一种用于畜禽养殖环境除臭的枯草芽孢杆菌菌株的制作方法

本发明属于环境工程菌筛选技术领域，具体涉及一种用于畜禽养殖环境除臭的枯草芽孢杆菌菌株。

背景技术：

在畜禽养殖中，大量畜禽粪便在堆放过程中会发酵产生各种恶臭物质，包括nh3、h2s、吲哚、甲基硫醇等，长期接触会对人畜的健康造成危害，有慢性中毒的潜在可能。这些恶臭物质还可以滋生蚊蝇、传播疾病，是形成温室效应和酸雨的污染源之一。因此，加速堆肥腐熟、缩短发酵周期，减少氨气和硫化氢等恶臭气体的排放，是解决目前堆肥除臭问题的研究热点之一。

目前，国内外畜禽粪便除臭主要采用物理、化学和生物除臭技术，使恶臭气体的物象和结构改变，进而达到脱臭的效果。化学方法主要是利用强氧化剂高锰酸钾、过氧化氢等，使部分臭气成分氧化成少臭、无臭物质。物理方法包括机械通风降低臭气浓度，或者通过吸收剂吸收臭气。这两种技术在快速除臭的同时会增加成本、造成环境的二次污染，无法重复利用。生物除臭法是20世纪50年代发展起来的一种治理恶臭污染的方法，该方法是利用微生物的生理代谢活动来降解恶臭物质使之转化为无臭物质，具有处理效率高、无二次污染、便于操作、费用低廉等特点，已成为国内外恶臭防治研究与应用中的主要方法。

1957年，美国科学家paneray申请专利“利用土壤微生物处理硫化氢废气”，标志着人类开始利用微生物进行除臭研究。20世纪70年代开始，该方法被各国广泛研究应用于环境治理方面。20世纪80年代，德国和荷兰等国家利用微生物处理臭气效果较好，引起了日本、美国等国家的重视。

根据菌株除臭成分的不同，除臭微生物主要分为除氨微生物、脱硫微生物和去除其他气体的微生物。通过自身的硝化作用和反硝化作用转换氮元素的微生物统称为除氨微生物，包括自养硝化和异养硝化。目前，自然界中已知的除氨微生物大约有50多个属、130个种，包括bacillus、alcaligenessp、pseudomonas、zoogloea、acinetobacter、thiobacillus、saccharomyces、candida、aspergillus、penicillium、rhizopus等。例如，单奇华等筛选出的酵母菌在实验室条件下可使鸡粪中氨气的释放量减少30％以上。陈书安曾利用绿色木霉消除鸡粪堆肥里67％的氨。郭梅仙等采用氨水逐级驯化法，筛选出4株除氨菌。应用效果研究中发现，菌株a1+a2的nh3释放量最小，全氮和有机氮损失最少，nh-n和no-n的增加最多。表明除氨菌控制了nh4+-n的分解，减少了氮以nh3挥发造成的损失，使其有利于向no3--n和有机氮转化而被固定。

脱硫微生物是指通过自身的代谢作用将恶臭中的硫化物转化为单质硫或者硫酸盐的微生物，主要分为异养型和自养型硫氧化细菌。反硝化脱硫细菌在氧化硫化氢的同时，会生成亚硝酸盐，亚硝酸盐是硫化氢的强烈抑制剂，可以有效控制硫化氢的生成。例如，余海晨等以含巯基的半胱氨酸模拟自然界h2s的产生，从垃圾堆中筛选出6株异养硫氧化细菌，可以把二甲基亚砜(dmso，含c-s键)降解为h2s，并对h2s进一步氧化成so42-、so32-和s2o32-。这6株异养硫氧化细菌混合菌群可以将0.1mol/ml的半胱氨酸降解为h2s，然后再对产生的h2s进一步降解，降解率达到82％。谭文博等从同步反硝化脱硫工艺反应器的厌氧污泥中筛选出了一株新菌x2，通过分子生物学鉴定发现该菌株属于硫假单胞菌属(thiopseudomonassp)。

畜禽恶臭物质中，除了nh3和h2s，还有具有恶臭气味的芳香族化合物，包括吲哚类、甲酚、粪臭素等和挥发性脂肪酸。这些化合物和脂肪酸主要是由胃肠道中的各种微生物(例如乳酸菌属、梭菌属、拟杆菌属等)厌氧发酵产生。孙佩石等利用假单胞菌净化气相中的甲苯，具有较好的效果。孟晓等应用响应面分析法对短乳杆菌在发酵过程中去除粪臭素的发酵条件进行优化，并且研究各发酵参数之间的交互效应，最终在优化条件下得到的粪臭素去除率是71.83％，发现菌株的发酵上清液对粪臭素的去除能力最强，去除率为17.25％(24h)，证明了该菌去除粪臭素的作用不是物理吸附。

以微生物为中心的生物除臭技术具有其他传统方法无法相比的优势，例如操作简单，处理费用低、处理后不产生二次污染，该技术在恶臭气体方面具有广泛的应用前景。微生物除臭菌剂及其技术在今后理论研究与实际应用中的重点是进一步加强筛选和驯化适宜微生物，研发高效、经济、环保的混合菌株，有针对性地处理高浓度、复杂的混合气体，这对我国畜禽粪便的无害化处理及资源化利用具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种用于畜禽养殖环境除臭的枯草芽孢杆菌菌株及其应用。所述菌株对氨气和硫化氢等臭味气体的去除效果明显，而且在重金属含量高的污染环境中也具有良好的除臭效果，从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供一种枯草芽孢杆菌rjm-1(bacillussubtilisrjm-1)，于2020年12月24日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m2020963。

本发明所提供的枯草芽孢杆菌rjm-1在畜禽养殖除臭中的应用。

本发明所提供的枯草芽孢杆菌rjm-1在制备除臭制品中的应用。

所述的除臭制品，其一种是活菌发酵液。

本发明还提供一种畜禽养殖除臭的方法，是使用本发明提供的枯草芽孢杆菌rjm-1进行除臭处理。

本发明所筛选的枯草芽孢杆菌rjm-1对氨气和硫化氢等臭味气体的去除效果明显，而且在重金属含量高的污染环境中也具有良好的除臭效果。通过接种枯草芽孢杆菌rjm-1，猪粪中氨气和h2s气体的排放量比对照组分别降低了83.1％和81.8％。所述菌株可广泛应用于畜禽粪便、污水的除臭处理，也可以与其它菌株配合使用来制备除臭制品。

附图说明

图1：rjm-1菌株的菌落形态图；

图2：rjm-1菌株的maldi-tof-ms蛋白质谱图；

图3：碳氮比对rjm-1菌株降氮性能的影响图；

图4：rjm-1菌株的硫化物去除结果图。

具体实施方式

本发明从猪场附近的污水排放河道的淤泥中筛选获得了能够在重金属含量高的环境中高效去除硫化氢和氨气等臭味气体的菌株，从而促成了本发明。

下面结合实施例和附图对本发明的菌株进行详细的描述。

实施例1：筛选目的菌株

2019年6月在青岛即墨王村养猪场的污水排放河道中取底层污泥样品。

将取回的污泥样品首先使用浓度为100mg/ml磷酸-cr(vi)缓冲液浸泡3-7h，富集耐受高浓度重金属离子的菌。然后再使用纯净水进行100倍稀释；取5μl稀释液涂布耐重金属菌株筛选培养板(蛋白胨10g、牛肉膏5g、nacl4g；琼脂4g、pb1.5mg/l、cu1.5mg/l，加水到1000ml；121℃高温灭菌)上进行培养；培养温度14℃，培养时间36h，获得6株单菌落，分别命名为rjm-1，rjm-2，rjm-3，rjm-4，rjm-5，rjm-6。

将上述6株单菌落分别接种到营养肉汤培养基(蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠5g、蒸馏水1000ml,121℃灭菌)中，在150rpm摇床上，在35℃条件下培养2天，作为种子液。

然后将各个待筛选菌株的种子液按照20％的接种量分别接种到装有100ml河道淤泥的烧瓶中，搅拌均匀后密封，在30℃下静置培养6d，期间每隔48h使用恶臭气体浓度测定仪测定氨气和硫化氢的浓度，以此来鉴定菌株的除臭效果。具体结果见表1。

表1不同菌株在不同时间内去除氨气和硫化氢的效果

从表1的结果可以看出，本发明分离到的6株菌都能有效减少河道淤泥中nh3和h2s气体的排放量。其中，在减少nh3排放方面，虽然rjm-4菌株具有最好的效果，但rjm-4菌株在减少h2s气体排放上的效果明显不如rjm-1菌株。因此，申请人最终选择rjm-1菌株进行进一步分析和应用研究。

实施例2：rjm-1株菌的分类学鉴定

1、菌落形态及生理生化鉴定

rjm-1菌株接种于lb固体培养基，在30℃的恒温培养箱中培养48h后，观察菌落形态。结果如图1所示，该菌株的菌落凸起，表面粗糙无光泽，呈蜡状，边缘有褶皱。

rjm-1菌株革兰氏染色呈阳性；生长温度范围为15～45℃，最适温度为30℃；生长ph范围为5～9，生长盐度范围为10～40‰。

2、16srdna的鉴定

将rjm-1菌株送至生物公司进行16srdna的鉴定。鉴定结果显示，rjm-1菌株的16srdna序列如seqidno：1所示。然后通过ncbi序列比对，以及构建进化树进行系统发育分析，初步确定rjm-1菌株与枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)具有最高的相似度。

3、maldi-tof-ms蛋白图谱鉴定

按照0.1％的接种量在lb液体培养基中接种rjm-1新鲜菌液，37℃，150rpm培养48h后，收集菌体，无菌水洗涤4次，晾干表面水分。然后取少量新鲜菌体以薄膜的形式均匀涂布于靶板上，加1μl裂解液覆盖样品，晾干后，再加1μl基质溶液覆盖样品，晾干后，将样品靶放入质谱仪进行鉴定。用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，使样品中蛋白质电离，离子在10～20kv电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同检测蛋白质的分子量。利用autofms1000分析软件autofanalyzerv1.0获取蛋白指纹图谱，结果如2所示。经与蛋白质图谱库中标准菌株比对，鉴定结果为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)。

综上，结合rjm-1菌株的菌落形态、生理生化特性，以及分子生物学的鉴定结果，可以得出结论，本发明筛选获得的rjm-1菌株为一株新的枯草芽孢杆菌，将其命名为枯草芽孢杆菌rjm-1(bacillussubtilisrjm-1)，已于2020年12月24日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m2020963。

实施例3：枯草芽孢杆菌rjm-1的降氮和降硫效果

1、降氮效果

将枯草芽孢杆菌rjm-1接种到lb液体培养基中培养24h(30℃，150r/min)，离心收集菌体后生理盐水重悬，制成浓度为0.5×10²cfu的菌悬液。将菌悬液按1％比例接种至降氮筛选培养基(nano21g，ch3coona4.8g，琼脂15g，加水至1l，ph7.5)中，在30℃、150r/min条件下培养20h。

培养结束后取样测定od600，8000r/min,10min离心后取上清测定亚硝态氮浓度。

结果表明，本发明提供的枯草芽孢杆菌rjm-1，在以柠檬酸钠为碳源的培养基中，亚硝态氮去除率接近100％，总氮去除率接近70％，且无硝态氮和总氨态氮积累。

碳氮比在5～40范围内，枯草芽孢杆菌rjm-1的生长先升高后下降，在碳氮比为25时达到最大值；枯草芽孢杆菌rjm-1的亚硝态氮去除率先升高后维持稳定，在碳氮比升至20时达到最佳亚硝态氮去除效果(图3)。

2、降硫效果

1)将枯草芽孢杆菌rjm-1接种于lb液体培养基中，于30℃，150r/min的条件下培养3天获得种子液，调整菌液浓度为7×10⁶-9×10⁶cfu/ml；

2)取100ml脱硫菌液体选择培养基(蛋白胨10g，牛肉膏2g，nacl25g，na2s.9h2o23g，蒸馏水1l)加入到250ml三角瓶中，接种培养好的枯草芽孢杆菌rjm-1菌液，以没有接种菌液的培养基作为空白对照，在30℃静置培养，定期通过碘量法测定培养基中硫化物的浓度。同时，以空白对照培养基中硫化物浓度计100％，计算接种枯草芽孢杆菌rjm-1的培养基中硫化物含量百分比。

硫化物含量百分比(％)＝接种rjm-1培养基中硫化物浓度/空白对照培养基中硫化物浓度×100％。

结果如图4所示，接种枯草芽孢杆菌rjm-1后，第2天培养基中硫化物的含量就降至空白对照组的45％；到第5天时，培养基中就测不到硫化物的含量，降硫效果显著，取得了意料不到的技术效果。

实施例4：枯草芽孢杆菌rjm-1对猪粪的除臭效果

将枯草芽孢杆菌rjm-1和赠送的除臭菌枯草芽孢杆菌znx3菌株分别使用lb培养基进行扩大培养，发酵液离心收集菌液，将菌液用生理盐水制成菌悬液，调整菌液中活菌的数量为1x10⁸cfu/ml。

分别取用200mg/m的l磷酸-cr(vi)缓冲液浸泡的猪粪加入到培养皿中，每个培养基加入100g处理的猪粪，再放入大广口瓶中，将枯草芽孢杆菌rjm-1和枯草芽孢杆菌znx3菌的菌悬液按照1ml/10g的量接种入到猪粪中，同时使用lb培养基作为对照组。接种后将广口瓶密封，放在30℃下培养；接种两天后，使用恶臭气体浓度测定仪测定广口瓶中氨气和硫化氢的浓度。每次测量后，将培养皿放入到新的广口瓶中，再两天后测定广口瓶中氨气和硫化氢的含量；重复测定4次；并设定平行对照组(表2)。

表2不同实验组去除氨气和硫化氢的效果数据表

从表2的结果可以看出，与对照组相比，枯草芽孢杆菌rjm-1和znx3均能有效降低猪粪(重金属cr污染)中氨气和h2s气体的排放量，除臭效果显著。其中，在第一次检测时，枯草芽孢杆菌znx3的除臭效果要优于枯草芽孢杆菌rjm-1；但随着培养时间的延长，枯草芽孢杆菌rjm-1的除臭效果明显优于znx3，第四次检测时，氨气和h2s气体的排放量比对照组分别降低了83.1％和81.8％。从而说明，本发明提供的枯草芽孢杆菌rjm-1更适于在重金属污染条件下的除臭处理，取得了意料不到的效果。

序列表

<110>上海康地恩生物科技有限公司

<120>一种用于畜禽养殖环境除臭的枯草芽孢杆菌菌株

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