用于在植物中产生突变的工程化核酸酶的制作方法

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背景技术：
：：近年来，高饱和脂肪含量的饮食已经与胆固醇水平升高和冠心病风险升高关联起来。同样地，当前的膳食指南指示饱和脂肪摄入量不应超过总卡路里的10％。基于每天2,000卡路里的饮食，这相当于每天约20克的饱和脂肪。油含有饱和脂肪。例如，低芥酸菜籽油通常含有约7％至8％的饱和脂肪酸。饱和脂肪酸含量的降低将改善油的营养特征。技术实现要素：涉及植物油合成的基因(包括调节饱和脂肪酸和油酸含量的那些基因)已经通过涉及将种子暴露于化学品或辐射的方法进行了突变，用以产生具有期望性状的突变体。与用工程化核酸酶修饰的植物不同，其中突变(一个或多个核苷酸的取代、缺失和/或添加)可经工程化以发生在植物基因组中非常特定的位置，经由诱变过程开发的植物通常导致随机的、多发性的和非特异性的遗传变化。这些随机的多个遗传变化共同提供突变植物的表型。使用工程化核酸酶，可产生非常特异性的突变或突变组，并且可确定它们对表型(例如，油质特征)的影响。本文提供了通过使用工程化核酸酶产生的突变体sec62(也注释为“易位蛋白相关”；sec62基于其与拟南芥(arabidopsis)直系同源基因at3g20920(arabidopsis.org/servlets/tairobject？name＝at3g20920&type＝locus)进行表征，本文所述的“sec62蛋白”的成员：ebi.ac.uk/interpro/entry/ipr004728))、β-酮脂酰还原酶2(kcr2)、二酰基甘油酰基转移酶1(dgat1)、脂肪酸转运蛋白1(fax1)、microrna394(mir394)和/或β-羟酰基-酰基载体蛋白-脱水酶(had)等位基因、包含所述sec62、kcr2、dgat1、fax1、mir394和/或had(例如芸苔属(brassica)植物)中的一个或多个突变型等位基因的植物、以及此类植物产生较低含量的饱和脂肪酸的用途。如本文所述，包含此类突变的芸苔属植物能够产生具有降低的饱和脂肪酸含量的油。本文所述的芸苔属植物尤其可用于生产用于某些食品应用的低芥酸菜籽油，因为该植物不是经过基因修饰的。本文提供了芸苔属植物(例如甘蓝型油菜(brassicanapus)、芥菜(brassicajuncea)、或芜菁(brassicarapa)植物)及其子代(例如种子)，它们包括经由工程化核酸酶在sec62、kcr2、dgat1、fax1、mir394和/或had中的一个或多个等位基因中发生的取代、缺失和/或插入突变，其中每个突变的等位基因导致产生相对于相应的野生型sec62、kcr2、dgat1、fax1、mir394和/或had多肽和/或活性，具有降低的活性或无活性的sec62、kcr2、dgat1、fax1、mir394和/或had多肽和/或活性(或者取代、缺失和/或插入可导致不产生sec62、kcr2、dgat1、fax1、mir394和/或had蛋白和/或活性)(mir394是一种微rna，其本身作为rna具有活性，不产生蛋白)。突变的等位基因可包括编码截短的sec62、kcr2、dgat1、fax1、mir394和/或had多肽的核酸和/或序列。突变的等位基因可包括与野生型等位基因的核苷酸序列(例如sec62的seqidno:1)具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列。一个实施方案提供了产生具有减少的饱和脂肪酸的植物的方法，该方法包括：a)使植物与对sec62、kcr2、dgat1、fax1、mir394和/或had序列具有特异性的工程化核酸酶接触；b)使来自步骤a)的植物生长并从所述植物收集种子；以及c)选择来自步骤b)的种子所生长的植物，其在所述序列中的一个或多个中具有取代、缺失和/或插入突变；其中所述取代、缺失和/或插入突变导致与尚未通过所述序列编辑突变的具有相同遗传背景的对照植物相比，所述植物的饱和脂肪酸产量减少。另一个实施方案提供了产生具有减少的饱和脂肪酸的植物的方法，该方法包括：a)使植物细胞或组织与对sec62、kcr2、dgat1、fax1、mir394和/或had序列具有特异性的工程化核酸酶接触；b)在步骤a)中由植物细胞或组织产生植物；c)选择步骤b)的植物，其在所述序列中的一个或多个中具有取代、缺失和/或插入突变；其中所述取代、缺失和/或插入突变导致与尚未通过所述序列编辑突变的具有相同遗传背景的对照植物相比，所述植物的饱和脂肪酸产量减少。在一个实施方案中，植物是十字花科(cruciferae)植物。在另一个实施方案中，植物是芸苔属植物。在另一个实施方案中，植物是甘蓝型油菜、芥菜、或芜菁。在一个实施方案中，工程化核酸酶为归巢核酸内切酶。在一个实施方案中，在sec62的至少一个等位基因中存在取代、缺失和/或插入突变(在一些实施方案中，突变的等位基因不在n1上)。在另一个实施方案中，在kcr2的至少一个等位基因中存在取代、缺失和/或插入突变。在另一个实施方案中，在dgat1的至少一个等位基因中存在取代、缺失和/或插入突变。在一个实施方案中，在fax1的至少一个等位基因中存在取代、缺失和/或插入突变。在一个实施方案中，在mir394的至少一个等位基因中存在取代、缺失和/或插入突变。在一个实施方案中，在had的至少一个等位基因中存在取代、缺失和/或插入突变。一个实施方案提供芸苔属植物，该植物在sec62、kcr2、dgat1、fax1、mir394和/或had的至少一个等位基因中包含缺失和/或插入。在一个实施方案中，缺失和/或插入的长度为约1个至约400个碱基对。在另一个实施方案中，缺失和/或插入导致饱和脂肪酸的减少。在一个实施方案中，识别/靶序列包含sec62基因(seqidno:1)、kcr2基因(seqidno:13)、dgat1基因(seqidno:34)、fax1基因(seqidno:43)、mir394(seqidno:98)和/或had基因(seqidno:107)的任何连续核苷酸(例如，10个或更多个)序列。在另一个实施方案中，本文提供了生产油的方法。该方法包括压碎由至少一种本文所述的植物产生的种子并从压碎的种子中提取油。一个实施方案提供了在靶位点处使芸苔属植物细胞的基因组突变的方法，该方法包括：a)在靶位点处诱导双链dna断裂，所述双链断裂通过向所述细胞引入双链dna断裂诱导(dsbi)酶来诱导，该双链dna断裂诱导(dsbi)酶识别在sec62、kcr2、dgat1、fax1、mir394和/或had序列中的至少一个中的所述靶位点附近或所述靶位点处的识别序列；以及b)选择植物细胞，其中所述双链dna断裂已经修复，导致在基因组中的所述靶位点处的突变，其中所述突变是至少一个核苷酸的取代、至少一个核苷酸的缺失、至少一个核苷酸的插入或它们的任何组合。在一个实施方案中，将植物细胞再生为植物。一个实施方案提供了通过本文提供的方法获得的在基因组的靶位点处包含突变的植物细胞。另一个实施方案提供了在包含植物细胞的基因组的靶位点处包含突变的植物、植物部分、其种子或繁殖材料。一个实施方案提供了产生具有减少的饱和脂肪酸的芸苔属植物的方法，该方法包括：a)在靶位点处诱导双链dna断裂，所述双链断裂通过向植物细胞引入双链dna断裂诱导(dsbi)酶来诱导，该双链dna断裂诱导(dsbi)酶识别在sec62、kcr2、dgat1、fax1、mir394和/或had序列中的至少一个中的所述靶位点附近或所述靶位点处的识别序列；以及b)选择植物细胞，其中所述双链dna断裂已经修复，导致在基因组中的所述靶位点处的突变，其中所述突变是至少一个核苷酸的取代、至少一个核苷酸的缺失、至少一个核苷酸的插入或它们的任何组合；以及c)将b)的所述植物细胞再生为植物；其中所述突变导致与尚未通过所述dsbi和修复进行突变的具有相同遗传背景的对照植物相比，所述植物的饱和脂肪酸产量减少。在一个实施方案中，dsbi酶是单链归巢核酸内切酶或一对归巢核酸内切酶，其识别或协同识别位点并诱导或诱导所述双链断裂。在一个实施方案中，通过本文所述的方法将产生的植物与另一种植物杂交。一个实施方案提供在基因组的靶位点处包含通过本文提供的方法获得修饰的植物、植物部分、其种子或繁殖材料。在一个实施方案中，植物是甘蓝型油菜、芥菜、或芜菁。在一个实施方案中，在n11、n13和/或n15上的一个或多个sec62等位基因发生突变。在另一个实施方案中，在n7、n17、n9和/或n15上的一个或多个kcr2等位基因发生突变。在一个实施方案中，在n9和/或n19上的一个或两个dgat1等位基因发生突变。在另一个实施方案中，在n7、n9和/或n18上的一个或多个fax1等位基因发生突变。在一个实施方案中，在n16和/或n7上的一个或两个mir394等位基因发生突变。在一个实施方案中，在n2和/或n3上的一个或两个had等位基因发生突变。在一个实施方案中，突变是一个或多个核苷酸的缺失或插入，任选地包括至少一个核苷酸的取代。在一个实施方案中，与相同遗传背景的非突变植物相比，通过本文所述的方法产生的植物使硬脂酸(18:0)减少约6％至约27％。在另一个实施方案中，植物产生总饱和脂肪酸总体减少约2％至约12％。在一些实施方案中，该方法和/或突变植物使总饱和脂肪酸减少了约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％或约12％。在其他实施方案中，该方法和/或突变植物使总饱和脂肪酸减少了约2％至约4％、约3％至约6％、约2％至约7％、约5％至约12％、约6％至约9％或约8％至约9％。一些实施方案提供了方法和/或突变植物，其中硬脂酸减少了约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％或约27％。一些实施方案提供了方法和/或突变植物，其中硬脂酸减少了约6％至约15％、9％至约12％、约11％至约17％、约13％至约17％、约15％至约22％、约16％至约20％、约20％至约24％或约24％至约27％。附图说明图1a-图1j提供a)sec62的全长序列(n13，野生型；可公开获得的；chalhoub等人，2014)(seqidno:1)；b)示出野生型sec62n13的部分序列(seqidno:2)；c)示出sec62n13突变体的部分序列(9bp缺失；seqidno:3)；d)示出归巢核酸内切酶的识别位点；部分野生型sec62n13核苷酸序列(seqidno:4)和示出缺失的部分突变序列(seqidno:5)；e)示出野生型sec62n15的部分序列(seqidno:6)；f)示出sec62n15突变体的部分序列(9bp插入；seqidno:7)；g)示出归巢核酸内切酶的识别位点；部分野生型sec62n15核苷酸序列(seqidno:118)和示出插入的部分突变序列(seqidno:8)；h)示出野生型sec62n11的部分序列(seqidno:9)；i)示出sec62n11突变体的部分序列(4bp缺失；seqidno:10)；以及j)示出归巢核酸内切酶的识别位点；部分野生型sec62n11核苷酸序列(seqidno:11)和示出缺失的部分突变序列(seqidno:12)图2a-图2p提供a)kcr2的全长序列(n9，野生型；可公开获得的序列；chalhoub等人，2014)(seqidno:13)；b)示出野生型kcr2n9的部分序列(seqidno:14)；c)示出kcr2n9突变体的部分序列(24bp缺失；seqidno:15)；d)示出归巢核酸内切酶的识别位点；部分野生型kcr2n9核苷酸序列(seqidno:16)和示出缺失的部分突变序列(seqidno:17)；e)示出野生型kcr2n15的部分序列(seqidno:18)；f)示出kcr2n15突变体的部分序列(13bp缺失；seqidno:19)；g)示出归巢核酸内切酶的识别位点；部分野生型kcr2n15核苷酸序列(seqidno:20)和示出缺失的部分突变序列(seqidno:21)；h)示出野生型kcr2n7的部分序列(seqidno:22)；i)示出kcr2n7突变体的部分序列(1bp插入；seqidno:23)；j)示出归巢核酸内切酶的识别位点；部分野生型kcr2n7核苷酸序列(seqidno:24)和示出插入的部分突变序列(seqidno:25)；k)示出野生型kcr2n7的部分序列(seqidno:26)；l)示出kcr2n7突变体的部分序列(15bp缺失(seqidno:27)；m)示出归巢核酸内切酶的识别位点；部分野生型kcr2n7核苷酸序列(seqidno:28)和示出缺失的部分突变序列(seqidno:29)；n)示出野生型kcr2n17的部分序列(seqidno:30)；o)示出kcr2n17突变体的部分序列(1bp插入；seqidno:31)；以及p)示出归巢核酸内切酶的识别位点；部分野生型kcr2n17核苷酸序列(seqidno:32)和示出插入的部分突变序列(seqidno:33)。图3a-图3g提供a)dgat1的全长序列(n17，野生型；可公开获得的序列；chalhoub等人，2014)(seqidno:34)；b)示出野生型dgat1n9的部分序列(seqidno:35)；c)示出dgatn9突变体的部分序列(5bp缺失；seqidno:36)；d)示出归巢核酸内切酶的识别位点；部分野生型dgat1n9核苷酸序列(seqidno:37)和示出缺失的部分突变序列(seqidno:38)；e)示出野生型dgat1n19的部分序列(seqidno:39)；f)示出dgatn19突变体的部分序列(10bp缺失；seqidno:40)；以及g)示出归巢核酸内切酶的识别位点；部分野生型dgat1n19核苷酸序列(seqidno:41)和示出缺失的部分突变序列(seqidno:42)。图4a-图4n提供a)fax1的全长序列(n9，野生型；可公开获得的序列；chalhoub等人，2014)(seqidno:43)；b)示出野生型fax1n9的部分序列(seqidno:44)；c)示出fax1n9突变体的部分序列(8bp缺失；seqidno:45)；d)示出归巢核酸内切酶的识别位点；部分野生型fax1n9核苷酸序列(seqidno:46)和示出缺失的部分突变序列(seqidno:47)；e)示出fax1n9突变体的部分序列(19bp缺失；seqidno:48)；f)示出归巢核酸内切酶的识别位点；部分野生型fax1n9核苷酸序列(seqidno:49)和示出缺失的部分突变序列(seqidno:50)；g)示出野生型faxn18的部分序列(seqidno:51)；h)示出fax1n18突变体的部分序列(87bp缺失；seqidno:52)；i)示出归巢核酸内切酶的识别位点；部分野生型fax1n18核苷酸序列(seqidno:53)和示出缺失的部分突变序列(seqidno:54)；j)示出野生型faxn7的部分序列(seqidno:55)；k)示出fax1n7突变体的部分序列(3bp缺失；seqidno:56)；l)示出归巢核酸内切酶的识别位点；部分野生型fax1n7核苷酸序列(seqidno:57)和示出缺失的部分突变序列(seqidno:58)；m)示出fax1n7突变体的部分序列(1bp插入；seqidno:59)；以及n)示出归巢核酸内切酶的识别位点；部分野生型fax1n7核苷酸序列(seqidno:60)和示出插入的部分突变序列(seqidno:61)。图5a-图5q提供a)pdat1的全长序列(n12，野生型；可公开获得的序列；chalhoub等人，2014)(seqidno:62)；b)示出野生型pdat1n2的部分序列(seqidno:63)；c)示出pdat1n2突变体的部分序列(5bp缺失；seqidno:64)；d)示出归巢核酸内切酶的识别位点；部分野生型pdat1n2核苷酸序列(seqidno:65)和示出缺失的部分突变序列(seqidno:66)；e)示出野生型pdat1n12的部分序列(seqidno:67)；f)示出pdat1n12突变体的部分序列(79bp缺失；seqidno:68)；g)示出归巢核酸内切酶的识别位点；部分野生型pdat1n12核苷酸序列(seqidno:69)和示出缺失的部分突变序列(seqidno:70)；h)示出野生型pdat1n10的部分序列(seqidno:71)；i)示出pdat1n10突变体的部分序列(15bp缺失；seqidno:72)；j)示出归巢核酸内切酶的识别位点；部分野生型pdat1n10核苷酸序列(seqidno:73)和示出缺失的部分突变序列(seqidno:74)；k)示出pdat1n10突变体的部分序列(21bp缺失；seqidno:75)；l)示出归巢核酸内切酶的识别位点；部分野生型pdat1n10核苷酸序列(seqidno:76)和示出缺失的部分突变序列(seqidno:77)；m)示出野生型pdat1n19的部分序列(seqidno:78)；n)示出pdat1n19突变体的部分序列(8bp缺失；seqidno:79)；o)示出归巢核酸内切酶的识别位点；部分野生型pdat1n19核苷酸序列(seqidno:80)和示出缺失的部分突变序列(seqidno:81)；p)示出pdat1n19突变体的部分序列(213bp缺失；seqidno:82)；以及q)示出归巢核酸内切酶的识别位点；部分野生型pdat1n19核苷酸序列(seqidno:83)和示出缺失的部分突变序列(seqidno:84)。图6a-图6j提供a)enr的全长序列(n13，野生型；可公开获得的序列；chalhoub等人，2014)(seqidno:85)；b)示出野生型enrn3的部分序列(seqidno:86)；c)示出enrn3突变体的部分序列(6bp缺失；seqidno:87)；d)示出归巢核酸内切酶的识别位点；部分野生型enrn3核苷酸序列(seqidno:88)和示出缺失的部分突变序列(seqidno:89)；e)示出野生型enrn7的部分序列(seqidno:90)；f)示出enrn7突变体的部分序列(1bp缺失；seqidno:91)；g)示出归巢核酸内切酶的识别位点；部分野生型enrn7核苷酸序列(seqidno:92)和示出缺失的部分突变序列(seqidno:93)；h)示出野生型enrn13的部分序列(seqidno:94)；i)示出enrn13突变体的部分序列(377bp缺失；seqidno:95)；以及j)示出归巢核酸内切酶的识别位点；部分野生型enrn7核苷酸序列(seqidno:96)和示出缺失的部分突变序列(seqidno:97)。图7a-图7g提供a)mir394的全长序列(n7，野生型；可公开获得的序列；chalhoub等人，2014)(seqidno:98)；b)示出野生型mir394n16b的部分序列(seqidno:99)；c)示出mir394n16b突变体的部分序列(35bp缺失和2bp突变；seqidno:100)；d)示出归巢核酸内切酶的识别位点；部分野生型mir394n16b核苷酸序列(seqidno:101)和示出缺失的部分突变序列(seqidno:102)；e)示出野生型mir394n7c的部分序列(seqidno:103)；f)示出mir394n7c突变体的部分序列(17bp缺失；seqidno:104)；以及g)示出归巢核酸内切酶的识别位点；部分野生型mir394n16b核苷酸序列(seqidno:105)和示出缺失的部分突变序列(seqidno:106)。图8a-图8g提供a)had的全长序列(n3，野生型；可公开获得的序列；chalhoub等人，2014)(seqidno:107)；b)示出野生型hadn2的部分序列(seqidno:108)；c)示出hadn2突变体的部分序列(73bp缺失；seqidno:109)；d)示出归巢核酸内切酶的识别位点；部分野生型hadn2核苷酸序列(seqidno:110)和示出缺失的部分突变序列(seqidno:111)；e)示出野生型hadn3的部分序列(seqidno:112)；f)示出hadn3突变体的部分序列(21bp缺失；seqidno:113)；以及g)示出归巢核酸内切酶的识别位点；部分野生型hadn2核苷酸序列(seqidno:114)和示出缺失的部分突变序列(seqidno:115)。具体实施方式提供了使用双链dna断裂诱导酶以靶向方式使植物的基因组突变的方法。还提供了产生具有降低的饱和脂肪酸含量的油的种子的植物，具体地讲芸苔属植物，以及制备此类植物的方法。本发明提供使用工程化双链dna断裂诱导酶在植物基因组中精确定位的核苷酸序列处引入靶向突变(包括一个或多个核苷酸的插入、缺失或取代)的方法。本发明还提供包含这种突变序列的植物细胞、植物部分、植物或种子以及制备此类植物的方法，其中所述突变导致该植物的饱和脂肪酸产量减少。本发明基于如下观察结果：可对功能性归巢核酸内切酶进行工程化以在植物细胞中特异性识别并切割核苷酸序列，例如sec62(seqidno:1)，由该植物细胞可产生植物。本文提供了通过本文提供的方法产生的植物，例如芸苔属植物，包括甘蓝型油菜(b.napus)、芥菜(b.juncea)、和芜菁(b.rapa)芸苔属物种，它们产生具有降低的饱和脂肪酸含量的油的种子。定义：在描述和要求本发明的权益时，将根据下文所示的定义使用以下术语。除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。与本文所述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料均可用于本发明的实践或测试。下文所列的基团、取代基和范围的具体且优选的值仅用于例示；它们不排除基团和取代基的其他限定值或限定范围内的其他值。如本文所用，冠词“一个”和“一种”是指冠词的语法对象中的一个或多于一个，即，至少一个。以举例的方式，“元件”意指一个元件或多于一个元件。如本文所用，术语“约”是指大约、大致或粗略的范围。当术语“约”结合数值范围使用时，其通过将边界延伸至高于和低于所述数值来修饰该范围。一般来讲，术语“约”在本文中用来以20％的方差修饰高于或低于所述值的数值。如本文所用，“双链dna断裂内切核酸酶”是能够在称为“识别位点”的特定核苷酸序列处诱导双链dna断裂的酶。归位内切核酸酶构成内切核酸酶家族，有时也称为归巢核酸内切酶。它们可由内含子、独立基因或间插序列编码，并且呈现出将它们与较典型的限制酶(通常与细菌限制修饰ii型系统)区分开的结构和功能特性。本领域的技术人员将能够选择识别所选择的靶核苷酸序列的双链dna断裂诱导(“dsbi”)酶以工程化此种dsbi内切核酸酶。如本文所用，“位于附近”是指双链dna断裂诱导位点，即，dsbi酶的识别位点，位于距离靶点(即，待突变的基因组dna中的位点(靶位点))0bp、10bp、20bp、30bp、50bp、60bp、70bp、80bp、90bp、100bp、200、250bp、500bp、1kbp、2kbp、3kbp、4kbp、5kbp至10kbp处。术语“异源”是指来源于不同来源的两个或更多个核酸或蛋白质序列之间的关系。例如，如果这种组合通常天然不存在，则启动子相对于可操作地连接的核酸序列(例如编码序列)是异源的。此外，特定序列相对于其所插入的细胞或生物体可以是“异源的”(即，在该特定细胞或生物体中不天然存在)。表达“可操作地连接”是指嵌合基因的所述元件以它们的功能相配合并允许表达编码序列的方式彼此连接，即，它们是功能性连接的。以举例的方式，当启动子能够确保所述另一核苷酸序列的转录和最终表达时，该启动子与该核苷酸序列功能性连接。缺合子生物携带相同基因的两个突变体或缺失等位基因。突变/缺失等位基因都是完全丧失功能的或‘无效的’等位基因，因此纯合无效和缺合子是同义的。基因敲除(缩写为：ko)是一种遗传学技术，其中使生物体的两个等位基因无效(“敲除”生物体)。术语敲除、失活和破坏在本文中可互换使用，意指靶位点发生改变，使得基因表达产物被消除或大大减少，或者所表达的产物与对照物(例如野生型蛋白)相比具有降低的活性。也称为敲除生物体或简单地称为敲除。该术语还指产生这种生物体的过程，如在“敲除”基因过程中产生该生物体。当数量、浓度或其他数值或参数以范围、优选范围或优选上限数值和优选下限数值的列表形式给出时，其应理解为具体地公开由任何范围上限或优选数值与任何范围下限或优选数值的任何一对所构成的所有范围，而不管是否单独地公开该范围。除非另外指明，否则当本文列举数值范围时，该范围旨在包括其端点、以及该范围内的所有整数和分数。当定义一个范围时，不旨在将本发明的范围限定于所列举的具体值。如本文所用，“植物部分”包括任何植物器官或植物组织，包括但不限于果实、种子、胚、分生组织区域、愈伤组织、叶、根、苗、花、配子体、孢子体、花粉和小孢子。出于本发明的目的，两个相关核苷酸或氨基酸序列的“序列同一性”以百分比表示，是指两个最佳比对的序列中具有相同残基的位置的数目(x100)除以所比较的位置数目。空位，即，比对中残基存在于一条序列中但不存在于另一条序列中的位置，被认为是具有不同残基的位置。通过needleman和wunsch算法(needleman和wunsch，1970)，进行两个序列的最佳比对。上文的计算机辅助序列比对可使用标准软件程序如gap(其为wisconsinpackage10.1版(geneticscomputergroup，madison，wis.，usa)的一部分)，采用默认计分矩阵(具有50的空位产生罚分和3的空位延伸罚分)方便地进行。核酸可为单链或双链的dna或rna。核酸可通过化学方法合成或通过生物表达在体外或体内产生。核酸可使用适当保护的核糖核苷亚磷酰胺和常规的dna/rna合成仪进行化学合成。dna包括cdna和基因组dna。本文所用的标准重组dna和分子克隆技术是本领域熟知的，并且更完整地描述于sambrook,j.,fritsch,e.f.和maniatis,t.molecularcloning:alaboratorymanual；coldspringharborlaboratory:coldspringharbor,n.y.(1989)；silhavy,t.j.,bennan,m.l和enquist,l.w.,experimentswithgenefusions,coldspringharborlaboratory:coldspringharbor,n.y.(1984)；以及ausubel,f.m.等人，currentprotocolsinmolecularbiology，由greenepublishingassoc.andwiley-interscience,hoboken,n.j.出版，(1987)。术语“包含”等可具有美国专利法中赋予它们的含义，并且可意指“包括”等。如本文所用，“包括”等意指包括但不限于。植物由于sec62、kcr2、dgat1、fax1、mir394和/或had(以及任选的pdat1和/或enr)的活性降低，本文所述的植物如芸苔属植物在种子油中具有降低水平的总饱和脂肪酸。应当理解，在整个本公开中，提及“植物”时包括子代，即，特定植物或植物品系的后代、以及来自该植物的细胞或组织。本发明植物的子代包括在fl,、f2、f3、f4和后续世代植物上形成的种子，或者在bc1、bc2、bc3和后续世代植物上形成的种子。由植物产生的种子可生长，然后自交(或远交且自交的或通过双单倍体加倍的)以获得突变等位基因纯合的种子。术语“等位基因”是指在特定基因座的基因的一种或多种替代形式。sec62、kcr2、dgat1、fax1、mir394和/或had(以及任选的pdat1和/或enr)的活性降低(包括不存在可检出的活性)可通过使一个或多个内源sec62、kcr2、dgat1、fax1、mir394和/或had(以及任选的pdat1和/或enr)等位基因发生突变而实现(这些基因中的每一个具有一种或多种亚型，例如sec62具有6种亚型，即，在染色体n1、n11、n13、n15、n3和n5中的每一个上的一种亚型(在一个实施方案中，sec62的突变不在染色体n1上)；kcr2具有4种亚型，即，在染色体n7、n17、n9和n15中的每一个上的一种亚型；dgat1具有4种亚型，即，在染色体n9、n19、n7和n17中的每一个上的一种亚型；fax1具有4种亚型，即，在染色体n7、n9、n16和n18中的每一个上的一种亚型；pdat1具有4种亚型，即，在染色体n2、n12、n10和n19中的每一个上的一种亚型；enr具有4种亚型，即，在染色体n3、n7、n13和n17中的每一个上的一种亚型；mir394具有4种亚型，即，在染色体n16和n7中的每一个上的两种亚型；并且had具有4种亚型，即，在染色体n2、n3、n12和n13中的每一个上的一种亚型。sec62、kcr2、dgat1、fax1、mir394和/或had(以及任选的pdat1和/或enr)的内源亚型/等位基因可使用工程化核酸酶进行突变(缺失、添加和/或取代突变)。可使用一种或多种工程化核酸酶将遗传突变引入例如可再生的植物组织内。可例如通过测定群体的脂肪酸谱并将其与相应的非诱变群体进行比较，针对由突变引起的降低的蛋白质活性对经处理的群体或该群体的后续世代进行筛选。突变可在基因的任何部分中，包括编码序列、内含子序列和调控元件，使得所得的基因产物无功能或具有降低的活性。可对其进行遗传突变的植物是任何植物，包括芸苔属家族中的那些，包括任何野生型和突变植物背景。此类芸苔属植物包括但不限于imc201(美国专利9,334,483)、imc02(由美国典型培养物保藏中心(atcc)保藏号pta-6221表示)、westar(美国专利6,342,658)、1904(由美国典型培养物保藏中心(atcc)保藏号pta-11273表示，以及命名为1904并由atcc保藏号pta-11273表示的种子的子代)、2558(由美国典型培养物保藏中心(atcc)保藏号pta-11274表示，以及命名为2558并由atcc保藏号pta-11274表示的种子的子代)、美国公开专利申请号2013/0081156，95cb504(美国专利9,334,483)、cargill背景(由美国典型培养物保藏中心(atcc)保藏号pta-12314、pta-12315和pta-12316表示)、03lcll和以保藏号pta-12314、pta-12315和pta-12316保藏的混合背景、以及topas(由美国典型培养物保藏中心(atcc)保藏号pta-120738表示)。工程化核酸酶工程化核酸酶(gen)的使用是一类遗传工程，其中使用工程化核酸酶或“分子剪刀”在生物体的基因组中插入、缺失或取代dna。这些核酸酶在基因组中的所需位置处产生位点特异性双链断裂(dsb)。修复诱导的双链断裂，从而导致靶向突变如缺失。目前使用四个家族的工程化核酸酶：归巢核酸内切酶、锌指核酸酶(zfn)、转录激活因子样效应因子核酸酶(talen)和crispr-cas系统(esvelt,km.和wang,hh.(2013).“genome-scaleengineeringforsystemsandsyntheticbiology.”molsystbiol9(1):641；tan，ws.等人(2012).“precisioneditingoflargeanimalgenomes.”advgenet80:37–97；puchta,h.和fauser,f.(2013).“genetargetinginplants:25yearslater.”int.j.dev.biol57:629–637；boglioli,e.和richard,m.“rewritingthebookoflife:anewerainprecisiongenomeediting”(pdf).bostonconsultinggroup；methodoftheyear2011.natmeth9(1),1-1；www.sciencemag.org/topic/2015-breakthrough-year)。通常存在于微生物菌种中的归巢核酸内切酶具有独特的特性：具有长的识别序列(>14bp)，从而使它们具有天然特异性(desouza,n.,primer:genomeeditingwithengineerednucleases.natmeth9(1),27-27(2011)；smith,j.等人，acombinatorialapproachtocreateartificialhomingendonucleasescleavingchosensequences.nucleicacidsresearch34(22),e149(2006))。这可用于在基因组编辑中制备位点特异性dsb。已经产生了识别独特序列的归巢核酸内切酶变体(id)。另外，可使用多种归巢核酸内切酶的融合体以产生识别新序列的杂合酶(chevalier，b.s.等人，design,activity,andstructureofahighlyspecificartificialendonuclease"molecularcell10(4),895-905(2002))。另一些人已在命名为合理设计的归巢核酸内切酶的方法中改变归巢核酸内切酶的dna相互作用氨基酸以设计序列特异性归巢核酸内切酶(美国专利8,021,867；wo2007/047859；wo2011/064736)。充分表征的归巢核酸内切酶是i-scel。i-scel是位点特异性内切核酸酶，导致酿酒酵母(saccharomycescerevisea)的线粒体中的内含子移动。该酶由21srrna基因的任选内含子sclsu.1编码，并且在内含子插入位点处引发双链dna断裂，从而产生具有3'0h突出端的4bp交错切割。i-scei内切核酸酶的识别位点在18bp的非对称序列上延伸(colleaux等人，1988proc.natl.acad.sci.usa85:6022-6026)。i-scel的氨基酸序列和线粒体i-scel基因的通用编码等同物已由例如wo96/14408提供。wo96/14408还公开了仍有功能的多种i-scei蛋白变体。pct专利申请pct/ep04/013122(以引用方式并入本文)提供了经优化以在植物中表达的i-scei合成核苷酸序列变体。另一种充分表征的经设计的归巢核酸内切酶基于天然存在的用作支架的归巢核酸内切酶i-crei。i-crei是存在于莱茵衣藻(chlamydomonasrheinhardti)的叶绿体中的内切核酸酶(thompson等人，1992,gene119,247-251)。该内切核酸酶是识别23srrna基因中的伪回文22bpdna位点并产生可用于引入内含子的双链dna断裂的同源二聚体。i-crei是携带单个laglidadg(seqidno:116)基序的一组内切核酸酶的成员。laglidadg(seqidno:117)酶包含共有基序的一个或两个拷贝。单基序酶如i-crei作为同源二聚体起作用，而双基序酶是具有两个单独结构域的单体。因此，当设计衍生自i-crei支架的归巢核酸内切酶以识别22bp的所关注核苷酸序列时，设计两个单体单元，每个单体单元识别22bp识别位点的一部分，这是在22bp识别位点处诱导双链断裂所协同需要的(w02007/047859)。协同作用可通过将两个单体单元连接成一条单链归巢核酸内切酶来实现，或者也可通过促进异源二聚体的形成来实现，如例如在w02007/047859中所述。wo03/004659(第17至20页)(以引用方式并入本文)的表i中提供了其他dsb诱导性酶及其相应识别位点的列表。这些包括i-seei、i-chui、i-dmoi、i-crei、i-csmi、pi-flii、pt-mtui、i-ceui、i-seeii、i-seeiii、ho、pi-civi、pi-ctri、pi-aaei、pi-bsui、pi-dhai、pi-drai、pi-mayi、pi-mchi、pi-mfui、pi-mfli、pi-mgai、pi-mgoi、pi-mini、pi-mkai、pi-mlei、pi-mmai、pi-mshi、pi-msmi、pi-mthi、pi-mtui、pi-mxei、pi-npui、pi-pfui、pi-rmai、pi-spbi、pi-sspi、pi-faei、pi-mjai、pi-phoi、pi-tagi、pi-thyi、pi-tkoi或pi-tspi。与归巢核酸内切酶相反，zfn和talen技术背后的概念基于非特异性dna切割酶，其然后可连接至特异性dna序列识别肽，诸如锌指(此类方法已描述于例如wo03/080809、w094/18313或w095/09233，以及isalan等人，2001，naturebiotechnology19,656-660中；liu等人，1997，proc.natl.acad.sci.usa94,5525-5530中))和转录激活因子样效应因子(tale；baker,m.,gene-editingnucleases.natmeth9(1),23-26(2012)；christian等人，2010，genetics186:757-761，wol0/079430和wo10/146121)。在这些技术中，内切核酸酶具有彼此分开的dna识别位点和切割位点。虽然zfn和talen构建体的核酸酶部分具有相似的性质(例如foki)，但这些工程化核酸酶之间的差异在于它们的dna识别肽。zfn依赖于cys2-his2锌指和在tale上的talen构建体。这两个dna识别肽结构域都具有天然存在于其蛋白质的组合中的特征。cys2-his2锌指通常存在于间隔3bp的重复序列中，并且以各种不同的组合存在于多种核酸相互作用蛋白诸如转录因子中。另一方面，tale存在于氨基酸与所识别的核苷酸对之间具有一对一识别比率的重复序列中。因为锌指和tale都以重复模式出现，可尝试不同的组合来产生多种序列特异性(desouza,n.,primer:genomeeditingwithengineerednucleases.natmeth9(1),27-27(2011))。锌指已在这些术语和方法中更加确定，例如模块化组装(其中与三联体序列相关的锌指成行连接以覆盖所需序列)、open(肽结构域对三联体核苷酸的低严格性选择，然后是肽组合对细菌系统中的最终靶标的高严格性选择)、以及在其他方法中对锌指文库进行细菌单杂交筛选已用于制备位点特异性核酸酶。通过从变体文库中选择来产生定制的归巢核酸内切酶的另一种方式在w02004/067736中有所描述。具有改变的序列特异性和dna结合亲和力的定制归巢核酸内切酶也可通过如w02007/047859中所述的合理设计获得。此类定制的内切核酸酶也称为非天然存在的内切核酸酶。所设计的双链断裂诱导酶可包含(但不一定包含)核定位信号(nls)，例如sv40大t-抗原的nls(raikhel，plantphysiol.100:1627-1632(1992)以及其中的参考文献)(kalderon等人，cell39:499-509(1984))。核定位信号可位于蛋白质中的任何位置，但便利地位于蛋白质的n末端。核定位信号可取代双链断裂诱导酶的一个或多个氨基酸。便利地，dsbi酶能够通过编码此类酶的植物可表达重组基因的表达而被提供。为此，可将包含编码例如设计的归巢核酸内切酶或归巢核酸内切酶单体单元的核苷酸序列的dna区域可操作地连接至植物可表达的启动子，以及任选的参与转录终止和多腺苷酸化的dna区域，并引入植物、植物部分或植物细胞中。编码dsbi酶的重组基因可被瞬时引入或稳定引入。dsbi酶还可通过将翻译成dsbi酶的rna分子引入到细胞中而被引入到植物、植物部分或植物细胞中。另选地，可将dsbi酶以蛋白质的形式直接引入植物、植物部分或植物细胞。用于将dna分子或rna分子或蛋白质引入植物、植物部分、组织或植物细胞的方法是本领域技术人员可获得的，并在下文简要描述。如本文所述，术语“植物可操作的启动子”和“植物可表达的启动子”意指能够驱动在植物、植物组织、植物器官、植物部分或植物细胞中的转录的启动子。这包括植物来源的任何启动子，以及可在植物细胞中引导转录的非植物来源的任何启动子。可用于这方面的启动子是组成型启动子，诸如花椰菜花叶病毒(camv)35s转录物的启动子(hapster等人，1988，md.gen.genet.212:182-190)、camv19s启动子(美国专利5,352,605；wo84/02913；benfey等人，1989，emboj.8:2195-2202)；4号或7号地三叶草病毒启动子(wo96/06932)；rubisco小亚基启动子(美国专利4,962,028)；泛素启动子(holtorf等人，1995,plantmal.biol.29:637-649、t-dna基因启动子(例如来自农杆菌(agrobacterium)的章鱼碱合成酶(ocs)和胭脂碱合成酶(nos)启动子)、以及本领域技术人员可获得其在植物中的组成型表达的基因的其他启动子。可用于该方面的其他启动子是组织特异性启动子或器官特异性启动子，诸如种子特异性启动子如2s白蛋白启动子(joseffson等人，1987，j.biol.chem.262:12196-12201)、菜豆蛋白启动子(美国专利5,504,200；bustos等人，1989，plantcell1.(9):839-53)、豆球蛋白启动子(shirsat等人，1989，mal.gen.genet.215(2):326-331)、“未知种子蛋白”(usp)启动子(baumlein等人，1991，mal.gen.genet.225(3):459-67)、油菜贮藏蛋白(napin)启动子(美国专利5,608,152；stalberg等人，1996，planta199:515-519)、拟南芥油体蛋白启动子(arabidopsisoleosinpromoter)(wo98/45461)、芸苔属植物bce4启动子(wo91/13980)、以及本领域技术人员可获得的在植物种子中特异性表达的基因的其他启动子。植物基因编辑归巢核酸内切酶、zfn、crispr和talen的使用为植物中的遗传操纵提供了新的策略，并且可通过使内源基因突变来帮助工程化所需的植物性状。使用工程化核酸酶或本领域技术人员可用的任何方法，可使多个基因突变(以便形成缺失突变/截短、添加一个或多个核苷酸和/或使一个或多个核苷酸突变(改变其序列/取代)而不是通过插入外源/非内源dna进行的突变)，包括植物的sec62；kcr2；dgat1；fax1；mir394；had；pdat1；和/或enr，该植物如十字花科植物，例如芸苔属植物(chalhoub等人，science(345)2014)，包括甘蓝型油菜、芥菜、或芜菁物种的植物。在一个实施方案中，植物是油料种子作物，诸如亚麻(linumsp.)、油菜籽(brassicasp.)、大豆(glycinesp.)、向日葵(helianthussp.)、棉花(gossypiumsp.)、玉米(zeamays)、橄榄(oleasp.)、红花(carthamussp.)、可可(theobromacacoa)、花生(arachissp.)、大麻、油棕、椰子、落花生、芝麻、蓖麻、莱斯奎雷拉(lesquerella)、乌桕、乳木果、罂粟籽、和/或霍霍巴籽。因此，本文提供了包含例如sec62、kcr2、dgat1、fax1和/或had(以及任选的pdat1和/或enr)的修饰等位基因的基因和植物，如芸苔属植物，其导致产生的该基因所编码的蛋白具有降低的活性或无活性(与野生型sec62、kcr2、dgat1、fax1和/或had(以及任选的pdat1和/或enr)相比)，或者导致几乎没有待产生的蛋白产物，或者导致mir394的活性降低至无活性或将mir394减少至不产生。例如，通过使用靶向/设计的归巢核酸内切酶和内源性修复机制，可在本文所述的任何一种基因中产生插入、取代或缺失突变。缺失或插入突变的长度可为1个核苷酸至400个以上的核苷酸，包括例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个、101个、102个、103个、104个、105个、106个、107个、108个、109个、110个、111个、112个、113个、114个、115个、116个、117个、118个、119个、120个、121个、122个、123个、124个、125个、126个、127个、128个、129个、130个、131个、132个、133个、134个、135个、136个、137个、138个、139个、140个、141个、142个、143个、144个、145个、146个、147个、148个、149个、150个、151个、152个、153个、154个、155个、156个、157个、158个、159个、160个、161个、162个、163个、164个、165个、166个、167个、168个、169个、170个、171个、172个、173个、174个、175个、176个、177个、178个、179个、180个、181个、182个、183个、184个、185个、186个、187个、188个、189个、190个、191个、192个、193个、194个、195个、196个、197个、198个、199个、200个、201个、202个、203个、204个、205个、206个、207个、208个、209个、210个、211个、212个、213个、214个、215个、216个、217个、218个、219个、220个、221个、222个、223个、224个、225个、226个、227个、228个、229个、230个、231个、232个、233个、234个、235个、236个、237个、238个、239个、240个、241个、242个、243个、244个、245个、246个、247个、248个、249个、250个、251个、252个、253个、254个、255个、256个、257个、258个、259个、260个、261个、262个、263个、264个、265个、266个、267个、268个、269个、270个、271个、272个、273个、274个、275个、276个、277个、278个、279个、280个、281个、282个、283个、284个、285个、286个、287个、288个、289个、290个、291个、292个、293个、294个、295个、296个、297个、298个、299个、300个、301个、302个、303个、304个、305个、306个、307个、308个、309个、310个、311个、312个、313个、314个、315个、316个、317个、318个、319个、320个、321个、322个、323个、324个、325个、326个、327个、328个、329个、330个、331个、332个、333个、334个、335个、336个、337个、338个、339个、340个、341个、342个、342个、344个、345个、346个、347个、348个、349个、350个、351个、352个、353个、354个、355个、356个、357个、358个、359个、360个、361个、362个、363个、364个、365个、366个、367个、368个、369个、370个、371个、372个、373个、374个、375个、376个、377个、378个、379个、380个、381个、382个、383个、384个、385个、386个、387个、388个、389个、390个、391个、392个、393个、394个、395个、396个、397个、398个、399个、400个核苷酸等(以及包括此类数目或完整基因的任何范围)。此类缺失和/或插入可导致几乎不表达基因(rna和/或蛋白)，并且如果由基因表达蛋白，则与野生型基因相比，它将不具有活性或具有降低的活性。通过常规方法将工程化核酸酶提供给植物或植物组织(例如，将编码工程化核酸酶的dna插入质粒(通常可操作地连接的元件，其包含启动子序列、工程化核酸酶、终止子(终止)序列和任选的抗生素抗性基因))，并且通过本领域可用的任何方法，包括例如引入细菌如根瘤农杆菌(agrobacterium)，还通过直接dna转移方法，将工程化核酸酶引入植物细胞中。用于将dna递送到细胞/组织(完整的植物细胞或部分降解的组织或植物细胞)中的各种方法是本领域已知的，并且包括如美国专利5,384,253所示的电穿孔；如美国专利5,015,580；5,550,318；5,538,880；6,160,208；6,399,861；和6,403,865所示的微粒轰击(基因枪)；如美国专利5,635,055；5,824,877；5,591,616；5,981,840；和6,384,301所示的农杆菌介导的转化；如美国专利5,508,184所示的原生质体转化、电穿孔、化学辅助转化、脂质体介导的转化(参见例如a.deshayes等人，(1985)emboj.4:2731-7.)、碳纤维、碳化硅纤维或硼酸铝纤维(一般称为晶须)(参见例如j.brisibe,exp.bot.51(343):187-196(2000)；dunwell(1999)methodsmo！.biol.111:375-82；以及美国专利5,464,765)、微注射(参见例如tj.reich等人，(1986)biotechnology4:1001-1004)和病毒介导的转化(参见例如s.b.gelvin，(2005)natbiotechnol.23:684-5、wo90/12107、wo03/052108和wo2005/098004)、用粘附于粒子的异源外来dna轰击植物细胞、弹道粒子加速、气溶胶束转化(美国专利申请20010026941；美国专利4,945,050；国际公布wo91/00915；美国专利申请2002015066、wo01/038514；上述文献全部以引用方式并入本文)、led转化、peg转化、以及用于转移dna的各种其他非粒子直接介导的方法。如本文所用，“直接dna转移”是将dna引入植物细胞中的任何方法，该方法不涉及使用天然的农杆菌属(agrobacteriumspp.)并且能够将dna引入植物细胞中。还将清楚的是，用于描述方法如“dna的引入”以及“植物从细胞再生”的术语并不意味着此类dna必然需要通过转化技术来引入。实际上，本领域技术人员将立即清楚的是，所关注的dna分子也可通过育种或杂交技术从一种植物引入另一种植物。因此，与本申请相关的“引入”涉及通过任何已知的方式将遗传信息置于植物细胞或植物中。这可通过本领域已知的用于将rna或dna转化到植物细胞、组织、原生质体或整株植物中的任何方法或通过将所述rna或dna渗入植物中来实现。在通过根瘤农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)将dna引入其中需要突变的植物、植物组织或植物细胞(例如低芥酸菜籽植物或植物组织；包括例如十字花科(brassicaceae)植物的若干品种，包括例如甘蓝型油菜(brassicanapus)、芜菁(brassicarapa)、白菜型油菜(b.campestris)或芥菜(brassicajuncea)以及突变的芸苔属植物)的情况下，将植物、植物组织、或植物细胞暴露于携带工程化的核酸酶的细菌。例如，可将植物浸入包含细菌的溶液中，或者可从植物叶(或可使用其他植物组织，诸如茎)中打孔得到盘状组织，并与含质粒的根瘤农杆菌(a.tumefaciens)的培养物一起培养。然后将盘状组织/植物组织置于产生愈伤组织的条件下(存在抗生素)。只有具有来自质粒(抗性基因)的dna的那些植物细胞/组织将具有抗生素抗性。因此，该条件通过杀死不包含质粒dna的那些细胞/组织来选择植物细胞/组织。在选择抗性愈伤组织后，将它们转移到诱导芽生长的培养基中，在培养基中它们长出根，然后转移到土壤中长成成熟植物。然后选择在所需基因中具有突变的那些植物(后代)(例如上文列出的那些)。选择过程可寻找目的基因和/或蛋白质活性(通常由目的基因产生的蛋白质)、以及抗生素抗性(插入细菌的质粒中包含的附加dna片段提供对特定抗生素的抗性)或序列的变化范围。与未暴露于工程化核酸酶(初始背景相同)的植物相比，在所需基因(rna和/或蛋白的表达)中具有降低至无活性的那些植物尤其受关注。如果细菌将任何外来dna插入到植物中，则这些植物可进一步繁殖直至这种dna不再是突变植物的部分。也可将植物进行育种，使它们对于突变(例如缺失)是纯合的。还提供了将一个或多个第一亲本植物与一个或多个第二亲本植物杂交的方法，第一亲本植物在sec62、kcr2、dgat1、fax1、mir394和/或had(以及任选的pdat1和/或enr)的一个或多个基因座处包含突变等位基因，并且第二亲本植物在sec62、kcr2、dgat1、fax1、mir394和/或had(以及任选的pdat1和/或enr)的不同基因座处包含突变等位基因，其中每个突变等位基因导致产生相对于对应的野生型(或如本文所述未发生突变的基因)sec62、kcr2、dgat1、fax1、mir394和/或had(以及任选的pdat1和/或enr)多肽具有降低的活性(或无活性)的多肽和/或序列(在mir394的情况下)(或根本不产生多肽)；以及选择在两个或更多个不同基因座处具有突变体等位基因的子代植物，从而获得期望的植物。植物产物与未如本文所述发生突变的植物(与在暴露于工程化核酸酶之前的植物具有相同遗传背景)相比，获自此类植物诸如芸苔属植物的油(低芥酸菜籽油)可具有低饱和脂肪酸含量或不具有饱和脂肪酸以及改变的油酸含量。种子中的油含量可通过本领域技术人员已知的方法进行测定。在另一方面，提供了生产油的方法。该方法包括压碎由本文所述的至少一种芸苔属植物产生的种子；以及从压碎的种子中提取油。此类油可用于食品组合物、用于食品的喷涂层、和/或用于油炸用途(诸如油炸食物以便生产油炸食品，诸如小吃片(例如，玉米或薯片)、炸薯条、或其他快餐食品)。本发明将在以下实施例中进一步描述，下文实施例不限制权利要求中描述的本发明的范围。实施例实施例1使用归巢核酸内切酶突变sec62使用sec62特异性的归巢核酸内切酶(期望的归巢核酸内切酶在低芥酸菜籽植物细胞中的表达导致植物基因组中sec62dna的特异性断裂；对其进行修复导致缺失、插入和/或碱基对改变)，生成sec62中具有缺失和/或添加的若干低芥酸菜籽植物(在1个至350个碱基对缺失和/或1个至100个碱基对插入的范围内；对于突变是杂合的或纯合的)。这导致与在暴露于工程化核酸酶之前具有与该植物的相同遗传背景的植物相比，表型的c18:0饱和脂肪的产量减少了约11％至约20％，总饱和脂肪酸减少了约2％至约9％。因此，sec62的靶向突变导致产生的饱和脂肪显著且出乎意料的减少。实施例2sec62突变和分析在所提供的下表中，脂肪酸通过碳链长度和链内双键的数目来表示。例如，c14:0是指肉豆蔻酸；c16:0是指棕榈酸；c18:0是指硬脂酸；c18:1是指油酸；c18:2是指亚油酸；c18:3是指ala；c20:0是指二十烷酸；c20:1是指二十碳烯酸；c22:0是指二十二烷酸；c22:1是指芥酸；c24:0是指二十四烷酸；并且c24:1是指神经酸。“总饱和脂肪酸”是指c14:0、c16:0、c18:0、c20:0、c22:0、和c24:0的总量。针对每个指定的样品提供代表性的脂肪酸谱。除非另外指明，否则所有百分比是指基于油中的总脂肪酸(即，脂肪酸部分)计的脂肪酸％。通过使芸苔属植物的细胞经受工程化归巢核酸内切酶处理，然后进行序列分析(图1a-图1j)和饱和脂肪酸产量分析(表1和表2)，获得了具有较低饱和脂肪酸含量的芸苔属植物。所述突变植物品系中饱和脂肪酸产量的平均结果在表1(cargill背景；sec62n13和n15)和表2(imc201背景；sec62n11)中给出，它们示出了通过本文所述方法制备的突变植物品系，其饱和脂肪酸18:0(硬脂酸)减少了约16％至约20％，总饱和脂肪酸减少了约6％至约9％。“野生型”表示相同遗传背景的非突变(例如野生型等位基因)植物的平均结果。表1：表2实施例3使用归巢核酸内切酶突变kcr2使用kcr2特异性的归巢核酸内切酶(期望的归巢核酸内切酶在低芥酸菜籽植物细胞中的表达导致植物基因组中kcr2dna的特异性断裂；对其进行修复导致缺失、插入和/或碱基对改变)，生成kcr2中具有缺失和/或添加的若干低芥酸菜籽植物(在1个至350个碱基对缺失和/或1个至100个碱基对插入的范围内；对于突变是杂合的和/或纯合的)。这导致与在暴露于工程化核酸酶之前具有与该植物的相同遗传背景的植物相比，表型的c18:0饱和脂肪的产量减少了约15％至约17％，总饱和脂肪酸减少了约6％至约7％。因此，kcr2的靶向突变导致产生的饱和脂肪显著且出乎意料的减少。实施例4kcr2突变和分析除非另外指明，否则所有百分比是指基于油中的总脂肪酸(即，脂肪酸部分)计的脂肪酸％。通过使芸苔属植物的细胞经受工程化归巢核酸内切酶处理，然后进行序列分析(图2a-图2p)和饱和脂肪酸产量分析(表3)，获得了具有较低饱和脂肪酸含量的芸苔属植物。所述突变植物品系中饱和脂肪酸产量的平均结果在表3(03lcll和imc201背景)中给出，它们示出了通过本文所述方法制备的突变植物品系，其饱和脂肪酸18:0(硬脂酸)减少了约11％至约17％，总饱和脂肪酸减少了约1％至约7％。“野生型”表示相同遗传背景的非突变(例如野生型等位基因)植物的平均结果。表3：平均饱和脂肪酸含量及减少实施例5使用归巢核酸内切酶突变dgat1使用dgat1特异性的归巢核酸内切酶(期望的归巢核酸内切酶在低芥酸菜籽植物细胞中的表达导致植物基因组中dgat1dna的特异性断裂；对其进行修复导致缺失、插入和/或碱基对改变)，生成dgat1中具有缺失和/或添加的若干低芥酸菜籽植物(在1个至350个碱基对缺失和/或1个至100个碱基对插入的范围内；对于突变是杂合的和/或纯合的)。这导致与在暴露于工程化核酸酶之前具有与该植物的相同遗传背景的植物相比，表型的c18:0饱和脂肪的产量减少了约20％至约24％，总饱和脂肪酸减少了约8％至约9％。因此，dgat1的靶向突变导致产生的饱和脂肪显著且出乎意料的减少。实施例6dgat1突变和分析除非另外指明，否则所有百分比是指基于油中的总脂肪酸(即，脂肪酸部分)计的脂肪酸％。通过使芸苔属植物的细胞经受工程化归巢核酸内切酶处理，然后进行序列分析(图3a-图3g)和饱和脂肪酸产量分析(表4)，获得了具有较低饱和脂肪酸含量的芸苔属植物。所述突变植物品系中饱和脂肪酸产量的平均结果在表4(imc201背景)中给出，它们示出了通过本文所述方法制备的突变植物品系，其饱和脂肪酸18:0(硬脂酸)减少了约20％至约24％，总饱和脂肪酸减少了约8％至约9％。“野生型”表示相同遗传背景的非突变(例如野生型等位基因)植物的平均结果。表4：平均饱和脂肪酸含量及减少实施例7使用归巢核酸内切酶突变fax1使用fax1特异性的归巢核酸内切酶(期望的归巢核酸内切酶在低芥酸菜籽植物细胞中的表达导致植物基因组中fax1dna的特异性断裂；对其进行修复导致缺失、插入和/或碱基对改变)，生成fax1中具有缺失和/或添加的若干低芥酸菜籽植物(在1个至350个碱基对缺失和/或1个至100个碱基对插入的范围内；对于突变是杂合的和/或纯合的)。这导致与在暴露于工程化核酸酶之前具有与该植物的相同遗传背景的植物相比，表型的c18:0饱和脂肪的产量减少了约7％至约18％，总饱和脂肪酸减少了约2％至约7％。因此，fax1的靶向突变导致产生的饱和脂肪显著且出乎意料的减少。实施例8fax1突变和分析除非另外指明，否则所有百分比是指基于油中的总脂肪酸(即，脂肪酸部分)计的脂肪酸％。通过使芸苔属植物的细胞经受工程化归巢核酸内切酶处理，然后进行序列分析(图4a-图4n)和饱和脂肪酸产量分析(表5)，获得了具有较低饱和脂肪酸含量的芸苔属植物。所述突变植物品系中饱和脂肪酸产量的平均结果在表5(imc201背景)中给出，它们示出了通过本文所述方法制备的突变植物品系，其饱和脂肪酸18:0(硬脂酸)减少了约13％至约17％，总饱和脂肪酸减少了约3％至约6％。“野生型”表示相同遗传背景的非突变(例如野生型等位基因)植物的平均结果。表5：实施例9使用归巢核酸内切酶突变pdat1使用磷脂:二酰甘油酰基转移酶1(pdat1)特异性的归巢核酸内切酶(期望的归巢核酸内切酶在低芥酸菜籽植物细胞中的表达导致植物基因组中pdat1dna的特异性断裂；对其进行修复导致缺失、插入和/或碱基对改变)，生成pdat1中具有缺失和/或添加的若干低芥酸菜籽植物(在1个至350个碱基对缺失和/或1个至100个碱基对插入的范围内；对于突变是杂合的和/或纯合的)。这导致与在暴露于工程化核酸酶之前具有与该植物的相同遗传背景的植物相比，表型的c18:0饱和脂肪的产量减少了约6％至约15％，总饱和脂肪酸减少了约2％至约4％。因此，pdat1的靶向突变导致产生的饱和脂肪显著且出乎意料的减少。实施例10pdat1突变和分析除非另外指明，否则所有百分比是指基于油中的总脂肪酸(即，脂肪酸部分)计的脂肪酸％。通过使芸苔属植物的细胞经受工程化归巢核酸内切酶处理，然后进行序列分析(图5a-图5q)和饱和脂肪酸产量分析(表6)，获得了具有较低饱和脂肪酸含量的芸苔属植物。所述突变植物品系中饱和脂肪酸产量的平均结果在表6(imc201背景)中给出，它们示出了通过本文所述方法制备的突变植物品系，其饱和脂肪酸18:0(硬脂酸)减少了约6％至约15％，总饱和脂肪酸减少了约2％至约4％。“野生型”表示相同遗传背景的非突变(例如野生型等位基因)植物的平均结果。表6：实施例11使用归巢核酸内切酶突变enr使用脂烯酰基酰基载体蛋白还原酶(enr)特异性的归巢核酸内切酶(期望的归巢核酸内切酶在低芥酸菜籽植物细胞中的表达导致植物基因组中enrdna的特异性断裂；对其进行修复导致缺失、插入和/或碱基对改变)，生成enr中具有缺失和/或添加的若干低芥酸菜籽植物(在1个至400个碱基对缺失和/或1个至100个碱基对插入的范围内；对于突变是杂合的和/或纯合的)。这导致与在暴露于工程化核酸酶之前具有与该植物的相同遗传背景的植物相比，表型的c18:0饱和脂肪的产量减少了约9％至约12％，总饱和脂肪酸减少了约2％至约4％。因此，enr的靶向突变导致产生的饱和脂肪显著且出乎意料的减少。实施例12enr突变和分析除非另外指明，否则所有百分比是指基于油中的总脂肪酸(即，脂肪酸部分)计的脂肪酸％。通过使芸苔属植物的细胞经受工程化归巢核酸内切酶处理，然后进行序列分析(图6a-图6j)和饱和脂肪酸产量分析(表7)，获得了具有较低饱和脂肪酸含量的芸苔属植物。所述突变植物品系中饱和脂肪酸产量的平均结果在表7(imc201背景)中给出，它们示出了通过本文所述方法制备的突变植物品系，其饱和脂肪酸18:0(硬脂酸)减少了约9％至约12％，总饱和脂肪酸减少了约2％至约4％。“野生型”表示相同遗传背景的非突变(例如野生型等位基因)植物的平均结果。表7：实施例13使用归巢核酸内切酶突变mir394使用mir394特异性的归巢核酸内切酶(期望的归巢核酸内切酶在低芥酸菜籽植物细胞中的表达导致植物基因组中mir394dna的特异性断裂；对其进行修复导致缺失、插入和/或碱基对改变)，生成mir394中具有缺失和/或添加的若干低芥酸菜籽植物(在1个至350个碱基对缺失和/或1个至100个碱基对插入的范围内；对于突变是杂合的和/或纯合的)。这导致与在暴露于工程化核酸酶之前具有与该植物的相同遗传背景的植物相比，表型的c18:0饱和脂肪的产量减少了约15％至约22％，总饱和脂肪酸减少了约4％。因此，mir394的靶向突变导致产生的饱和脂肪显著且出乎意料的减少。实施例14mir394突变和分析除非另外指明，否则所有百分比是指基于油中的总脂肪酸(即，脂肪酸部分)计的脂肪酸％。通过使芸苔属植物的细胞经受工程化归巢核酸内切酶处理，然后进行序列分析(图7a-图7g)和饱和脂肪酸产量分析(表8)，获得了具有较低饱和脂肪酸含量的芸苔属植物。所述突变植物品系中饱和脂肪酸产量的平均结果在表8(cargill背景)中给出，它们示出了通过本文所述方法制备的突变植物品系，其饱和脂肪酸18:0(硬脂酸)减少了约19％，总饱和脂肪酸减少了约3％至约6％。“野生型”表示相同遗传背景的非突变(例如野生型等位基因)植物的平均结果。表8：实施例15使用归巢核酸内切酶突变had使用had特异性的归巢核酸内切酶(期望的归巢核酸内切酶在低芥酸菜籽植物细胞中的表达导致植物基因组中haddna的特异性断裂；对其进行修复导致缺失、插入和/或碱基对改变)，生成had中具有缺失和/或添加的若干低芥酸菜籽植物(在1个至350个碱基对缺失和/或1个至100个碱基对插入的范围内；对于突变是杂合的和/或纯合的)。这导致与在暴露于工程化核酸酶之前具有与该植物的相同遗传背景的植物相比，表型的c18:0饱和脂肪的产量减少了约16％至约27％，总饱和脂肪酸减少了约5％至约12％。因此，had的靶向突变导致产生的饱和脂肪显著且出乎意料的减少。实施例16had突变和分析除非另外指明，否则所有百分比是指基于油中的总脂肪酸(即，脂肪酸部分)计的脂肪酸％。通过使芸苔属植物的细胞经受工程化归巢核酸内切酶处理，然后进行序列分析(图8a-图8g)和饱和脂肪酸产量分析(表9)，获得了具有较低饱和脂肪酸含量的芸苔属植物。所述突变植物品系中饱和脂肪酸产量的平均结果在表9(cargill背景或imc201背景)中给出，它们示出了通过本文所述方法制备的突变植物品系，其饱和脂肪酸18:0(硬脂酸)减少了约20％至约27％，总饱和脂肪酸减少了约5％至约12％。“野生型”表示相同遗传背景的非突变(例如野生型等位基因)植物的平均结果。表9：附加实施方案一些实施方案提供了在靶位点处使芸苔属植物细胞的基因组突变的方法，该方法包括：a)在所述靶位点处诱导双链dna断裂，所述双链断裂通过向所述细胞引入双链dna断裂诱导(dsbi)酶来诱导，该双链dna断裂诱导(dsbi)酶识别在sec62、kcr2、dgat1、fax1、mir394、had、pdat1、和/或enr序列中的至少一个中的所述靶位点附近或所述靶位点处的识别序列；以及b)选择植物细胞，其中所述双链dna断裂已经修复，导致在基因组中的所述靶位点处的修饰，其中所述修饰是至少一个核苷酸的取代、至少一个核苷酸的缺失、至少一个核苷酸的插入或它们的任何组合。其他实施方案提供了产生具有减少的饱和脂肪酸的芸苔属植物的方法，该方法包括：a)在靶位点处诱导双链dna断裂，所述双链断裂通过向植物细胞引入双链dna断裂诱导(dsbi)酶来诱导，该双链dna断裂诱导(dsbi)酶识别在sec62、kcr2、dgat1、fax1、mir394、had、pdat1、和/或enr序列中的至少一个中的所述靶位点附近或所述靶位点处的识别序列；以及b)选择植物细胞，其中所述双链dna断裂已经修复，导致在基因组中的所述靶位点处的突变，其中所述突变是至少一个核苷酸的取代、至少一个核苷酸的缺失、至少一个核苷酸的插入或它们的任何组合；以及c)将b)的所述植物细胞再生为植物；其中所述突变导致与尚未通过所述dsbi和修复进行突变的具有相同遗传背景的对照植物相比，所述植物的饱和脂肪酸产量减少。几个实施方案提供突变芸苔属植物，该植物在sec62、kcr2、dgat1、fax1、mir394、had、pdat1、和/或enr的至少一个等位基因中包含缺失或插入。参考文献d’halluin等人，2013.targetedmoleculartraitstackingincottonthroughtargeteddouble-strandbreakinduction.plantbiotechj11:933-41.djukanovic等人，2013.male-sterilemaizeplantsproducedbytargetedmutagenesisofthecytochromep450-likegene(ms26)usingare-designedi-creihomingendonuclease.theplantjournal76:888-99.gao等人，2010.heritabletargetedmutagenesisinmaizeusingadesignedendonuclease.theplantjournal61:176-187.honig等人，2015.transientexpressionofvirallydeliveredmeganucleaseinplantageneratesinheritedgenomicdeletions.molplant8:1292-4.puchta&fauser.2014.syntheticnucleasesforgenomeengineeringinplants:prospectsforabrightfuture.theplantjournal78:727-741.sprink等人，2015.plantgenomeeditingbynoveltools:talenandothersequencespecificnucleases.currentopinioninbiotech32:47-53.tzfira等人，2012.genomemodificationsinplantcellsbycustom-maderestrictionenzymes.plantbiotechjournal10:373-389.本文引用的所有专利、专利申请、登录号和出版物均全文以引用方式并入本文。序列表<110>m·卡默泽尔嘉吉公司<120>用于在植物中产生突变的工程化核酸酶<130>4361.101wo1<150>62/788,578<151>2019-01-04<160>117<170>windows4.0版的fastseq<210>1<211>1740<212>dna<213>甘蓝型油菜（brassicanapus）<400>1atgaagaagcctgccggaaccgagaag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