用于提取藻蓝蛋白的方法与流程

1.本发明涉及一种用于通过选择性沉淀提取和纯化通过发酵微藻产生的、特别是由嗜硫原始红藻(galdieria sulphuraria)产生的藻蓝蛋白的新颖方法。


背景技术：

2.通过硫酸铵沉淀纯化从嗜硫原始红藻和螺旋藻属(spirulina)中提取的藻胆蛋白已描述在文献(moon等人,2015；cruz de jes
ú
s等人,2006,cn106190853)中，但在工业规模上应用非常困难，因为它需要大量的硫酸铵，这给硫酸铵和上清液的再加工带来显著的问题。
3.描述为获得高纯度水平的其他纯化方法，诸如色谱法或离子交换树脂纯化(jp 2004359638)，实施起来非常昂贵。
4.已经描述了在粗藻蓝蛋白溶液中添加酸来纯化螺旋藻属藻蓝蛋白(tn 2009000406、jp 2004359638、jp 06271783、cn 106190853)。然而，考虑到螺旋藻属藻蓝蛋白的等电点约4.5并且接近于大量其他蛋白质的等电点，这种方法不允许选择性沉淀并且因此不允许纯化藻蓝蛋白。类似地，一些人描述了使用水杨酸从螺旋藻属中沉淀藻蓝蛋白(wo 2016/030643)。使用这种酸会产生pc的非选择性沉淀，并且所得的沉淀物特别难以再溶解。用温泉红藻属pc(galdieria pc)获得了相同的结果。
5.藻蓝蛋白提取方法总体上包括使微藻发酵的水性粗提取物中存在的除藻蓝蛋白以外的有机物沉淀以将藻蓝蛋白保留在上清液中，上清液将被过滤，然后使藻蓝蛋白沉淀(jp 2004359638)。然而，一些有机化合物，特别是复杂的多糖诸如糖原，在与藻蓝蛋白相同的条件下仍然可溶。
6.在工业藻蓝蛋白纯化方法中，可以使用过滤(超滤)步骤以去除水，从而浓缩藻蓝蛋白并且去除小于所用过滤器的截止阈值的小分子(蛋白质、离子、有机酸等)以便获得可能的最纯藻蓝蛋白。然而，过滤器的截止阈值低于糖原的尺寸，它不被去除并且增加渗余物的粘度，从而降低过滤速率。糖原的浓度依赖性粘度效应已使用来自嗜硫原始红藻的纯化糖原得到证实(martinez
‑
garcia等人，2017)。
7.此外，所获得的纯化藻蓝蛋白保留了高水平的这些糖，这可能改变藻蓝蛋白的品质，特别是它们的着色力，从而需要生产和/或使用更大量的藻蓝蛋白以达到相同的效果。这些残留的多糖充当填料，其加入到藻蓝蛋白的制造成本中并且可能限制所得藻蓝蛋白的商业用途，例如在具有低糖含量的食品的制备中。
8.目的是既从品质的角度又从工业和经济角度改善用于提取和纯化从生物质中提取的藻蓝蛋白的方法，值得注意地是通过降低最终产物中的残留糖含量，特别是残留糖原含量。


技术实现要素：

9.根据本发明的方法包括在保障藻胆蛋白的完整性并且允许主要杂质(特别是多
糖，包括糖原)保留在溶液中的条件下直接从含有藻蓝蛋白的粗提取物中进行藻蓝蛋白的选择性沉淀。
10.这种选择性沉淀源于对两种因素的组合动作，同时或以任何顺序顺序地，一方面是溶液的ph并且另一方面是藻蓝蛋白的浓度。
11.根据本发明的方法特别适用于纯化由嗜硫原始红藻产生的酸性ph抗性藻蓝蛋白。
具体实施方式
12.本发明涉及一种用于从包含一种或多种藻蓝蛋白的溶液(也称为初始藻蓝蛋白溶液)中提取藻蓝蛋白的方法，其包括选择性沉淀步骤，所述选择性沉淀步骤在一方面包括将初始溶液的ph调节至在所述藻蓝蛋白较不可溶的ph值范围(也称为不稳定范围)内的选择值，并且在另一方面包括将溶液中的藻蓝蛋白浓缩以促进其沉淀，以及然后是回收沉淀的藻蓝蛋白的步骤。
13.ph调节和浓缩两个动作可以同时或顺序地进行，通过在浓缩前调节所述初始溶液的ph或通过在调节所述ph前浓缩所述初始溶液。
14.令人惊讶地，不同的浓度条件意指只有藻蓝蛋白沉淀，可以被描述为杂质的其他产物、特别是多糖保留在溶液中。
15.因此，有可能通过将沉淀的藻蓝蛋白从溶液中分离来回收它们，并且如果需要将它们干燥以获得纯化藻蓝蛋白粉末。
16.根据本发明的方法不仅允许从溶液中提取藻蓝蛋白，而且还允许在同一步骤中将其纯化，所获得的藻蓝蛋白特别纯并且残留糖含量低。
17.根据本发明的方法特别适用于纯化从产生藻蓝蛋白的微生物培养物中提取的藻蓝蛋白溶液，所述微生物培养物还产生糖原，特别是在工业藻蓝蛋白生产方法的背景下，所述工业藻蓝蛋白生产方法包括培养所述微生物，然后回收产生的生物质以提取藻蓝蛋白，并且从此生物质中回收藻蓝蛋白。
18.所述方法特别适用于由产生高水平糖原的微生物产生的藻蓝蛋白，尤其适用于从包含基于总干物质多于10％糖原的生物质中提取和纯化藻蓝蛋白。
19.产生藻蓝蛋白的微生物是众所周知的，包括cyanidiale目的藻类(或微藻)。cyanidiale目包括cyanidiaceae或galdieriaceae科，它们本身又细分为cyanidioschyzon、cyanidium或温泉红藻属(galdieria)，属于其中的尤其是物种cyanidioschyzon merolae 10d、cyanidioschyzon merolae dbv201、高温红藻(cyanidium caldarium)、cyanidium daedalum、cyanidium maximum、cyanidium partitum、cyanidium rumpens、galdieria daedala、galdieria maxima、galdieria partita或嗜硫原始红藻。可以特别提及菌株嗜硫原始红藻(也称为高温红藻)utex 2919。
20.还可以提及已知的藻蓝蛋白生产者，诸如节旋藻属(arthrospira)的丝状蓝藻细菌，它们是在螺旋藻属的通用名称下工业培养的。
21.在上面提及的微生物中，特别鉴定了产生具有高糖原含量的藻蓝蛋白的微生物，尤其是cyanidioschyzon、cyanidium和温泉红藻属物种，更特别是嗜硫原始红藻。
22.用于培养产生藻蓝蛋白的微生物的工业方法是本领域技术人员众所周知的。可以特别提及专利申请wo 2017/093345、wo 2017/050917。
23.从生物质中回收藻蓝蛋白也是技术人员已知的。可以特别提及专利申请wo 2018/178334。它通常需要细胞、机械或酶促裂解以便释放在微生物的细胞隔室中的产生的藻蓝蛋白的步骤。此裂解有利地在有利于藻蓝蛋白溶解的ph下进行。这种细胞裂解通常将产生藻蓝蛋白溶液，所述溶液包含悬浮的有机物质(称为粗悬浮液)，可以通过常规过滤方法将其分离。然后获得粗藻蓝蛋白溶液，可以将所述粗藻蓝蛋白溶液通过常规超滤方法进一步纯化以去除低分子量有机残留物以获得精制溶液，可以通过常规沉淀和干燥方法从所述精制溶液中获得藻蓝蛋白。可以特别提及在陶瓷膜或有机膜(诸如聚醚砜中空纤维)上的切向过滤。可以选择这些过滤器的阈值来分离分子量高于或低于目标藻胆蛋白的分子。
24.根据本发明的方法特别适用于纯化酸性ph抗性藻蓝蛋白溶液，特别是申请wo 2017/050918中描述的藻蓝蛋白。
25.具体地，根据本发明的方法用于纯化由嗜硫原始红藻产生的酸性ph抗性藻蓝蛋白，更特别地在用于通过发酵罐培养嗜硫原始红藻的生产这些藻蓝蛋白的工业方法中。
26.有利地实施所述方法以从获自产生藻蓝蛋白的微生物生物质的粗汁液中提取藻蓝蛋白。
27.有利地，初始藻蓝蛋白溶液、特别是粗汁液包含从0.1至10g/l的藻蓝蛋白。
28.浓缩包括去除水以便获得至少15g/l、优选至少20g/l、更优先至少30g/l或甚至至少40g/l的藻蓝蛋白含量。
29.此浓度可以定义为基于初始溶液中藻蓝蛋白含量的体积损失％。
30.在工业藻蓝蛋白生产方法中，粗汁液将有利地包含至少1g/l的藻蓝蛋白。在这种情况下，浓缩将包括去除初始液体体积的至少93％。
31.通过允许在保留藻蓝蛋白完整性的条件下去除水分的任何已知方法来完成浓缩。可以提到水蒸发方法，特别是在保障藻蓝蛋白完整性而不影响其着色力的温度条件下在减压下促进这种蒸发。还可以提及允许去除液体的方法，诸如具有允许溶液中的水和小分子通过但保留蛋白质的孔径的切向过滤。
32.这些过滤方法和用于实施它们的装置是本领域技术人员众所周知的，特别是来自repligen的spectrum labs tff系统。对于藻蓝蛋白，选择孔为50kd至100kd的过滤器是有利的，特别是聚醚砜或聚砜过滤器。
33.ph调节包括将酸或碱添加到初始溶液或浓缩溶液中，以便达到不稳定范围内的ph值。不稳定范围将取决于待纯化的藻蓝蛋白以及特别是产生它的微生物。通常，这种不稳定范围是从4.5至5.5，特别是对于如上所述的酸性ph抗性藻蓝蛋白。
34.对于这些酸性ph抗性藻蓝蛋白，细胞裂解是在酸性ph、优选低于4.5、通常约4、甚至低至3下进行的。
35.然后，ph调节由以下组成：添加碱以达到在不稳定范围内的ph。
36.根据本发明的第一实施方案，所述方法首先包括将初始汁液浓缩。在这种情况下，浓缩在有利于藻蓝蛋白溶解的ph下(即在不稳定范围之外)进行。对于上述酸性ph抗性藻蓝蛋白，这些有利于藻蓝蛋白溶解的ph将有利地低于4或高于5。
37.根据本发明的另一个优选实施方案，所述方法包括首先包括将ph调节至不稳定范围，并且然后将溶液浓缩直至藻蓝蛋白沉淀。
38.所述方法于是可以被描述为从初始溶液获得不稳定ph的溶液，然后将不稳定ph的
溶液浓缩以引起藻蓝蛋白的沉淀。当观察到藻蓝蛋白沉淀时，将达到体积减少的百分比。
39.此选择性沉淀步骤有利地在室温下进行。当然，本领域技术人员将能够以有利于沉淀的方式改变温度，例如通过降低温度来实施所述步骤的第二部分(浓度或ph调节)，在此期间发生沉淀。
40.然后可以通过常规多糖沉淀方法回收溶液中的多糖，特别是糖原，例如通过添加乙醇(martinez
‑
garcia等人，2016)，随后也可以将所述多糖纯化。
41.根据本发明的一个具体实施方案，使具有藻蓝蛋白的初始溶液中所含的多糖经受酶促裂解，这有利于它们在溶液中的保留。这些微量的多糖很可能被藻蓝蛋白沉淀带走，所述多糖已是低的，当多糖被裂解成甚至更易溶的低分子量寡糖时甚至进一步减少。此外，当通过切向过滤进行浓缩步骤时，低分子量寡糖与溶液中的其他小分子一起被去除，这有利于获得具有甚至更高藻蓝蛋白含量的溶液。
42.特别地，糖原的酶促裂解在室温下在小于或等于5、优选约4.5的ph下进行。
43.这些温度和ph条件特别适合在酶促反应过程中保留藻蓝蛋白。
44.在酸性ph条件和室温下有活性的酶选自已知具有α1
‑
4葡萄糖醛酸酶、α1
‑
4葡萄糖苷酶(或α
‑
葡萄糖苷酶)活性的酶。将特别提及已知降解果胶的果胶酶，并且特别是从丝状真菌诸如曲霉属(aspergillus)中提取的果胶酶，更特别是从棘孢曲霉(aspergillus aculeatus)中提取的果胶酶，诸如由novozymes公司以名称销售的酶。
45.除了α1
‑
4葡萄糖醛酸酶或α1
‑
4葡萄糖苷酶外，还可以用α1
‑
6葡萄糖苷酶实现糖原的酶促裂解。在上面阐述的ph和温度条件下有活性的α1
‑
6葡萄糖苷酶也是技术人员已知的。特别地，这些是已知水解支链淀粉的α1
‑
6糖苷键、特别是已知去除淀粉分支的支链淀粉酶。
46.这些通常是从细菌中提取的酶，特别是从芽孢杆菌属(bacillus)中提取的酶。us 6,074,854、us 5,817,498和wo 2009/075682描述了从bacillus deramificans或嗜酸普鲁兰芽孢杆菌(bacillus acidopullulyticus)中提取的此类支链淀粉酶。可商购的支链淀粉酶也是已知的，特别是名称为“promozyme d2”(novozymes)、“novozym 26062”(novozymes)和“optimax l 1000”(dupont
‑
genencor)。
47.应注意，在现有技术中描述了支链淀粉酶/α
‑
淀粉酶混合物，但特别是用于从淀粉生产葡萄糖浆(us 2017/159090)。
48.技术人员将知道如何确定适当的反应条件以最佳地减少随待处理溶液中初始糖原含量、所用酶的量和所产生的藻蓝蛋白的希望纯度变化的糖原量。
49.固体沉淀藻蓝蛋白的回收通过技术人员已知的任何方法(诸如过滤或离心)进行。
50.技术人员将能够设想回收固体的任何方法以减少待通过过滤或离心处理的体积。
51.这种回收可以不连续、分批或连续进行，其中添加初始溶液以补偿固体藻蓝蛋白的回收。
52.这些连续回收步骤将有利地在通过对不稳定ph的溶液的切向过滤进行浓缩的情况下来实施，本领域技术人员能够调节去除水和供应不稳定ph的溶液的相应流速以促进藻蓝蛋白的沉淀。
53.此类连续过程将特别适于处理初始溶液，其中多糖，特别是糖原将经历酶促裂解，这有利于通过切向过滤将其与水和其他可溶性小分子一起去除。
54.本发明还涉及一种通过微生物发酵生产藻蓝蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：(i)培养所述微生物以获得富含藻蓝蛋白的生物质，(ii)回收生物质并且进行细胞裂解以使释放的藻蓝蛋白溶解在细胞颗粒悬浮液中，(iii)澄清先前获得的悬浮液以获得粗藻蓝蛋白溶液，以及(iv)从先前获得的粗溶液中回收藻蓝蛋白，其特征在于藻蓝蛋白的回收包括如上定义的选择性沉淀步骤。
55.然后可以通过任何合适的方法干燥回收的固体，并且如果需要，进行研磨。
56.也可以通过技术人员已知的方法诸如渗滤使回收的包含藻蓝蛋白的固体经受纯化。
57.发酵培养、生物质回收、裂解和澄清的方法是技术人员众所周知的，特别是专利申请wo 2017/050917、wo 2017/093345和wo 2018/178334中描述的那些。
58.根据本发明实施的选择性沉淀在待处理的材料的量以及干燥固体藻蓝蛋白并且研磨它所需的能量两个方面总体上降低从初始溶液、特别是从粗汁液生产藻蓝蛋白粉末所需的能量。
59.通过此方法获得的藻蓝蛋白具有至少2、优选至少3、或甚至高于4的纯度指数。
60.此纯度指数是通过吸光度测量用moon等人(2014)描述的方法测量的。
61.有利地，所获得的藻蓝蛋白是具有低于6、有利地低于4、优选低于3、更优先低于2.5、甚至更优先低于1的糖原/藻蓝蛋白比率(按干重计)的藻蓝蛋白。
62.本发明还涉及获得的藻蓝蛋白作为着色剂、特别是作为食品着色剂的用途。本发明还涉及包含根据本发明的低糖原藻蓝蛋白的固体或液体食物，特别是饮料。
附图说明
63.图1示出了在初始溶液中不同藻蓝蛋白浓度和不同ph下获得的沉淀物的质量。
64.图2示出了对于不同藻蓝蛋白浓度，在沉淀物回收后上清液中的藻蓝蛋白浓度随ph的变化。
65.实施例
66.材料和方法
67.菌株：嗜硫原始红藻(也称为高温红藻)utex#2919。
68.培养条件：
69.生物质是使用专利wo 2017050918 a1中描述的条件通过补料分批发酵获得的。
70.提取条件：
71.使用kd球磨机(willy a.bachofen ag maschinenfabrik)对细胞进行机械研磨。由于藻蓝蛋白(pc)是亲水性分子，因此通过用碱(naoh、koh、nh4oh等)或酸(h2so4、柠檬酸等)将ph调节到所希望的值将其用水提取。通过在室温下以10000g离心10min分离细胞碎片后，回收粗pc提取物。通过用具有允许保留藻蓝蛋白的截留阈值的陶瓷或有机膜的切向过滤，将粗提取物浓缩。然后将样品离心以将沉淀物与上清液分离。用精密天平测量沉淀的质量。将沉淀重悬于允许其重新溶解的ph 7的水溶液中，以便量化沉淀的藻蓝蛋白。
72.pc确定：
73.通过使用使用moon等人(moon等人,korean j.chem.eng.,2014,1
‑
6)描述的方法
进行吸光度测量进行藻蓝蛋白含量和纯度指数的估计。
74.实施例1：浓度和ph对藻蓝蛋白(pc)沉淀和纯化的影响
75.将初始浓度为1g/l的pc和初始纯度为1.6的粗藻蓝蛋白溶液通过在ph 4下切向过滤进行浓缩以获得浓度为20g/l、然后30g/l和然后45g/l的渗余物。在过滤过程中可以观察到产物纯度的增加，然而尽管所述产物的浓缩程度，但此纯度不超过值2。在图1中可以看出，对于20g/l的浓度，藻蓝蛋白的沉淀在ph 4下是低的并且随着ph向更高值增加而略微增加(图1)。同时，在此ph升高期间上清液中可溶性藻蓝蛋白浓度的测量显示出相对小的降低。对于30g/l的pc浓度，这种因ph变化而沉淀的现象明显得多，并且在4.5和5.5值时出现最大值(图1和图2)。在进一步过滤并且将藻蓝蛋白浓缩至最多40g/l可溶的值后，即使在ph改变之前，在过滤过程中也观察到显著沉淀物的形成(图1)。如前，ph的变化会增加藻蓝蛋白沉淀的现象。
76.通过切向过滤，藻蓝蛋白的纯度降低，并且收集并且在ph 7下重新溶解的沉淀物的纯度相反。这表明藻蓝蛋白优先沉淀，藻蓝蛋白可以在更有利的ph条件下重新溶解。
77.表1报告了在ph 7.5下重新溶解对于沉淀的藻蓝蛋白沉淀物后藻蓝蛋白纯度的测量。
78.表1
[0079][0080][0081]
实施例2：浓度和ph对来自酶消化样品的pc的沉淀和纯化的影响。
[0082]
在此实施例中，使粗溶液经受酶促消化以降解存在的糖原。在室温和ph＝4下用α1
‑
4葡萄糖醛酸酶(“pectinex ultra sp
‑
l”)和α1
‑
6葡萄糖苷酶(“novozyme 26062”)进行酶促降解。
[0083]
通过切向过滤进行富集以使藻蓝蛋白浓度达到几十g/l，并且然后进行ph调节，从而引起沉淀。取ph 4.5、5和5.5的样品，在收集沉淀并且用ph 7.5的缓冲溶液重新溶解后测量残留的可溶性藻蓝蛋白并且测量沉淀的藻蓝蛋白。
[0084]
与先前的实施例类似，对于包括在4.5与5.5之间的ph范围，沉淀是显著的，并且在这种情况下的纯度水平在沉淀的藻蓝蛋白重新溶解后达到高于3.8的值。糖原的酶促消化不影响通过沉淀的纯化。下表2给出了在通过调节至不稳定性ph而沉淀后以及还在藻蓝蛋白沉淀物重新溶解后藻蓝蛋白的纯度指数值。
[0085]
表2
[0086][0087]
参考文献
[0088]
‑
cruz de jes
ù
s et al.,int j food nutr sci(2016)3(3):1
‑0[0089]
‑
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‑
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‑6[0092]
‑
tn 2009000406,us 6,074,854,us 5,817,498,us 2017/159090,wo 2009/075682,wo 2016/030643,wo 2017/050917,wo 2017/050918,wo 2017/093345,wo 2018/178334