共同溶于100ml水中，过滤除菌。

表1引物序列

实施例1构建单独优化ecta,ectb,ectc基因或其rbs序列的重组载体

表达系统的构建：以halomonaselongata基因组为模板，使用引物s-ect-f/s-ect-r通过pcr扩增出ectabc基因簇的dna片段(如seqidno.1所示)，将所得的dna片段与用引物pebs-f/pebs-r扩增pebs(所述pebs的构建方法公开于论文yangs,liuq,zhangy,etal.constructionandcharacterizationofbroad-spectrumpromotersforsyntheticbiology.[j].acssyntheticbiology,2017,7(1):287-291.中)的pebs骨架组装以产生pebs-ectabc。以pebs-ectabc为模板，分别使用引物r1a-f/r1a-r，r2a-f/r2a-r，r3a-f/r3a-r，p1a-f/p1a-r，p2a-f/p2a-r，p3a-f/p3a-r，r1b-f/r1b-r，r2b-f/r2b-r，r3b-f/r3b-r，p1b-f/p1b-r，p2b-f/p2b-r，p3b-f/p3b-r，r1c-f/r1c-r，r2c-f/r2c-r，r3c-f/r3c-r，p1c-f/p1c-r，p2c-f/p2c-r，p3c-f/p3c-r进行环化pcr扩增，再使用dpnⅰ消化后可得到pebs-r1-ectabc，pebs-r2-ectabc，pebs-r3-ectabc，pebs-p1-ectabc，pebs-p2-ectabc，pebs-p3-ectabc，pebs-ecta-r1bc，pebs-ecta-r2bc，pebs-ecta-r3bc，pebs-ecta-p1bc，pebs-ecta-p2bc，pebs-ecta-p3bc，pebs-ectab-r1c，pebs-ectab-r2c，pebs-ectab-r3c，pebs-ectab-p1c，pebs-ectab-p2c，pebs-ectab-p3c。

实施例2组合优化ecta,ectb,ectc基因rbs，启动子序列的重组质粒

以实施例1构建的pebs-p1-ectabc为模板，分别使用引物r1a-f/r1p1-r，r2a-f/r2p1-r，r3a-f/r3p1-r进行环化pcr扩增，再使用dpnⅰ消化后可得到启动子优化后的重组载体pebs-p1r1-ectabc，pebs-p1r2-ectabc，pebs-p1r3-ectabc。

以实施例1构建的pebs-p2-ectabc为模板，分别使用引物r1a-f/r1p2-r，r2a-f/r2p2-r，r3a-f/r3p2-r进行环化pcr扩增，再使用dpnⅰ消化后可得到启动子优化后的重组载体pebs-p2r1-ectabc，pebs-p2r2-ectabc，pebs-p2r3-ectabc。

以实施例1构建的pebs-p3-ectabc为模板，分别使用引物r1a-f/r1p3-r，r2a-f/r2p3-r，r3a-f/r3p3-r进行环化pcr扩增，再使用dpnⅰ消化后可得到启动子优化后的重组载体pebs-p3r1-ectabc，pebs-p3r2-ectabc，pebs-p3r3-ectabc。

以实施例1构建的pebs-ecta-p1bc为模板，分别使用引物r1b-f/r1p1-r，r2b-f/r2p1-r，r3b-f/r3p1-r进行环化pcr扩增，再使用dpnⅰ消化后可得到启动子优化后的重组载体pebs-ecta-p1r1bc，pebs-ecta-p1r2bc，pebs-ecta-p1r3bc。

以实施例1构建的pebs-ecta-p2bc为模板，分别使用引物r1b-f/r1p2-r，r2b-f/r2p2-r，r3b-f/r3p2-r进行环化pcr扩增，再使用dpnⅰ消化后可得到启动子优化后的重组载体pebs-ecta-p2r1bc，pebs-ecta-p2r2bc，pebs-ecta-p2r3bc。

以实施例1构建的pebs-ecta-p3bc为模板，分别使用引物r1b-f/r1p3-r，r2b-f/r2p3-r，r3b-f/r3p3-r进行环化pcr扩增，再使用dpnⅰ消化后可得到启动子优化后的重组载体pebs-ecta-p3r1bc，pebs-ecta-p3r2bc，pebs-ecta-p3r3bc。

以实施例1构建的pebs-ectab-p1c为模板，分别使用引物r1c-f/r1p1-r，r2c-f/r2p1-r，r3c-f/r3p1-r进行环化pcr扩增，再使用dpnⅰ消化后可得到启动子优化后的重组载体pebs-ectab-p1r1c，pebs-ectab-p1r2c，pebs-ectab-p1r3c。

以实施例1构建的pebs-ectab-p2c为模板，分别使用引物r1c-f/r1p21-r，r2c-f/r2p2-r，r3c-f/r3p2-r进行环化pcr扩增，再使用dpnⅰ消化后可得到启动子优化后的重组载体pebs-ectab-p2r1c，pebs-ectab-p2r2c，pebs-ectab-p2r3c。

以实施例1构建的pebs-ectab-p3c为模板，分别使用引物r1c-f/r1p3-r，r2c-f/r2p3-r，r3c-f/r3p3-r进行环化pcr扩增，消化后可得到pebs-ectab-p3r1c，pebs-ectab-p3r2c，pebs-ectab-p3r3c。

实施例3单独优化ecta,ectb,ectc基因rbs或启动子序列的重组菌的构建

重组菌的构建：向酿酒酵母s.cerevisiaecen.pk2-1c单倍体感受态细胞中分别转入实施例1构建的线性化的重组质粒pebs-r1-ectabc，pebs-r2-ectabc，pebs-r3-ectabc，pebs-p1-ectabc，pebs-p2-ectabc，pebs-p3-ectabc，pebs-ecta-r1bc，pebs-ecta-r2bc，pebs-ecta-r3bc，pebs-ecta-p1bc，pebs-ecta-p2bc，pebs-ecta-p3bc，pebs-ectab-r1c，pebs-ectab-r2c，pebs-ectab-r3c，pebs-ectab-p1c，pebs-ectab-p2c，pebs-ectab-p3c。

分别挑取上述构建的18株单独优化ecta,ectb,ectc基因rbs以及启动子序列的酿酒酵母重组菌、阳性对照菌(基因组整合线性化pebs-ectabc)和阴性对照菌(基因组整合线性化pebs空质粒)单克隆接种于5mlypd培养基，根据需有添加终浓度为50μg/ml的卡那霉素，置于220rpm30℃培养24h，然后按1％的接种量转接于250ml三角摇瓶，培养基为发酵培养基，装液量为20ml。根据需有添加终浓度为50μg/ml的卡那霉素，然后置于220rpm30℃培养。培养96h后进行样品的处理及hplc分析四氢嘧啶产量。重组菌都能实现异源合成四氢嘧啶，且与阳性对照菌相比，优化后的重组菌大部分产量提高，其中重组菌pebs-ecta-p1bc的四氢嘧啶产量最高，达1.1g/l。

实施例4组合优化ecta,ectb,ectc基因rbs和启动子序列的酿酒酵母重组菌构建

向酿酒酵母s.cerevisiaecen.pk2-1c单倍体感受态细胞中分别转入实施例2构建的线性化的重组质粒pebs-p1r1-ectabc，pebs-p2r1-ectabc，pebs-p3r1-ectabc，pebs-p1r2-ectabc，pebs-p2r2-ectabc，pebs-p3r2-ectabc，pebs-p1r3-ectabc，pebs-p2r3-ectabc，pebs-p3r3-ectabc，pebs-ecta-p1r1bc，pebs-ecta-p2r1bc，pebs-ecta-p3r1bc，pebs-ecta-p1r2bc，pebs-ecta-p2r2bc，pebs-ecta-p3r2bc，pebs-ecta-p1r3bc，pebs-ecta-p2r3bc，pebs-ecta-p3r3bc，pebs-ectab-p1r1c，pebs-ectab-p2r1c，pebs-ectab-p3r1c，pebs-ectab-p1r2c，pebs-ectab-p2r2c，pebs-ectab-p3r2c，pebs-ectab-p1r3c，pebs-ectab-p2r3c和pebs-ectab-p3r3c，筛选阳性克隆，得到的酿酒酵母重组菌分别命名为s.c-r1abc,s.c-r2abc,s.c-r3abc,s.c-p1abc,s.c-p2abc,s.c-p3abc,s.c-ar1bc,s.c-ar2bc,s.c-ar3bc,s.c-ap1bc,s.c-ap2bc,s.c-ap3bc,s.c-abr1c,s.c-abr2c,s.c-abr3c,s.c-abp1c,s.c-abp2c,s.c-abp3c,s.c-p1r1abc,s.c-p2r1abc,s.c-p3r1abc,s.c-p1r2abc,s.c-p2r2abc,s.c-p3r2abc,s.c-p1r3abc,s.c-p2r3abc,s.c-p3r3abc,s.c-ap1r1bc,s.c-ap2r1bc,s.c-ap3r1bc,s.c-ap1r2bc,s.c-ap2r2bc,s.c-ap3r2bc,s.c-ap1r3bc,s.c-ap2r3bc,s.c-ap3r3bc,s.c-abp1r1c,s.c-abp2r1c,s.c-abp3r1c,s.c-abp1r2c,s.c-abp2r2c,s.c-abp3r2c,s.c-abp1r3c,s.c-abp2r3c,s.c-abp3r3c。

分别挑取上述构建的27株组合优化ecta,ectb,ectc基因rbs和启动子序列的酿酒酵母重组菌，阳性对照菌(基因组整合线性化pebs-ectabc)和阴性对照菌(基因组整合线性化pebs空质粒)单克隆接种于5mlypd培养基，根据需有添加终浓度为50μg/ml的卡那霉素，置于220rpm30℃培养24h，然后按1％的接种量转接于250ml三角摇瓶，培养基为发酵培养基，装液量为20ml。根据需有添加终浓度为50μg/ml的卡那霉素，然后置于220rpm30℃培养。培养96h后进行样品的处理及hplc分析四氢嘧啶产量。重组菌都能实现异源合成四氢嘧啶，且与阳性对照菌相比，优化后的重组菌部分产量明显提高，其中重组菌pebs-ecta-p1r3bc的四氢嘧啶产量较高，达2.3g/l。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

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<110>江苏瑞霆生物科技有限公司

<120>一种发酵合成四氢嘧啶的酿酒酵母工程菌株

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