特异性结合球系列聚糖的单域抗体的制作方法

文档序号:30012351发布日期:2022-05-11 19:48阅读:335来源:国知局
特异性结合球系列聚糖的单域抗体的制作方法

1.本发明涉及针对球系列聚糖(特别是globo h)的单域抗体(sdab)的领域。更详细地,本发明涉及特异性结合选自globo h、gb3、gb4和gb5的一种或多种聚糖的sdabs。本发明还提供了包含多聚体单域抗体的多肽,以及包含所述抗聚糖sdabs的t细胞嵌合抗原受体。因此,本发明提供了可用于靶向和/或治疗与过表达所述globo h和/或gb3、gb4、gb5的细胞相关的几种类型癌症的多肽。本发明还涉及编码所述多肽的重组核酸序列,以及包含所述重组核酸序列的表达载体和宿主细胞。


背景技术:

2.球系列聚糖包含一组中性鞘糖脂,其中神经酰胺与具有galnacβ3galα4galβ4glc根结构的聚糖连接。通常,这些聚糖保留在质膜上并聚集成脂筏。该聚糖家族的内源性功能在很大程度上是未知的。然而,它们的表达确实发生在发育的早期阶段,并且被认为介导细胞接触和粘附。重要的是,在分化过程中和肿瘤发生期间观察到这些聚糖的变化。该家族的两个值得注意的六糖成员是阶段特异性胚胎抗原-4(ssea-4)和globo h(图2)。这些聚糖共享共同的前体ssea-3(galβ3galnacβ3galα4galβ4glc),但末端单糖不同:ssea-4的β3-连接的n-乙酰神经氨酸及globo h的α2-连接的l-岩藻糖。
3.ssea-4在许多干细胞类型上、在诱导性多能干细胞上、在胚胎癌细胞上、在乳腺癌细胞上和在恶性神经胶质瘤细胞上表达,所述恶性神经胶质瘤细胞在成人中形成最具侵袭性和常见的脑肿瘤。因此,针对ssea-4的抗体可支持癌症疫苗中ssea-4的靶向。
4.globo h是化学式为fucα1

2galβ1

3galnacβ1

3galα1

4galβ1

4glcβ1

o-cer的六糖。已在几种上皮癌中发现globo h表达,如子宫内膜结肠癌、卵巢癌、胃癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌和乳腺癌;在正常组织中,其适度存在于乳腺、结肠、食道、小肠、前列腺、直肠、睾丸和子宫颈中,但仅存在于管腔边界处的顶端上皮细胞上。wang等人(pnas,2008)通过聚糖阵列发现,正常供体及乳腺癌患者均表达高水平的针对ssea-3的抗体,但乳腺癌患者表达的针对globo h的抗体水平远高于正常供体。因为在正常组织中可以发现ssea-3或globo h的位点通常被认为是免疫细胞不可触及的区域,所以ssea-3及globo h两者都是癌症疫苗的有吸引力的靶点。
5.然而,大多数碳水化合物抗原通常被免疫系统耐受,因此,由它们诱导的免疫原性是有限的。此外,针对特异性免疫原的抗体的产生通常涉及两种类型的淋巴细胞之间的协同相互作用,即b细胞和辅助t细胞。单独的globo h不能激活辅助t细胞,这也归因于globo h的免疫原性差。因此,单独用globo h免疫通常导致免疫球蛋白m(igm)滴度低,无法类别转换成免疫球蛋白g(igg),以及无效的抗体亲和力成熟。最近,已经证明,通过添加合适的佐剂,可以诱导针对globo h的抗体,包括从igm到igg的类别转换。因此,globo h是癌症疫苗接种的有前景的治疗靶点。这种方法已经在针对不同癌症(包括乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌和肺癌)的不同阶段的临床试验中进行了测试。
6.以前的研究表明,人类的抗多糖响应明显由igm和igg1类型主导,而来自骆驼科动
物的重链抗体属于igg2和igg3类(daley et al.,clin vaccine immunol.2010),这支持了响应于聚糖的单域抗体的产生不足。此外,已知多糖与蛋白质中的单个结合位点之间的相互作用通常较弱,并且通过多糖与寡聚多糖结合蛋白之间的聚合相互作用增强结合强度和特异性。本质上作为严格的单体粘合剂,vhh在这方面不太适合于结合多糖。因此,本领域技术人员假设,提高针对球系列聚糖的缺乏轻链的免疫球蛋白是极其困难的。
7.虽然已显示针对globo h的常规抗体在癌症诊断和治疗中是有前景的(wo 2015/143123 a),但仍需要更好的抗globo h抗体。对于预期用途,需要单克隆抗体,优选单域抗体。到目前为止,本领域尚未公开特异性结合球系列鞘糖脂(例如globo h或其片段)的单域抗体(sdabs或vhh),尽管已经进行了制备此类抗体的尝试。
8.专利申请wo 2015/143123 a公开了用于预防或治疗globo h阳性癌症的常规抗globo h抗体和包含这些抗体的药物组合物。然而,这些抗体具有可赋予化学不稳定性的cdr序列,这使得它们不适合进一步的生产放大和临床研究。
9.国际专利申请wo 2018/054353 a公开了结合globo h并具有cdr序列的治疗性人常规单克隆抗体,该cdr序列经工程改造以提高稳定性,以抵抗在高表达制造条件下可能发生的不期望的修饰和大聚集体的形成。
10.与常规的哺乳动物igg抗体相反,sdabs仅含有重链并且缺乏轻链。单域抗体的抗原结合域称为vhh或vhh具有优于常规抗体的若干一般优点。首先,它们的大小仅为13-15kda,比常规igg抗体(150kda)小约10倍。即使在拥挤的细胞环境中,它们也可以获得更好的表位,并且能更好地渗透到组织、器官和动物中。与常规抗体相比,它们具有高得多的化学稳定性(例如高达8m尿素)和热稳定性(高达83℃),以及更长的保质期。
11.因此,本发明的目的是提供特异性结合globo h以及球系列聚糖的单域抗体,例如gb3(球三糖)、gb4(球四糖)和gb5(球五糖gb5)。
12.该目的通过独立权利要求的教导来解决。本发明进一步的有利特征、方面和细节从本技术的从属权利要求、说明书、附图和实施例中显而易见。
13.发明简述
14.本技术涉及特异性结合球系列聚糖的多肽,其包含至少一种单域抗体,其中所述单域抗体是天然缺乏轻链且天然缺乏恒定区1的重链抗体的可变结构域,或所述可变结构域的变体,并且其中所述单域抗体结合至少一种选自globo h、gb3、gb4和gb5的球系列聚糖。
15.在一些实施方案中,特异性结合球系列聚糖的多肽包含至少一种单域抗体,该单域抗体与选自seq id no 1、seq id no 3、seq id no 5、seq id no 7、seq id no 9、seq id no 11、seq id no 13、seq id no 15、seq id no 17、seq id no 136、seq id no 137和seq id no 138的序列具有至少90%序列同一性,其中,所述单域抗体结合选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖。在某些实施例中,特异性结合球系列聚糖的多肽包含至少一种单域抗体,所述单域抗体结合至少一种选自globo h、gb3、gb4和gb5的globo系列聚糖,并且与seq id no 5具有至少90%序列同一性。
16.在特定实施方案中,特异性结合球系列聚糖的多肽包含至少一种本文公开的单域抗体,和至少一种与所述至少一种单域抗体连接的效应分子,其中效应分子选自抗癌肽、裂解肽、l-鼠李糖、半乳糖-α-1,3-半乳糖、二硝基苯基、血清稳定分子、荧光分子、磷光分子、
化学发光分子、生物发光分子、放射性同位素、发色团、己二酸二琥珀酰亚胺酯、人fc抗体片段。在更具体的实施方案中,特异性结合球状系列聚糖的多肽包含至少一种单域抗体,其结合选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球状系列聚糖,以及选自包含经修饰的半胱氨酸缺失的鲎抗菌肽-i(tachyplesin-i)、bmap28a、polybia-mp1的组的至少一种裂解肽。在更具体的实施方案中,特异性结合包含至少一种单域抗体的球系列聚糖并进一步包含连接到至少一种单域抗体的至少一种裂解肽的多肽与选自seq id nos:19-63、142-156、179-226的序列具有至少85%的序列同一性。
17.本发明还涉及特异性结合球系列聚糖的多肽,其包含至少一种本文公开的单域抗体,其中所述单域抗体结合至少一种选自globo h、gb3、gb4和gb5的球系列聚糖,并且还包含至少一个细胞外铰链区、至少一个跨膜域、至少一个共刺激结构域和至少一个细胞内激活域,其中单域抗体与细胞外铰链区连接。所述细胞外铰链区、跨膜域、共刺激结构域和细胞内激活域代表t细胞嵌合抗原受体(car)的模块或元件。本文公开的嵌合抗原受体可用于产生特异性识别选自globo h、gb3、gb4和gb5的球系列聚糖的car t细胞。因此,所述car t细胞可以用于癌症的疗法,其中所述癌症的癌细胞在其表面上表达选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖。
18.本发明还提供了特异性结合球系列聚糖的多肽,其包含至少一种单域抗体,其中所述至少一种单域抗体是人源化单域抗体,并且其中所述至少一种单域抗体结合选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖。此外,本发明提供了特异性结合球系列聚糖的多肽,其包含至少一种单域抗体,其中所述至少一种单域抗体是人源化单域抗体,并且还包含至少一种连接到所述至少一种人源化单域抗体的效应分子,其中所述至少一种人源化单域抗体结合选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖。根据本发明,根据kabat编号,通过替换位于fr1中的位置1、5、11、28和30,fr2中的位置44和45,fr3中的位置74、75、76、83、84、93和94;fr4中的位置104和108处的一个或多个氨基酸残基,将至少一个单域抗体进行人源化。
19.本发明还提供了编码本发明的多肽的重组核酸分子,以及包含所述重组核酸分子的载体。本文还提供了包含本发明的重组核酸分子或载体的宿主细胞。
20.此外,本发明还涉及包含治疗有效量的本发明多肽药物组合物,该多肽特异性结合球系列聚糖,并且包含至少一种单域抗体,以及至少一种药学上可接受的媒介物、赋形剂和/或稀释剂。
21.本发明还提供了本发明的多肽或根据本发明的药物组合物在治疗和/或诊断癌症中的用途,其中所述癌症的癌细胞在其表面上表达选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖。换句话说,本发明提供了本发明的多肽或根据本发明的药物组合物在治疗和/或诊断癌症中的用途,其中所述癌症的特征在于细胞在其表面上表达选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖。
22.本发明还提供了本发明的多肽或根据本发明的药物组合物在治疗和/或诊断癌症中的用途,其中所述癌症的癌细胞在其表面上表达选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖,并且其中所述癌症选自脑癌、肝癌、胆管癌、肾癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、小细胞肺癌、卵巢癌、宫颈癌、食道癌、胃癌、胰腺癌和结肠直肠癌。
23.本发明还提供了诊断试剂盒,其包含特异性结合包含至少一种单域抗体的球系列
聚糖的多肽,其中所述单域抗体是天然缺乏轻链且天然缺乏恒定区1的重链抗体的可变结构域,或所述可变结构域的变体,其中所述至少一种单域抗体结合选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖,用于筛选癌症,所述癌症的特征在于细胞在其表面上表达选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖。
24.本发明的另一个实施方案提供了如上所述的多肽,其中结合选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖的单域抗体的数目为至少两种。两个或更多个单域抗体在序列上不同或相同。
25.本发明的一个具体实施方案提供了如上所述的多肽,其中结合选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖的单域抗体的数目为三。本发明的一个具体实施方案提供了如上所述的多肽,其中结合选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖的单域抗体的数目为三,并且其中所述单域抗体与seq id no 5具有至少90%的序列同一性。
26.发明详述
27.定义
28.肿瘤相关抗原(tacas)和类型
29.癌细胞可以与正常细胞区分开来,因为在其表面上显示异常水平和类型的碳水化合物结构。这些碳水化合物结构被称为肿瘤相关碳水化合物抗原(tacas)。taca被认为是设计抗癌疫苗的有前景的靶点。不幸的是,碳水化合物本身只能引起差的免疫原性,因为它们不能诱导t细胞依赖性免疫应答,而这对于癌症治疗至关重要。
30.鞘糖脂(gsls)代表一组复杂脂质,其由连接到含有鞘脂神经酰胺的脂质尾部的聚糖结构组成。鞘糖脂的基本结构是单糖,通常是葡萄糖或半乳糖,直接与神经酰胺分子连接,并分别产生葡萄糖神经酰胺(葡糖脑苷脂;glccer)或半乳糖神经酰胺(半乳糖脑苷脂;galcer)。gsl普遍存在于细胞膜中,已知它们参与细胞过程,诸如信号传导、粘附和细胞分化以及其他功能。某些在肿瘤细胞或组织中高度表达的鞘糖脂已由特异性单克隆抗体定义,由此被鉴定为肿瘤相关碳水化合物抗原(tacas),其来源于肿瘤中异常的gsl合成。肿瘤细胞在gsls中表达异常糖基化,表现为导致前体积累的不完全合成,或进一步添加聚糖残基以形成新结构。
31.虽然球三糖基神经酰胺(gb3cer)和球糖苷(gb4cer)构成p血型系统的基础,但半乳糖基球糖苷(gb5cer)和唾液酸半乳糖基球糖苷(唾液酸gb5cer)也分别已知为阶段特异性胚胎抗原-3(ssea-3)和ssea-4,广泛用作定义人胚胎干细胞的细胞表面标志物。
32.在肿瘤中也观察到球系列gsls:globo h(岩藻糖基gb5cer)在许多上皮癌中过度表达,例如子宫内膜癌、结肠癌、卵巢癌、胃癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌和乳腺癌。
33.如本文所用,“globo h”是指式为fucα1

2galβ1

3galnacβ1

3galα1

4galβ1

4glcβ1

o-cer的六糖,其具有以下结构:
34.[0035]“globo h阳性癌症”是指包含在其表面上表达globo h的癌细胞的癌症。
[0036]
研究还报道了在癌细胞表面上存在globo h的截短形式或片段。此类截短形式是gb3(球三糖)、gb4(球四糖)和gb5(球五糖)(图2)。
[0037]“抗体”(abs)和“免疫球蛋白”(igs)是具有相同结构特征的糖蛋白。虽然抗体表现出对特定抗原的结合特异性,但免疫球蛋白包括抗体和通常缺乏抗原特异性的其他抗体样分子。术语“抗体”和“免疫球蛋白”在最广泛的意义上可以互换使用,并且包括单克隆抗体(例如全长或完整单克隆抗体)、多克隆抗体、人类抗体、多特异性(或异源缀合)抗体(例如双特异性抗体)、单价抗体、多价抗体、抗原结合抗体片段(例如fab

、f(ab

)2、fab、fv、rigg、单链fv片段、sdabs、vhh)、抗体融合物和合成抗体(或抗体模拟物)。抗体可以是嵌合的、人类的、人源化的和/或亲和力成熟的。
[0038]
如本文所用,术语“抗原”定义为能够引发免疫应答的任何物质。
[0039]
如本文所用,术语“免疫原性”是指免疫原、抗原或疫苗刺激免疫应答的能力。
[0040]
如本文所用,术语“表位”定义为与抗原分子中与抗体或t细胞受体的抗原结合位点接触的部分。
[0041]
如本文所用,术语“特异性结合(specific binding)”或“特异性地结合(specifically binding)”或“特异性的结合(binds specifically)”是指结合对(例如抗体和抗原)之间的相互作用。在各种情况下,特异性地结合可以通过约10-6
摩尔/升、约10-7
摩尔/升或约10-8
摩尔/升或更小的亲和常数来体现。
[0042]“结合亲和力”通常是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明,否则如本文所用,“结合亲和力”是指反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间的1:1相互作用的内在结合亲和力。分子x对其配偶体y的亲和力通常可以由解离常数(kd)表示。低亲和力抗体通常结合抗原缓慢并且倾向于易于解离,而高亲和力抗体通常更快地结合抗原并且倾向于更长时间地保持结合。本领域已知多种测量结合亲和力的方法,其中任何一种方法都可以用于本发明的目的。下面描述具体的说明性实施例。
[0043]
抗体的“功能性抗原结合位点”是能够结合靶抗原的位点。抗原结合位点的抗原结合亲和力不一定与衍生抗原结合位点的亲本抗体一样强,但结合抗原的能力必须使用已知用于评估抗体与抗原结合的多种方法中的任一种来测量。
[0044]
如本文所用的术语“载体”,意指能够转运与其连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”,其是指可以连接另外的dna区段的环状双链dna环。另一种类型的载体是噬菌体载体。另一种类型的载体是病毒载体,其中另外的dna区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制。其他载体(例如,非附加型哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中,从而与宿主基因组一起复制。此外,某些载体能够指导与它们有效连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”或“重组载体”)。一般来说,在重组dna技术中使用的表达载体通常是质粒的形式。在本说明书中,“质粒”和“载体”可以互换使用,因为质粒是最常用的载体形式。
[0045]
本文中可互换使用的“重组多核苷酸”或“重组核酸分子”是指任何长度的核苷酸聚合物,包括dna和rna。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基
和/或其类似物,或可以通过dna或rna聚合酶或通过合成反应掺入聚合物的任何底物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸,例如甲基化核苷酸及其类似物。如果存在,可以在聚合物组装之前或之后对核苷酸结构进行修饰。核苷酸序列可以被非核苷酸组分打断。多核苷酸可以在合成后进一步修饰,例如通过与标记缀合。其他类型的修饰包括,诸如,“加帽”,用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸,核苷酸间修饰,诸如,具有不带电荷的键(例如,甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酸酰胺、氨基甲酸酯等)和带电荷的键(例如,硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些修饰,含有侧链部分的那些修饰,诸如,蛋白质(例如,核酸酶、毒素、抗体、信号肽、ply-l-赖氨酸等),具有嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)的那些修饰、含有螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、氧化金属等)的那些修饰,含有烷化剂的那些修饰,具有修饰键(例如α异头核酸等)的那些修饰以及未修饰形式的多核苷酸。此外,通常存在于糖中的任何羟基可以诸如被膦酸酯基团、磷酸盐基团取代,由标准保护基团保护,或被激活以制备与额外的核苷酸的额外的连接,或者可以与固体或半固体支持物缀合。5'和3'末端oh可以被磷酸化或用胺或1至20个碳原子的有机封端基团部分取代。其它羟基也可以衍生为标准保护基团。
[0046]
本文所用的“寡核苷酸”通常是指短的,通常是单链的,通常是合成的多核苷酸,其长度通常但不一定小于约200个核苷酸。术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”不是相互排斥的。以上对多核苷酸的描述同样且完全适用于寡核苷酸。
[0047]“球系列聚糖结合单域抗体(sdab)”或“结合选自globo h、gb3、gb4和gb5的球系列聚糖的sdab”是指以足够的亲和力结合选自globo h、gb3、gb4和gb5的球系列聚糖的sdab,使得sdab通过结合靶聚糖而可用作诊断剂和/或治疗剂。“结合globo h的单域抗体(sdab)”或“结合globo h的sdab”指的是以足够亲和力结合globo h的sdab,从而从而使得sdab通过结合globoh可用作诊断剂和/或治疗剂。“gb3结合单域抗体(sdab)”或“结合gb3的sdab”是指以足够的亲和力结合gb3的sdab,使得sdab通过结合gb3可用作诊断剂和/或治疗剂。“gb4结合单域抗体(sdab)”或“结合gb4的sdab”是指以足够的亲和力结合gb4,使得sdab通过结合gb4可用作诊断剂和/或治疗剂的sdab,“gb5结合单域抗体(sdab)”或“结合gb5的sdab”是指以足够的亲和力结合gb5,使得sdab通过结合gb5可用作诊断和/或治疗剂的sdab。
[0048]“全长抗体”、“完整抗体”或“全抗体”在本文中可互换使用,是指具有与天然抗体结构基本上相似的结构的抗体。
[0049]“抗体片段”是指全长抗体的一部分,其能够与全长抗体结合相同的抗原。抗体片段的示例包括但不限于fv、fab、fab'、f(ab')2;双抗体;线性抗体;单链抗体分子(例如单链fv);单域抗体;由抗体片段形成的多特异性抗体。
[0050]
抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基末端结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为vh和vl)通常具有相似的结构。单个vh或vl结构域可能足以赋予抗原结合特异性。具体而言,本文公开的单域抗体的“可变区”或“可变结构域”是指重链的氨基末端结构域。
[0051]
术语“可变”所指的事实是,可变结构域的某些部分在抗体之间的序列上广泛不同,并且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而,变异性集中在轻链和重链可变结构域中称为互补决定区(cdrs)或高变区(hvr)的三个片段中。可变结构域的更加高度保守的部分称为框架区(fr)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个fr区,主要采用β-片构型,通过三个cdrs连接,其形成连接β-片结构的环,并且在一些情况下形成β-片结
构的一部分。每条链中的cdrs通过fr区紧密靠近地保持在一起,并且与来自另一条链的cdrs一起有助于形成抗体的抗原结合位点(kabat等人,sequences of proteins of immunological interest,第五版,national institute of health,bethesda,md.(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合,但表现出各种效应物功能,例如作为抗体参与抗体依赖性细胞毒性。
[0052]
如本文所用,“高变区”或“hvr”是指抗体可变结构域中序列高变和/或形成结构上定义的环的每个区域。通常,天然抗体包含四条具有六个hvr的链;三个在重链可变结构域中,vh(h1、h2、h3),三个在轻链可变结构域中,vl(l1、l2、l3)。单域抗体在重链可变结构域中仅包含三个hvrs。hvrs通常包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(cdrs)的氨基酸残基。除非另有说明,否则可变结构域中的hvr残基和其他残基(例如fr残基)在本文中根据kabat等,1991进行编号。
[0053]
如本文所用,“互补决定区”或“cdr”是指可变结构域的高变区内具有最高互补决定区的区域。序列变异性和/或参与抗原识别。通常,天然抗体包含四条具有六个cdr的链;三个在重链可变结构域中,vh(h1、h2、h3),三个在轻链可变结构域中,vl(l1、l2、l3)。示例性cdrs(cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3、cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3)出现在l1的氨基酸残基24-34、l2的氨基酸残基50-56、l3的氨基酸残基89-97、h1的氨基酸残基31-35、h2的氨基酸残基50-65和h3的氨基酸残基95-102处(kabat等人,1991)。如本文公开的那些单域抗体仅包含cdr-h1或cdr1、cdr-h2或cdr2和cdr-h3或cdr3,因为它们缺乏轻链。
[0054]“天然抗体”是指天然存在的免疫球蛋白分子。诸如,天然igg抗体是约150道尔顿的异四聚体糖蛋白,由二硫键键合的两条相同的轻链和两条相同的重链组成。从n-端至c-端,每条重链具有可变区(vh),也称为可变重结构域或重链可变结构域,随后是三个恒定结构域(ch1、ch2和ch3)。类似地,从n-端到c-端,每条轻链具有可变区(vl),也称为可变轻结构域或轻链可变结构域,随后是恒定轻(cl)结构域。基于其恒定结构域的氨基酸序列,抗体的轻链可以被分为两种类型之一,称为kappa(κ)和lambda(λ)。
[0055]
如本文所用的“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体中获得的抗体,即构成该群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位,除了可能的变异抗体(例如,变异抗体含有天然存在或在单克隆抗体产生期间出现的突变,通常以少量存在)。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂不同,单克隆抗体制剂的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此,术语“单克隆”表示从基本上同质的抗体群体中获得的抗体的特征,并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。
[0056]“嵌合抗体”是指一种抗体,其中重链和/或轻链的一部分来自特定来源或物种,而重链和/或轻链的其余部分来自不同来源或物种。
[0057]“人源化抗体”是指包含来自非人hvrs的氨基酸序列和来自人frs的氨基酸序列的嵌合抗体。在某些实施方案中,人源化抗体将基本上包含单个结构域抗体,其中所有或基本上所有cdrs对应于非人抗体的cdrs,并且所有或基本上所有frs对应于人抗体的frs。人源化抗体任选地可包含来自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体的“人源化形式”,例如非人抗体,是指已经过人源化的抗体。
[0058]“人抗体”是指这样的抗体,其具有对应于由人或人细胞产生的抗体的氨基酸序列,或衍生自利用人抗体全集或其他人抗体编码序列的非人来源的抗体的氨基酸序列。人
抗体的这种定义特别排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
[0059]“人共有框架”是一个框架,其代表在人免疫球蛋白vl或vh框架序列的选择中最常出现的氨基酸残基。通常,人免疫球蛋白vl或vh序列的选择来自可变结构域序列的子群。通常,序列子群是如kabat等,1991中所述的子群。
[0060]
如本文所用,“多价抗体”是包含三个或更多个抗原结合位点的抗体。多价抗体优选被工程化以具有三个或更多个抗原结合位点,并且通常不是天然序列igm或iga抗体。
[0061]“多特异性抗体”是具有至少两个不同结合位点的抗体,每个位点具有不同的结合特异性。多特异性抗体可以是全长抗体或抗体片段,并且不同的结合位点可以各自结合不同的抗原,或者不同的结合位点可以结合相同抗原的两个不同的表位。
[0062]“fc区”或“fc抗体片段”是指包含免疫球蛋白重链的c-端多肽序列的二聚体复合物,其中c-端多肽序列是可通过木瓜蛋白酶消化完整抗体获得的序列。fc区可包含天然或变体fc序列。
[0063]“fab片段”是指含有轻链的可变区和恒定区以及重链的可变区和第一恒定区(ch1)的抗体片段,木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的"fab"片段,每个片段具有单个抗原结合位点,和残留的"fc"片段,其名称反映了其易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点并且仍然能够交联抗原的f(ab')2片段,fab'片段与fab片段的不同之处在于在重链ch1结构域的羧基末端添加了一些残基,包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。f(ab')2抗体片段最初是作为fab'片段对而产生的,二者之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其他化学偶联也是本领域已知的。
[0064]“fv片段”是指含有完整抗原识别和结合位点的抗体片段。该区域由紧密结合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成,其本质上可以是共价的,例如在单链fv中。正是在这种构型中,每个可变结构域的三个hvrs相互作用以限定vh-vl二聚体表面上的抗原结合位点。六种hvrs或其子集共同赋予抗体抗原结合特异性。然而,即使单个可变结构域(或仅包含三个对抗原特异性的hvrs的fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力,尽管其亲和力通常低于整个结合位点。
[0065]“单链fv”或“单链fv”是指包含抗体的vh和vl结构域的抗体片段,其中这些结构域存在于单个多肽链中。通常,fv多肽还包含vh和vl结构域之间的多肽接头,其使得单链fv能够形成所需的抗原结合结构。
[0066]“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段,该片段包含在同一多肽链(vh和vl)中与轻链可变结构域(vl)连接的重链可变结构域(vh)。通过使用太短而不允许同一链上的两个结构域之间配对的接头,迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。
[0067]“裸抗体”是指未与异源部分(例如细胞毒性部分)或放射性标记结合的抗体。
[0068]“分离的”抗体是已经从其天然环境的组分中鉴定、分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染成分是会干扰抗体的研究、诊断或治疗用途的材料,并且可能包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质溶质。通常,分离的抗体将通过至少一个纯化步骤制备。
[0069]
如本文所用,术语“基本上相似”、“基本上相同”、“等值”或“基本上等值”是指两个数值(例如,一个与测试抗体相关,另一个与参考抗体相关)之间的足够高的相似性程度,使得本领域技术人员将认为两个值之间的差异在由所述值(例如,kd值)测量的生物学特征的
背景下具有几乎没有或没有生物学和/或统计学显著性。作为参考/比较分子值的函数,所述两个值之间的差异为例如小于约50%、小于约40%、小于约30%、小于约20%和/或小于约10%。
[0070]
如本文所用,“基本上不同”是指两个数值(通常一个与分子相关,另一个与参考分子相关)之间的足够高的差异程度,使得本领域技术人员将认为两个值之间的差异在由所述值(例如,kd值)测量的生物学特征的背景下具有统计学显著性。作为参考/比较分子的值的函数,所述两个值之间的差异例如大于约10%、大于约20%、大于约30%、大于约40%和/或大于约50%。
[0071]
本发明涉及特异性结合球系列聚糖的多肽,其包含至少一种单域抗体,其中所述单域抗体是天然缺乏轻链且天然缺乏恒定区1的重链抗体的可变结构域,或所述可变结构域的变体,并且其中所述单域抗体结合至少一种选自globo h、gb3、gb4和gb5的球系列聚糖。
[0072]
本发明的另一个实施方案是特异性结合包含至少一种单域抗体的球系列聚糖的多肽,其中所述单域抗体结合至少一种选自globo h、gb3、gb4和gb5的球系列聚糖,其中所述至少一种单域抗体与选自seq id no 1、seq id no 3、seq id no 5、seq id no 7、seq id no 9、seq id no 11、seq id no 13、seq id no 15、eq id no 17、seq id no 136、seq id no 137和seq id no 138(表4)的序列具有至少90%序列同一性。优选的实施方案是特异性结合包含至少一种单域抗体的球系列聚糖的多肽,其中所述单域抗体结合选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖,其中所述至少一种单域抗体与seq id no 5(表4)具有至少90%的序列同一性。
[0073]
本发明的优选实施方案是特异性结合球系列聚糖的多肽,其至少包含一种单域抗体,其中所述单域抗体结合选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖,其中所述至少一种单域抗体与seq id no 1具有至少90%的序列同一性。
[0074]
本发明的另一个实施方案是特异性结合包含至少一种单域抗体的球系列聚糖的多肽,其中所述单域抗体结合选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖,其中所述至少一种单域抗体与seq id no 3具有至少90%序列同一性。
[0075]
本发明的另一个实施方案是特异性结合包含至少一种单域抗体的球系列聚糖的多肽,其中所述单域抗体结合选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖,其中所述至少一种单域抗体与seq id no 7具有至少90%序列同一性。
[0076]
本发明的另一个实施方案是特异性结合包含至少一种单域抗体的球系列聚糖的多肽,其中所述单域抗体结合选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖,其中所述至少一种单域抗体与seq id no 9具有至少90%序列同一性。
[0077]
本发明的另一个实施方案是特异性结合包含至少一种单域抗体的球系列聚糖的多肽,其中所述单域抗体结合选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖,其中所述至少一种单域抗体与seq id no 11具有至少90%序列同一性。
[0078]
本发明的另一个实施方案是特异性结合包含至少一种单域抗体的球系列聚糖的多肽,其中所述单域抗体结合选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖,其中所述至少一种单域抗体与seq id no 13具有至少90%序列同一性。
[0079]
本发明的另一个实施方案是特异性结合包含至少一种单域抗体的球系列聚糖的
多肽,其中所述单域抗体结合选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖,其中所述至少一种单域抗体与seq id no 15具有至少90%序列同一性。
[0080]
本发明的另一个实施方案是特异性结合包含至少一种单域抗体的球系列聚糖的多肽,其中所述单域抗体结合选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖,其中所述至少一种单域抗体与seq id no 17具有至少90%序列同一性。
[0081]
本发明的另一个实施方案是特异性结合包含至少一种单域抗体的球系列聚糖的多肽,其中所述单域抗体结合选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖,其中所述至少一种单域抗体与seq id no 136具有至少90%序列同一性。
[0082]
本发明的另一个实施方案是特异性结合包含至少一个单一结构域的球系列聚糖的多肽。其中所述单域抗体结合选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖,其中所述至少一种单域抗体与seq id no:137具有至少90%的序列同一性。
[0083]
本发明的另一个实施方案是特异性结合包含至少一种单域抗体的球系列聚糖的多肽,其中所述单域抗体结合选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种globo系列聚糖,其中所述至少一种单域抗体与seq id no 138具有至少90%序列同一性。
[0084]
所述序列seq id no 1、seq id no 3、seq id no 5、seq id no 7、seq id no 9、seq id no 11、seq id no 13、seq id no 15、seq id no 17、seq id no 136、seq id no 137和seq id no 138(sdab或vhh)衍生自羊驼(vicugna pacos)的重链抗体,其已经针对globo h聚糖进行免疫。
[0085]
本发明还涉及能够编码所述多肽的重组核酸分子,以及包含所述重组核酸分子的载体和宿主细胞。
[0086]
单域抗体是其互补决定区为单结构域多肽的一部分的抗体。诸如,在wo1994004678a1中公开的单域抗体。为了清楚起见,来自天然缺乏轻链的重链抗体的可变结构域在本文中称为vhh或sdab(单域抗体),以将其与四链免疫球蛋白的常规vh区分开。这样的vhh分子可以来自骆驼科物种中产生的抗体,例如骆驼、单峰骆驼、美洲驼、羊驼和原驼。除骆驼科之外的其他物种可能会产生天然缺乏轻链的重链抗体。
[0087]
根据本发明的一个方面,如本文所用的单域抗体是天然存在的称为重链抗体的单域抗体,其天然缺乏轻链和天然缺乏恒定区1,或所述可变结构域的变体。
[0088]
sdab约为13-15kda,因此几乎比igg分子小十倍。它们是单一多肽,并且在储存和使用期间都非常稳定,这意味着抗原结合蛋白的完整性在储存和/或使用条件下得到保持,所述储存和/或使用条件可以包括升高的温度、冻融循环、ph或离子强度的变化、uv照射、有害化学物质的存在等。此外,它们对蛋白酶的作用有抵抗力,而常规抗体的情况则不同。进一步的,根据本发明的单域抗体易于在体外制备,并获得高产率、适当折叠和功能性。另外,在羊驼或更一般地骆驼科动物中产生的抗体将识别表位,该表位是除了通过使用抗体库在体外产生的抗体或通过免疫骆驼科动物以外的哺乳动物而产生的抗体所识别的表位以外的表位(wo2005044858a1)。因此,针对globoh、gb3、gb4或gb5的sdabs可以比常规抗体更有效地与目标抗原相互作用,从而允许以高得多的效率检测或治疗以表达globoh、gb3、gb4或gb5的细胞为特征的癌症。由于已知sdabs结合到异常表位如空腔或凹槽中(wo 2005044858a1),因此此类抗体的亲和力可适用于治疗性疗法。
[0089]
因此,通常,单域抗体可以定义为具有以下(一般)结构的氨基酸序列:
[0090]
fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4
[0091]
其中fr1至fr4分别指框架区1至4,并且其中cdr1至cdr3分别指互补性决定区1至3。
[0092]
因此,根据本发明的“单域抗体”包含含有fr1-fr4和cdr1-cdr3的氨基酸序列或其变体序列,并且它们对球系列鞘脂的结合特异性由三个互补性决定区cdr1、cdr2、cdr3的氨基酸序列赋予。
[0093]
本发明公开的单域抗体的fr1-fr4和cdr1-cdr3的序列是seq id no:64-126、157-177。fr和cdr区的注释基于kabat的独特编号系统。
[0094]
因此,本发明的一个实施方案还涉及特异性结合球系列聚糖的多肽,其包含至少一种单域抗体,其中所述单域抗体是天然缺乏轻链且天然缺乏恒定区1的重链抗体的可变结构域,或所述可变结构域的变体,并且其中所述单域抗体结合选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖,其中所述单域抗体包含互补性决定区cdr1、cdr2和cdr3,其中:
[0095]
(a)cdr1包含选自seq id no:64-72、157-159或其变体的氨基酸序列;
[0096]
(b)cdr2包含选自seq id no:73-81、160-162或其变体的氨基酸序列;
[0097]
(c)cdr3包含选自seq id no:82-90、163-165或其变体的氨基酸序列。
[0098]
本发明的另一个实施方案涉及特异性结合球系列聚糖的多肽,其包含至少一种单域抗体,其中所述单域抗体是天然缺乏轻链且天然缺乏恒定区1的重链抗体的可变结构域,或所述可变结构域的变体,并且其中所述单域抗体结合选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖,其中所述单域抗体包含互补性决定区cdr1、cdr2和cdr3,其中:
[0099]
(a)cdr1包含与选自seq id no:64-72、157-159的序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列;
[0100]
(b)cdr2包含与选自seq id no:73-81、160-162的序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列;
[0101]
(c)cdr3包含与选自seq id no:82-90、163-165的序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列。
[0102]
globoh是根据本发明的主要目标。针对靶点的单域抗体指能够以优于10-6
m的亲和力结合所述靶点的单域抗体。
[0103]
靶点也可以是所述主要靶点的片段。因此,靶点也是所述靶点的片段,其能够引发免疫应答。靶点也是所述靶点的片段,其能够结合针对全长靶点产生的单域抗体。主要靶点globo h的优选片段是gb3、gb4和gb5。
[0104]
单域抗体与选自globoh、gb3、gb4和gb5的鞘糖脂的结合优选以高亲和力发生:通常,单域抗体与球系列靶聚糖之间结合的解离常数低于10-5
m,更优选地,解离常数低于10-6
m,甚至更优选地,解离常数低于10-7
m,最优选地,解离常数低于10-8
m。或者,单域抗体与globo h之间结合的解离常数低于10-5
m,更优选地,解离常数低于10-6
m,甚至更优选地,解离常数低于10-7
m,最优选地,解离常数低于10-8
m。或者,单域抗体和gb3之间结合的解离常数低于10-5
m,更优选地,解离常数低于10-6
m,甚至更优选地,解离常数低于10-7
m,最优选地,解离常数低于10-8
m。或者,单域抗体与gb4之间结合的解离常数低于10-5
m,更优选地,解离常数低于10-6
m,甚至更优选地,解离常数低于10-7
m,最优选地,解离常数低于10-8
m。或者,单域抗体与gb5之间结合的解离常数低于10-5
m,更优选地,解离常数低于10-6
m,甚至更优选
地,解离常数低于10-7
m,最优选地,解离常数低于10-8
m。
[0105]“变体序列”[0106]
根据本发明的一个方面,与选自globoh、gb3、gb4和gb5的聚糖结合的多肽可以是与选自globoh、gb3、gb4和gb5的聚糖结合的全长多肽的变体序列。根据本发明的一个方面,与选自globoh、gb3、gb4和gb5的聚糖结合的多肽可以包含与选自globoh、gb3、gb4和gb5的聚糖结合的全长多肽的序列。
[0107]
根据本发明的一个方面,包含在与选自globoh、gb3、gb4和gb5的聚糖结合的多肽中的单域抗体可以是完整的单域抗体(例如sdab或vhh)或其变体序列。
[0108]
如本文所用,本发明的变体序列可以包含一个或多个氨基酸的添加、缺失或取代,与未修饰的亲本多肽(也称为参考多肽)相比,其基本上不改变本发明多肽的功能特征。
[0109]
根据本发明的变体序列可以是存在于其他骆驼科物种中的序列,例如像骆驼、单峰骆驼、美洲驼、羊驼、原驼等。
[0110]
与亲本序列相比,变体序列中氨基酸缺失或取代的数目优选多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个氨基酸。
[0111]
在变体序列指示序列同一性时,它指的是呈现高序列同一性的变体序列,例如与亲本序列的序列同一性超过70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%,并且优选地特征在于具有亲本序列的相似性质,即亲和力,所述同一性如下所述计算。
[0112]“序列同一性”的百分比是通过在参考序列全长的“比较窗口”上比较两个最佳排列的核酸或多肽序列来确定的。如本文所用,“比较窗口”是指参考序列和变体序列之间在两个序列最佳比对之后的最佳排比,其中,与用于最佳比对的参考序列(其不包含添加或缺失)相比,比较窗口中的变体核酸或多肽序列可以包含20%或更少,通常5%至15%,或10%至12%的添加或缺失(即,空位)。同一性百分比如下计算:确定两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数以得到匹配位置的数目,将匹配位置的数目除以参考序列(即氨基酸或核苷酸的全长)中的位置总数,并将结果乘以100,得到序列同一性的百分比。如果两个序列中的核苷酸或氨基酸序列在如上所述最佳比对时是相同的,则称两个核酸或多肽序列是“相同的”。
[0113]
或者,变体序列也可以是根据下式在亲本序列的任何数量的位置上允许的取代产生的任何氨基酸序列:
[0114]
ser被ser、thr、gly和asn取代;
[0115]
arg被arg、his、gin、lys和glu之一取代;
[0116]
leu被leu、ile、phe、tyr、met和val之一取代;
[0117]
pro被pro、gly、ala和thr之一取代;
[0118]
thr被thr、pro、ser、ala、gly、his和gin之一取代;
[0119]
ala被ala、gly、thr和pro之一取代;
[0120]
val被val、met、tyr、phe、ile和leu之一取代;
[0121]
gly被gly、ala、thr、pro和ser之一取代;
[0122]
ile被ile、met、tyr、phe、val和leu之一取代;
[0123]
phe被phe、trp、met、tyr、lie、val和leu之一取代;
[0124]
tyr被tyr、trp、met、phe、ile、val和leu之一取代;
[0125]
his被his、glu、lys、gin、thr和arg之一取代;
[0126]
gln被gin、glu、lys、asn、his、thr和arg之一取代;
[0127]
asn被asn、glu、asp、gin和ser之一取代;
[0128]
lys被lys、glu、gln、his和arg之一取代;
[0129]
asp被asp、glu和asn之一取代;
[0130]
glu被glu、asp、lys、asn、gln、his和arg之一取代;
[0131]
met被met、phe、ile、val、leu和tyr之一取代。
[0132]
如本文所用,变体也可以是这样的序列,其中每个框架区fr和每个互补性决定区cdr与参考序列中的相应区域显示至少80%同一性,优选至少85%同一性,更优选90%同一性,甚至更优选95%同一性。在这种情况下,如上所述确定fr1变体与fr1参考、cdr1变体与cdr1参考、fr2变体与fr2参考、cdr2变体与cdr2参考、fr3变体与fr3参考、cdr3变体与cdr3参考和fr4变体与fr4参考的序列同一性。
[0133]
在另一个实施方案中,编码任何上述抗原结合蛋白或其变体的重组核酸序列也是本发明的一部分。
[0134]
本发明提供了编码一种或多种多肽的重组核酸分子,所述多肽包含选自下组的氨基酸序列:seq id no 1、seq id no 3、seq id no 5、seq id no 7、seq id no 9、seq id no 11、seq id no 13、seq id no 15、seq id no 17、seq id no 136、seq id no 137和seq id no 138。
[0135]
因此,本发明提供了重组核酸分子,其包含如seq id no 2、seq id no 4、seq id no 6、seq id no 8、seq id no 10、seq id no 12、seq id no 14、seq id no 16、seq id no 18、seq id no 139、seq id no 140和seq id no 141(表4)中的一个或多个所示的核酸序列,或其变体。本发明提供了重组核酸分子,其包含如seq id no:2所示的核酸序列或其变体。本发明提供了重组核酸分子,其包含如seq id no:4所示的核酸序列或其变体。本发明提供了重组核酸分子,其包含如seq id no:6所示的核酸序列或其变体。本发明提供了重组核酸分子,其包含如seq id no:8所示的核酸序列或其变体。本发明提供了重组核酸分子,其包含如seq id no:10所示的核酸序列或其变体。本发明提供了重组核酸分子,其包含如seq id no:12所示的核酸序列或其变体。本发明提供了重组核酸分子,其包含如seq id no:14所示的核酸序列或其变体。本发明提供了重组核酸分子,其包含如seq id no:16所示的核酸序列或其变体。本发明提供了重组核酸分子,其包含如seq id no:18所示的核酸序列或其变体。本发明提供了重组核酸分子,其包含如seq id no:139所示的核酸序列或其变体。本发明提供了重组核酸在一些实施方案中,所述核酸分子包含如seq id no:140所示的核酸序列,或其变体。本发明提供了重组核酸分子,其包含如seq id no:141所示的核酸序列或其变体。
[0136]
此外,本发明提供了宿主细胞,其包含一个或多个如seq id no 2、seq id no 4、seq id no 6、seq id no 8、seq id no 10、seq id no 12、seq id no 14、seq id no 16、seq id no 18、seq id no 139、seq id no 140和seq id no 141中的所示的一种或多种重组核酸分子,或其变体。具体而言,本发明提供了包含一种或多种如seq id no:6所示的重组核酸分子或其变体的细胞。
[0137]
另一方面,本发明提供了重组核酸分子及其变体,其编码与选自globoh、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖特异性结合的多肽,其中此类变体重组核酸分子与以下任一个序列共有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少87%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性,序列选自seq id no 2、seq id no 4、seq id no 6、seq id no 8、seq id no 10、seq id no 12、seq id no 14、seq id no 16、seq id no 18、seq id no 139、seq id no 140和seq id no 141,其中序列同一性百分比如上所述确定。这些量并不意味着限制,所述百分比之间的增量被具体设想为本文公开的一部分。具体地说,本发明提供了重组核酸分子及其变体,其编码与选自globoh、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖特异性结合的多肽,其中此类变体重组核酸分子与seq id no 2、seq id no 4、seq id no 6、seq id no 8、seq id no 10、seq id no 12、seq id no 14、seq id no 16、seq id no 18、seq id no 139、seq id no 140和seq id no 141中的任一个共有至少80%序列同一性。更具体地说,本发明提供了重组核酸分子及其变体,其编码与选自globoh、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖特异性结合的多肽,其中此类变体重组核酸分子与seq id no 2、seq id no 4、seq id no 6、seq id no 8、seq id no 10、seq id no 12、seq id no 14、seq id no 16、seq id no 18、seq id no 139、seq id no 140和seq id no 141中的任一个共有至少85%序列同一性。再具体地说,本发明提供了重组核酸分子及其变体,其编码与选自globoh、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖特异性结合的多肽,其中此类变体重组核酸分子与seq id no 2、seq id no 4、seq id no 6、seq id no 8、seq id no 10、seq id no 12、seq id no 14、seq id no 16、seq id no 18、seq id no 139、seq id no 140和seq id no 141中的任一个共有至少90%序列同一性。还更具体地说,本发明提供了重组核酸分子及其变体,其编码与选自globoh、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖特异性结合的多肽,其中此类变体重组核酸分子与seq id no 2、seq id no 4、seq id no 6、seq id no 8、seq id no 10、seq id no 12、seq id no 14、seq id no 16、seq id no 18、seq id no 139、seq id no 140和seq id no 141中的任一个共有至少95%序列同一性。还更具体地说,本发明提供了重组核酸分子及其变体,其编码与选自globoh、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖特异性结合的多肽,其中此类变体重组核酸分子与seq id no 2、seq id no 4、seq id no 6、seq id no 8、seq id no 10、seq id no 12、seq id no 14、seq id no 16、seq id no 18、seq id no 139、seq id no 140和seq id no 141中的任一个共有至少98%序列同一性。
[0138]
本文公开还涵盖与任何此类序列互补的多核苷酸或核酸分子。核酸分子可以是单链(编码或反义)或双链的,并且可以是dna(基因组、cdna或合成的)或rna分子。rna分子包括含有内含子并以一对一方式对应于dna分子的hnrna分子,以及不含内含子的mrna分子。另外的编码或非编码序列可以但不需要存在于本文公开的多核苷酸内,并且多核苷酸可以但不需要与其他分子和/或支持材料连接。
[0139]
核酸分子可包含天然序列(即,编码抗体或其部分的内源序列),或可包含此类序列的变体。
[0140]
核酸变体含有一个或多个取代、添加、缺失和/或插入,使得编码的与选自globoh、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖特异性结合的多肽的免疫反应性相对于参考的天然免疫反应性多肽基本上没有差异。通常可以如本文所述来评估对编码的多肽的免疫反应性
的影响。在一些实施方案中,核酸变体表现出与编码参考的天然单域抗体或其部分的核酸序列至少约70%同一性,在一些实施方案中至少约80%同一性,在一些实施方案中至少约85%同一性,在一些实施方案中至少约90%同一性,并且在一些实施方案中至少约95%同一性,其中序列同一性百分比如上所述确定。这些量并不意味着限制,并且所述百分比之间的增量被具体设想为本文公开的一部分。
[0141]
本文公开的重组核酸分子可以使用化学合成、重组方法或聚合酶链反应(pcr)获得。化学多核苷酸合成的方法是本领域熟知的,无需在此详细描述。本领域技术人员可以使用本文提供的序列和商业dna合成仪来产生所需的dna序列。为了使用重组方法制备多核苷酸,可以将包含所需序列的多核苷酸插入合适的载体中,然后可以将载体引入合适的宿主细胞中进行复制和扩增,如本文进一步讨论的。可以通过本领域已知的任何方法将多核苷酸插入宿主细胞中。通过直接摄取、内吞作用、转染、f-交配或电穿孔引入外源多核苷酸来转化细胞。一旦引入,外源多核苷酸可以作为非整合载体(例如质粒)保持在细胞内,或整合到宿主细胞基因组中。如此扩增的多核苷酸可以通过本领域熟知的方法从宿主细胞中分离。
[0142]
合适的克隆载体和表达载体可以包括多种组分,例如启动子、增强子和其他转录调节序列。还可以构建载体以允许随后将抗体可变结构域克隆到不同的载体中。可以根据标准技术构建合适的克隆载体,或者可以从本领域可获得的大量克隆载体中选择合适的克隆载体。虽然选择的克隆载体可能根据预期使用的宿主细胞而变化,但是有用的克隆载体通常具有自我复制的能力,可能具有特定限制性核酸内切酶的单个靶点,和/或可以携带可用于选择含有该载体的克隆的标记的基因。合适的实例包括质粒和细菌病毒,例如,puc18、puc19、bluescript(例如,pbs sk
+
)及其衍生物、mp18、mp19、pbr322、pmb9、cole1、pcr1、rp4、噬菌体dna,以及穿梭载体,如psa3和pat28。这些和许多其他克隆载体可从商业供应商如merck、biorad、strategene和invitrogen获得。
[0143]
此外,本发明还设想了包含编码本文公开的任何单域抗体或其变体的核酸序列的表达载体,以及包含此类表达载体的宿主细胞。这意味着表达载体在宿主细胞中必须是可以复制的,无论作为附加体,或是作为染色体dna的整合部分。载体组分通常可以包括但不限于以下中的一种或多种:信号序列;复制起点;一种或多种标志物基因;合适的转录控制元件(如启动子、增强子和终止子)。对于表达(即翻译),通常还需要一个或多个翻译控制元件,例如核糖体结合位点、翻译起始位点和终止密码子。
[0144]
可通过多种适当方法中的任何一种将含有感兴趣的重组核酸分子的载体和/或重组核酸分子本身引入宿主细胞,包括电穿孔、使用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、deae-葡聚糖或其他物质的转染;微射炮击;脂肪感染;和感染(例如,当载体是一种传染源,如痘苗病毒)。
[0145]
特定程序的选择通常取决于宿主细胞的特征。
[0146]
合适的表达系统包括细菌或酵母中的组成型和诱导型表达系统,病毒表达系统,例如杆状病毒、semliki森林病毒和慢病毒,或昆虫或哺乳动物细胞中的瞬时转染。特别优选的是用于在大肠杆菌中克隆和表达重组蛋白的pet表达载体(novagen)。在pet系统中,靶基因在强噬菌体t7转录和选择性翻译信号的控制下克隆到pet质粒中;通过在宿主细胞中提供t7 rna聚合酶的来源来诱导表达。t7 rna聚合酶具有选择性和活性,使得当完全诱导时,几乎所有细胞资源都转化为靶基因表达;诱导数小时后,所需产物可占总细胞蛋白的
50%以上。pet-22b(+)载体携带用于潜在周质定位的n-端pelb信号序列,以及任选的c-端his
·
序列。
[0147]
合适的宿主细胞包括大肠杆菌、乳酸乳球菌、酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、毕赤酵母等。合适的动物宿主细胞包括hek 293、cos、s2、cho、nso、dt40等。特别优选的是arctic大肠杆菌细胞。抗原结合蛋白的克隆、表达和/或纯化可以根据本领域技术人员已知的技术进行,包括杆状病毒感染的昆虫细胞系统。
[0148]
单域抗体的官能化。
[0149]
除了其可选的多价性和多特异性之外,单域抗体(sdabs)的显著优点是其能够容易地在单个dna质粒上与效应分子一起克隆和表达。这些延伸使得sdabs能够在除抗原结合本身之外的广泛应用中使用。由于其单结构域性质,sdabs易于通过分子或生物化学工程配备各种效应子功能。合适的效应分子具有许多不同的功能,例如激活抗体依赖性细胞毒性、裂解寄生虫和癌细胞膜、体外/体内成像和诊断。本发明中特别优选的效应分子是抗癌肽、裂解肽、l-鼠李糖、半乳糖-α-1,3-半乳糖、二硝基苯基、血清稳定分子、荧光分子、磷光分子、化学发光分子、生物发光分子、放射性同位素、发色团、己二酸二琥珀酰亚胺酯、人fc抗体片段。
[0150]
因此,本发明的一个实施方案涉及特异性结合球系列聚糖的多肽,其包含至少一种单域抗体或所述可变结构域的变体,并且其中所述单域抗体结合选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖,还包含与所述单域抗体连接的至少一种效应分子,其中所述效应分子选自抗癌肽、裂解肽、l-鼠李糖、半乳糖-α-1,3-半乳糖、二硝基苯基、血清稳定分子、荧光分子、磷光分子、化学发光分子。生物发光分子、放射性同位素、发色团、己二酸二琥珀酰亚胺酯、人fc抗体片段。
[0151]
具体而言,效应分子优选与单域抗体的c-端连接。此外,效应分子优选通过接头与单域抗体的c-端连接。优选的接头选自gs_linker(seq id no:127:ggggsggggs),gsaa_linker(seq id no:128:ggggseaaakggggs),srgs_linker(seq id no:178:srgssgssssgssggsg),和ggggs_linker(seq id no:228:ggggsggggsggggs)。优选地,包含两个丙氨酸和对应于酶限制位点的两个氨基酸“xx”的序列的“短连接序列”(seq id no:227:aaxx,其中x可以是任何氨基酸)在接头序列之前与单域抗体的c-端连接,其中x可以是任何氨基酸。
[0152]“抗癌肽”是在植物、动物和其他生物体中发现的肽,最初因其抗微生物活性而被发现。这些肽可以通过膜相互作用杀死细菌和癌细胞。细菌细胞或癌细胞与健康哺乳动物细胞之间的差异在于膜的电荷。细菌和癌细胞都具有整体带负电荷的膜。由于细菌和癌细胞的膜之间的相似性,膜破裂发生和诱导细胞死亡的机制也被认为是相似的。具有抗癌活性的示例性抗菌肽是ll-37、乳铁蛋白或血小板因子4(pf4)的c-端。单域抗体(sdab)和抗癌肽优选地与接头连接表达,所述接头优选为(gly4ser)n或(gly2ser)n单元的不同重复,或序列ggggseaaakggggs的不同重复。优选的接头是gs_linker(seq id no:127:ggggsggggs)、gsaa_linker(seq id no:128:ggggseaaakggggs)和srgs_linker(seq id no:178:srgssgssssgssggsg)。更具体地说,接头和抗癌肽与sdab的c-末端连接。此外,包含两个丙氨酸和对应于酶限制位点的两个氨基酸“xx”的序列(其中x可以是任何氨基酸)的短
连接序列(seq id no:227:aaxx,其中x可以是任何氨基酸)优选在接头序列之前与单域抗体的c末端连接。
[0153]
本发明的“裂解肽”包含修饰的半胱氨酸缺失的鲎抗菌肽-i(kwfrvyrgiyr,seq id no:130)、bmap28a(gglrslgrkilrawkkygpiivpiirig,seq id no:131)、polybia-mp1(idwkklldaakqil,seq id no:132)。
[0154]
鲎抗菌肽-i是一种从马蹄形蟹中分离的抗菌肽,通过其渗透细胞膜的能力抑制许多不同类型细菌的生长。从先前报道的缺少半胱氨酸的线性抗菌肽类似物(半胱氨酸缺失的抗菌肽,cdt,kwfrvyrgiyrrr-conh2)开始,wang等人的研究(int j pept res ther.2014)表明,从cdt中消除两个c-端精氨酸残基会产生一种肽([des-arg
12,13
]cdt),其具有保留的抗菌活性,但溶血减少,治疗剂所需的选择性。如本文所用,修饰的半胱氨酸缺失的鲎抗菌肽-i是指序列kwfrvyrgiyr。
[0155]
polybia-mp1是来自巴西黄蜂毒液的裂解肽,具有已知的抗癌性质。对polybia-mp1进行的体外研究提供了通过破坏膜或形成跨膜孔导致急性细胞损伤、肿胀和破裂的坏死引起的杀伤的证据。
[0156]
bmap-28是组织蛋白酶抑制素(cathelicidin)家族的牛抗菌肽,在人肿瘤细胞系和活化但非静息的人淋巴细胞中诱导膜透化和死亡。
[0157]
l-鼠李糖、半乳糖-α-1,3-半乳糖(αgal)和二硝基苯基(dnp)可以成功地引发抗体依赖性细胞毒性,而不管单域抗体中缺乏片段可结晶(fc)区。实际上,l-鼠李糖、半乳糖-α-1,3-半乳糖(αgal)和二硝基苯基(dnp)能够将天然产生的抗体募集到肿瘤细胞。以这种方式靶向的细胞可以被免疫系统识别为外来的,并被标记为可被破坏。向肿瘤细胞募集内源性抗体可以通过两种抗体效应机制进行破坏:补体依赖性细胞毒性(cdc)和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)。
[0158]
[0159][0160]
因此,本发明的优选实施方案涉及特异性结合球系列聚糖的多肽,其包含至少一种单域抗体,其中所述单域抗体是天然缺乏轻链且天然缺乏恒定区1的重链抗体的可变结构域,或所述可变结构域的变体,并且其中所述单域抗体结合选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖,并且还包含与所述单域抗体连接的至少一种效应分子,其中所述效应分子是选自半胱氨酸缺失的鲎抗菌肽-1、bmap28a、polybia-mp1的裂解肽。
[0161]
本发明的一个特别优选的实施方案涉及特异性结合球系列聚糖的多肽,其包含至少一种单域抗体,其中所述单域抗体是天然缺乏轻链且天然缺乏恒定区1的重链抗体的可变结构域,或所述可变结构域的变体,其中所述单域抗体结合至少一种选自globo h、gb3、gb4和gb5的球系列聚糖,并且还包含与所述单域抗体连接的至少一种效应分子,其中所述效应分子是选自半胱氨酸缺失的鲎抗菌肽-1、bmap28a、polybia-mp1的裂解肽,其中所述裂解肽通过接头与所述单域抗体的c-端连接。优选的接头选自gs_linker(seq id no:127:ggggsggggs)、gsaa_linker(seq id no:128:ggggseaaakggggs)和srgs_linker(seq id no:178:srgssgssssgssggsg)。优选地,短连接序列(seq id no:227:aaxx,其中x可以是任何氨基酸)在接头序列之前连接至单域抗体的c-端。
[0162]
本发明的一个特别优选的实施方案涉及特异性结合球系列聚糖的多肽,其包含至少一种单域抗体,其中所述单域抗体是天然缺乏轻链且天然缺乏恒定区1的重链抗体的可变结构域,或所述可变结构域的变体,并且其中所述单域抗体结合选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖,还包含与所述单域抗体连接的至少一种效应分子,其中所述效应分子是选自半胱氨酸缺失的鲎抗菌肽-1、bmap28a、polybia-mp1的裂解肽,其中所述裂解肽通过接头与所述单域抗体的c-端连接。优选的接头选自gs_linker(seq id no:127:ggggsggggs)、gsaa_linker(seq id no:128:ggggseaaakggggs)和srgs_linker(seq id no:178:srgssgssssgssggsg)。优选地,短连接序列(seq id no:227:aaxx,其中x可以是任何氨基酸)在接头序列之前与单域抗体的c-端连接。
[0163]
本发明的另一个优选实施方案涉及特异性结合球系列聚糖的多肽,其包含至少一种单域抗体,其中所述单域抗体是天然缺乏轻链且天然缺乏恒定区1的重链抗体的可变结构域,或所述可变结构域的变体,其中所述单域抗体结合选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖,并且还包含与所述单域抗体连接的至少一种效应分子,其中所述效应分子是选自半胱氨酸缺失的鲎抗菌肽-1、bmap28a、聚bia-mp1的裂解肽,所述多肽与选自seq id no:19-63、142-156、179-226的序列具有至少85%的序列同一性。
[0164]
本发明的另一个特别优选的实施方案涉及特异性结合球系列聚糖的多肽,其包含
至少一种单域抗体,其中所述单域抗体是天然缺乏轻链且天然缺乏恒定区1的重链抗体的可变结构域,或所述可变结构域的变体,其中所述单域抗体结合选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖,并且还包含与所述单域抗体连接的至少一种效应分子,其中所述效应分子是选自包含半胱氨酸缺失的鲎抗菌肽-1、bmap28a、polybia-mp1的组的裂解肽,其中所述裂解肽用选自包含gs_linker(seq id no:127:ggggsggggs)、gsaa_linker(seq id no:128:ggggseaaakggggs)和srgs_linker(seq id no:178:srgssgssssgssggsg)的组的接头连接至所述单域抗体的c-端,所述多肽与选自seq id no:19-63、142-156、179-226的序列具有至少85%序列同一性。优选地,短连接序列(seq id no:227:aaxx,其中x可以是任何氨基酸)在接头序列之前与单域抗体的c-端连接。
[0165]
换句话说,本发明的优选实施方案涉及特异性结合球系列聚糖的多肽,其包含至少一种单域抗体,其中所述单域抗体是天然缺乏轻链且天然缺乏恒定区1的重链抗体的可变结构域,或所述可变结构域的变体,其中所述单域抗体结合选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖,并且还包含与所述单域抗体连接的至少一种效应分子,其中所述效应分子是选自包含半胱氨酸缺失的鲎抗菌肽-1、bmap28a、polybia-mp1的组的裂解肽,其中所述裂解肽通过选自包含gs_linker(seq id no:127:ggggsggggs)、gsaa_linker(seq id no:128:ggggseaaakggggs)和srgs_linker(seq id no:178:srgssgssssgssggsg)的组的接头与所述单域抗体的c-端连接,其中短连接序列(seq id no:227,其中x可以是任何氨基酸)在接头序列之前连接至单域抗体的c-端,所述多肽与选自seq id no:19-63、142-156、179-226的序列具有至少85%的序列同一性。
[0166]
sdab缺乏fc区,因此不能如此诱导fc受体依赖性效应子功能。但是,人fc抗体片段可以与单域抗体连接或融合,以恢复其与新生儿fc受体或fcrn相互作用的能力。sdab-fc融合结构的一个重要优点是引入fc受体依赖性效应子功能,例如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(adcp)和补体依赖性细胞毒性(cdc)。不同的人和小鼠抗体亚类的fc区(ch2-ch3)已经与sdab遗传融合。sdab与fc抗体片段的连接或融合也具有通过亲合力效应显著增加血清半衰期和增强靶抗原结合的优点。
[0167]
单域抗体的稳定化。
[0168]
延长sdab半衰期的另一种策略是将sdab与长寿命血清蛋白或靶向这些长寿命蛋白的结构单元偶联。例如,血清白蛋白的长血清半衰期是由于其在细胞摄取后逃避分解代谢的能力。另一种方法包括将sdab与结合sdab的白蛋白融合。
[0169]
因此,本发明还涉及一种多肽,其进一步包含针对受试者的一种或多种血清蛋白的一种抗体(例如单域抗体),其在所述多肽的循环中显著延长了半衰期。血清蛋白可以是在受试者血清中发现的任何合适的蛋白质或其片段。在本发明的一个方面,血清蛋白是血清白蛋白、血清免疫球蛋白、甲状腺素结合蛋白、转铁蛋白或纤维蛋白原。根据预期用途,例如有效治疗和/或靶抗原区室化所需的半衰期,抗体可以针对上述血清蛋白之一。
[0170]
基于单域抗体的car-t细胞疗法
[0171]
如本文所用,术语“嵌合抗原受体”或“car”是指人工构建的杂合蛋白或多肽,其包含与t细胞跨膜域连接的抗体(例如,单链可变片段(单链fv)或sdab)的抗原结合结构域,该抗体依次连接到t细胞胞内信号传导或激活域;抗原结合结构域和跨膜域之间的连接通过铰链区发生。car的结构域或其他功能或结构序列,例如跨膜域或细胞内活化或信号传导结
11、seq id no 13、seq id no 15、seq id no 17、seq id no 136、seq id no 137和seq id no 138的序列具有至少90%的序列同一性。
[0180]
本发明的另一个优选的实施方案是特异性结合球系列聚糖的多肽,其包含至少一种单域抗体,其中所述单域抗体是天然缺乏轻链且天然缺乏恒定区1的重链抗体的可变结构域,或所述可变结构域的变体,其中所述单域抗体结合选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖,还包含至少一个细胞外铰链区、至少一个跨膜域、至少一个共刺激结构域、和至少一个共刺激结构域,其中所述单域抗体与胞外铰链区连接,其中所述至少一种单域抗体是人源化单域抗体。还公开了,根据kabat编号,通过替换位于fr1的位置1、5、11、28和30、fr2的位置44和45、fr3的位置74、75、76、83、84、93和94;在fr4中位置104和108的一个或多个氨基酸残基来人源化单域抗体
[0181]
本发明还涉及编码特异性结合球系列聚糖的多肽的重组核酸分子,所述多肽包含至少一种单域抗体,其中所述单域抗体是天然缺乏轻链且天然缺乏恒定区1的重链抗体的可变结构域,或所述可变结构域的变体,其中所述单域抗体结合选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖,并且还包含至少一个细胞外铰链区、至少一个跨膜域、至少一个共刺激结构域和至少一个细胞内激活域,其中所述单域抗体与所述细胞外铰链区连接。此外,本发明提供了包含重组核酸分子的载体和宿主细胞,所述重组核酸分子编码特异性结合包含至少一种单域抗体的球系列聚糖的多肽,其中所述单域抗体是天然缺乏轻链且天然缺乏恒定区1的重链抗体的可变结构域,或所述可变结构域的变体,其中所述单域抗体结合选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖,并且还包含至少一个细胞外铰链区,至少一个跨膜域、至少一个共刺激结构域和至少一个细胞内激活域,其中所述单域抗体与所述细胞外铰链区连接。
[0182]
本发明的一个更优选的实施方案是特异性结合球系列聚糖的多肽,其包含至少一种单域抗体,其中所述单域抗体是天然缺乏轻链且天然缺乏恒定区1的重链抗体的可变结构域,或所述可变结构域的变体,其中所述单域抗体结合选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖,还包含至少一个细胞外铰链区、至少一个跨膜域、至少一个共刺激结构域、至少一个细胞外铰链区、和至少一个胞内激活域,其中所述单域抗体与胞外铰链区连接,用于治疗癌症,其中所述癌症的癌细胞在其表面上表达选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖。
[0183]
本发明的一个更优选的实施方案是特异性结合球系列聚糖的多肽,其包含至少一种单域抗体,其中所述单域抗体是天然缺乏轻链且天然缺乏恒定区1的重链抗体的可变结构域,或所述可变结构域的变体,所述单域抗体结合至少一种从globoh、gb3、gb4和gb5中选择的球系列聚糖,还包括至少一个细胞外铰链区、至少一个跨膜区、至少一个共刺激区和至少一个细胞内激活区,其中所述单域抗体连接到所述细胞外铰链区,用于癌症治疗,其中所述癌症的癌细胞在其表面上表达至少一种选自globo h、gb3、gb4和gb5的球系列聚糖,其中所述癌症选自脑癌、肝癌、胆管癌、肾癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、小细胞肺癌、卵巢癌、宫颈癌、食管癌,胃癌、胰腺癌和结直肠癌。
[0184]
嵌合抗原受体的铰链区通常衍生自人cd8-α链(wo2016019300a1中的示例性序列seq id no:4,或如us 20160303166 a1中所述的其片段)。
[0185]
嵌合抗原受体的跨膜域穿过质膜并连接细胞外结构域和细胞内信号结构域。跨膜
域的实例包括但不限于人cd28(示例性序列:us20160303166a1中的seq id no:4的残基153-179)、cd8-α(示例性序列wo2016019300a1中的seq id no:12)。
[0186]
胞内激活域传递发挥car t细胞的效应器功能所需的信号。更具体地,当细胞外结构域与靶globo h系列聚糖结合时,细胞内激活域传递细胞活化所需的信号。胞内激活域通常是人cd3-ζ(wo2016019300a1中的示例性序列seq id no:18或20)。
[0187]
如本文所用的“共刺激结构域”(csd)是指car中增强记忆细胞的增殖、存活和/或发育的部分。本发明的cars可包含一个或多个共刺激结构域。每个共刺激结构域可包含例如cd28(wo2016019300a1中的示例性序列seq id no:44)、4-1bb(cd137,在wo2016019300a1中的示例性序列seq id no:14)和icos(wo2016014553a1中的示例性序列seq id no:263)的共刺激结构域。
[0188]
现有技术中已经描述了用于构建嵌合抗原受体的方法,例如us20160303166a1、wo2016014553 a1、xie等人pnas 2018中。
[0189]
此外,本发明还描述了一种用于生成基因工程嵌合抗原受体t细胞(car t细胞)的方法,其包括:
[0190]
a)生产嵌合抗原受体(car)构建体,其具有至少一种单域抗体,其中所述单域抗体结合选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖,至少一个细胞外铰链区,至少一个跨膜域,至少一个共刺激结构域,和至少一个细胞内激活域,其中所述单域抗体与所述细胞外铰链区连接,
[0191]
b)转染从受试者血液中取出的t细胞,
[0192]
c)表达car构建体以在t细胞中产生功能性car,以产生特异性识别选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖的car t细胞。
[0193]
可包含并表达本发明的cars的基因工程化t细胞包括但不限于t淋巴细胞(t细胞)、幼稚t细胞(tn)、记忆t细胞(例如,中枢记忆t细胞(tcm)、效应记忆细胞(tem))、自然杀伤细胞、造血干细胞和/或能够产生治疗相关的后代的多能胚胎/诱导干细胞。在一个实施方案中,基因工程化细胞是自体细胞。举例来说,本发明的单个t细胞可以是cd4
+
/cd8-、cd4-/cd8
+
、cd4-/cd8-或cd4
+
/cd8
+
。t细胞可以是cd4
+
/cd8-和cd4-/cd8
+
细胞的混合体,也可以是单个克隆的群体。当在体外与表达靶抗原的细胞(即表达globo h系列聚糖的癌细胞)共同培养时,本发明的t细胞cd4
+
可以产生il-2、ifnγ、tnfα和其他t细胞效应细胞因子。当在体外与靶细胞(即表达globo h系列聚糖的癌细胞)共同培养时,本发明的t细胞cd8
+
可以裂解抗原特异性靶细胞。
[0194]
最后,本发明还描述了一种用于治疗患有癌症的受试者的方法,其中所述癌症的癌细胞在其表面上表达至少一种选自globo h、gb3、gb4和gb5的球系列聚糖,所述方法包括向患有所述癌症的受试者施用特异性识别至少一种选自globo h、gb3、gb4和gb5的球系列聚糖的嵌合抗原受体t细胞(car t细胞),其中所述car t细胞表达功能性car多肽,所述功能性car多肽包含结合至少一种选自globo h、gb3、gb4和gb5的球系列聚糖的单域抗体、至少一个细胞外铰链区、至少一个跨膜域、至少一个共刺激结构域和至少一个细胞内激活域,以有效量用于治疗患有所述癌症的受试者。
[0195]
单域抗体的人源化
[0196]
本发明的变体序列可以包括特异性结合至少一种选自globoh、gb3、gb4和gb5的聚
糖的已经人源化的单域抗体。sdab的人源化旨在进一步降低施用后人类个体中不想要的免疫反应的可能性。本发明的一个实施方案涉及基于羊驼抗体的经修饰的单域抗体,其中不影响该结构域对靶标的天然亲和力的sdab的氨基酸残基被修饰以降低sdab相对于人的免疫原性。
[0197]
更具体地,本发明涉及经修饰的sdabs,其经修饰以施用给人,以及此类“人源化”sdabs在治疗人类疾病中的用途。本发明的单域抗体的人源化包括将一个或多个羊驼氨基酸替换为在人共有序列中发现的人对应物的步骤,而不会使该单域抗体丧失其典型特征,即人源化不会显著影响所得单域抗体以及包含它的多肽的抗原结合能力。此类方法是本领域技术人员已知的。
[0198]
羊驼单域抗体或更一般的骆驼科单域抗体的人源化需要在单个多肽链中引入和诱变有限量的氨基酸。
[0199]
因此,本发明的一个实施方案是特异性结合球系列聚糖的多肽,其包含至少一种单域抗体,其中所述单域抗体是天然缺乏轻链且天然缺乏恒定区1的重链抗体的可变结构域,或所述可变结构域的变体,其中所述单域抗体结合选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖,其中所述至少一种单域抗体是人源化单域抗体。
[0200]
通常,如ep 1687338 b1所述,通过单独或组合替换羊驼单域抗体中任何以下残基来获得人源化单域抗体:
[0201]
fr1位于1、5、11、28和30位置的标志氨基酸,
[0202]
fr2位于44和45位置的标志氨基酸,
[0203]
fr3位于74、75、76、83、84、93和94位置的标志氨基酸,
[0204]
fr4位于103、104、108和111位置的标志氨基酸;
[0205]
其中所述编号是根据kabat编号。
[0206]
fr1、fr3、fr4中残基的人源化将对单域抗体的功能和稳定性具有最小的影响,而fr2位于44和45的突变甚至会稳定单域抗体(vincke等人,j.biol.chem.2009)。然而,ep 1687338 b1报道了fr4中q108l的诱变可导致大肠杆菌中较低的生产水平。位置108在骆驼科vhh中暴露于溶剂,而在人抗体中,该位置埋藏在vh-vl界面处。引入非极性疏水性leu,而不是引入极性不带电荷的gln,可以对分子的固有折叠/稳定性产生巨大影响。fr2中位置37和47的单域抗体标志残基对抗原相互作用的完整性具有主要影响,因此不能被人源化(vincke等人,2009)。
[0207]
如us 7807162 b2所述,表1报告了本发明的羊驼sdabs中的标志残基和最密切相关的人vh结构域vh3的相应位置处的氨基酸残基。该表显示本文公开的羊驼单域抗体的位于103和111的标志氨基酸与人vh3的最常见残基相同。
[0208]
因此,本发明的另一个实施方案是特异性结合球系列聚糖的多肽,其包含至少一种单域抗体,其中所述单域抗体是天然缺乏轻链且天然缺乏恒定区1的重链抗体的可变结构域,或所述可变结构域的变体,其中所述单域抗体结合至少一种选自globo h、gb3、gb4和gb5的球系列聚糖,并且,根据kabat编号,其中所述至少一种单域抗体通过替换位于fr1中的位置1、5、11、28和30,fr2中位置44和45,fr3中位置74、75、76、83、84、93和94,fr4位置104和108的一个或多个氨基酸残基来人源化。
[0209]
因此,人源化多肽显示出与人vh框架区的高氨基酸序列同源性,并且所述多肽可
以直接施用于人,而不期望从中产生不想要的免疫应答,并且没有进一步人源化的负担。本发明还涉及能够编码所述人源化多肽的重组核酸。
[0210]
本发明的一个优选实施方案是球系列聚糖结合多肽,其包含特异性结合选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖的至少一种单域抗体,其中所述至少一种单域抗体通过替换位于fr1中的位置1、5、11、28和30,fr2中的位置44和45,fr3中的位置74、75、76、83、84、93和94,fr4中的位置104和108的一个或多个氨基酸残基,并且还包含与所述单域抗体连接的至少一种效应分子,其中所述效应分子选自抗癌肽、裂解肽、l-鼠李糖、半乳糖-α-1,3-半乳糖、二硝基苯基、血清稳定分子、荧光分子、磷光分子、化学发光分子、生物发光分子、放射性同位素、发色团、己二酸二琥珀酰亚胺酯、人fc抗体片段。
[0211]
本发明的一个更优选的实施方案是球系列聚糖结合多肽,其包含特异性结合选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖的至少一种单域抗体,其中所述至少一种单域抗体通过替换位于fr1中的位置1、5、11、28和30、fr2中的位置44和45、fr3中的位置74、75、76、83、84、93和94,fr4中的位置104和108位的一个或多个氨基酸残基来人源化,并还包含至少一个连接到所述单域抗体的效应分子,其中所述效应分子是选自经修饰的半胱氨酸缺失的鲎抗菌肽-1、bmap28a、polybia-mp1的裂解肽。
[0212][0213]
氨基酸以单字母代码列出;粗体残基:人中最常见的残基;带下划线的残基:羊驼sdabs的残基,与人vh3中的残基相对应
[0214]
药物组合物
[0215]“药物组合物”是指使活性成分的生物活性有效的形式的制剂,并且其不含对被施用该制剂的受试者有毒的额外组分。
[0216]
如本文所用,术语“药学上可接受的”、“生理上可耐受的”及其语法变体可互换使用,并且表示材料能够施用于哺乳动物或施用于哺乳动物而不产生不期望的生理作用,例如恶心、头晕、胃部不适等。
[0217]
设计药物组合物以促进以有效方式施用包含单域抗体的本发明多肽。
[0218]“药学上可接受的媒介物”是指药物制剂中除活性成分之外的成分,其对被施用的受试者无毒。药学上可接受的媒介物包括但不限于缓冲剂、稳定剂或防腐剂。
[0219]
合适的媒介物或赋形剂的实例包括但不限于乳糖、右旋糖、蔗糖、葡萄糖、糖粉、山梨醇、甘露糖醇、木糖醇、淀粉、阿拉伯胶、黄原胶、瓜尔胶、塔拉胶、牧豆树胶(mesquite gum)、胡芦巴胶、刺槐豆胶、茄替胶(ghatti gum)、黄芪胶、肌醇、糖蜜、麦芽糖糊精、爱尔兰苔藓提取物、潘瓦尔胶、依沙泊壳粘液(mucliage of isapol husks)、硅酸镁铝(veegum)、落叶松阿拉伯半乳聚糖、硅酸钙、磷酸钙、磷酸二钙、硫酸钙、高岭土、氯化钠、聚乙二醇、褐藻胶、明胶、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、盐水、糖浆、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基乙基纤维素、羧甲基纤维素、聚丙烯酸如卡波姆,如卡波姆941、卡波姆980、卡波姆981,和pharmagum
tm
(spi pharma group;新泽西州纽卡斯尔)等树胶基料,类似的;通常,本发明的组合物包含约10重量%至约90重量%的媒介物、赋形剂或其组合。
[0220]
优选地,药物组合物含有按重量计约0.001%至约90%,优选约0.01%至约75%,更优选约0.1%至50%,还更优选约0.1%至10%的本发明的多肽,其余由合适的药物媒介物、赋形剂和/或稀释剂组成。
[0221]
药物组合物可以配制成粉末、颗粒、片剂、胶囊、悬浮液、乳液、糖浆、口服剂型、外用制剂、栓剂或无菌注射溶液的形式,例如分别以常规方式雾化。配制时,可以使用稀释剂或赋形剂制备,例如通常使用的填充剂、增量剂(extenders)、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂。
[0222]
在药物组合物中,用于口服施用的固体制剂可以是片剂、丸剂、粉末、颗粒或胶囊。固体制剂可进一步包含赋形剂。赋形剂可以是诸如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖或明胶。此外,固体制剂还可以包含润滑剂,例如硬脂酸镁或滑石。在药物组合物中,用于口服施用的液体制剂可以最好是悬浮液、溶液、乳液或糖浆。液体制剂可包含水或液体石蜡。作为赋形剂,液体制剂可以包括诸如润湿剂、甜味剂、芳香剂或防腐剂。出于肠外施用的目的,含有本发明的多肽的组合物优选地溶解在蒸馏水中,并且优选将ph调节至约6至8。
[0223]
用于肠外施用的本发明组合物的有用制剂还包括无菌水性和非水性溶剂、悬浮液和乳液。有用的非水溶剂的实例包括丙二醇、聚乙二醇、植物油、鱼油和可注射的有机酯。
[0224]
本发明的一个实施方案是药物组合物,其包含特异性结合球系列聚糖的多肽,所述多肽包含至少一种单域抗体,其中所述单域抗体是天然缺乏轻链且天然缺乏恒定区1的重链抗体的可变结构域,或所述可变结构域的变体,其中所述单域抗体结合选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖,以及至少一种药学上可接受的媒介物、赋形剂和/或稀释剂。
[0225]
本发明的另一个实施方案是包含球系列聚糖结合多肽的药物组合物,所述球系列
聚糖结合多肽包含至少一种单域抗体,所述单域抗体特异性结合至少一种选自globo h、gb3、gb4和gb5的球系列聚糖,还包含至少一种与所述单域抗体连接的效应分子,其中所述效应分子选自抗癌肽、裂解肽、l-鼠李糖、半乳糖-α-1,3-半乳糖、二硝基苯基、血清稳定分子、荧光分子、磷光分子、化学发光分子、生物发光分子、放射性同位素、发色团、己二酸二琥珀酰亚胺酯、人fc抗体片段,以及至少一种药学上可接受的媒介物、赋形剂和/或稀释剂。
[0226]
本发明的另一个具体实施方案是包含球系列聚糖结合多肽以及至少一种药学上可接受的媒介物、赋形剂和/或稀释剂的药物组合物,所述球系列聚糖结合多肽包含至少一种单域抗体,所述单域抗体特异性结合至少一种选自globo h、gb3、gb4和gb5的球系列聚糖,还包含至少一种与所述单域抗体连接的效应分子,其中所述效应分子是选自半胱氨酸缺失的鲎抗菌肽-1、bmap28a、polybia-mp1的裂解肽。
[0227]
本发明的一个更具体的实施方案是包含球系列聚糖结合多肽的药物组合物,所述球系列聚糖结合多肽包含至少一种特异性结合选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖的单域抗体,并且还包含与所述单域抗体连接的至少一种效应分子,其中所述效应分子是选自半胱氨酸缺失的鲎抗菌肽-1、bmap28a、polybia-mp1的裂解肽,所述多肽与选自seq id no:19-63、142-156的序列具有至少85%的序列同一性,以及至少一种药学上可接受的媒介物、赋形剂和/或稀释剂。
[0228]
本发明的另一个实施方案是包含球系列聚糖结合多肽的药物组合物,所述球系列聚糖结合多肽包含特异性结合选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖的至少一种单域抗体,并且,根据kabat编号,其中所述至少一种单域抗体通过替换位于fr1中的位置1、5、11、28和30,fr2中的位置44和45,fr3中的位置74、75、76、83、84、93和94,fr4中的位置104和108的一个或多个氨基酸残基;以及至少一种药学上可接受的媒介物、赋形剂和/或稀释剂。本发明的一个实施方案是药物组合物,其包含一种多肽,所述多肽包含特异性结合选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖的至少一种人源化单域抗体,以及至少一种药学上可接受的媒介物、赋形剂和/或稀释剂。
[0229]
针对癌症的单域抗体的用途
[0230]
本发明的另一个实施方案涉及特异性结合球系列聚糖的多肽,其包含至少一种单域抗体,其中所述单域抗体是天然缺乏轻链且天然缺乏恒定区1的重链抗体的可变结构域,其中所述单域抗体结合至少一种选自globo h、gb3、gb4和gb5的球系列聚糖,或包含所述多肽的药物组合物,用于治疗和/或诊断癌症,其中所述癌症的癌细胞在其表面上表达至少一种选自globo h、gb3、gb4和gb5的球系列聚糖。
[0231]
本发明的另一个实施方案涉及特异性结合包含至少一种单域抗体或其变体的球系列聚糖的多肽,其中所述单域抗体结合至少一种选自globo h、gb3、gb4和gb5的球系列聚糖,或包含所述多肽的药物组合物,其用于治疗和/或诊断癌症,其中所述癌症的癌细胞在其表面上表达至少一种选自globo h、gb3、gb4和gb5的球系列聚糖,并且其中所述癌症选自脑癌、肝癌、胆管癌、肾癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、小细胞肺癌、卵巢癌、宫颈癌、食道癌、胃癌、胰腺癌和结肠直肠癌。
[0232]
此外,本发明的一个方面涉及一种球系列聚糖结合多肽,其包含特异性结合选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖的至少一种单域抗体,并且,根据kabat编号,其中所述至少一种单域抗体通过替换位于fr1中的位置1、5、11、28和30,fr2中的位置44
和45,fr3中的位置74、75、76、83、84、93和94,fr4中的位置104和108位的一个或多个氨基酸残基;其中所述癌症的癌细胞在其表面上表达选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖。稍加改写的本发明的一个实施方案涉及用于治疗和/或诊断癌症的球系列聚糖结合多肽,其包含至少一种人源化单域抗体,所述人源化单域抗体特异性结合至少一种选自globo h、gb3、gb4和gb5的球系列聚糖,其中所述癌症的癌细胞在其表面上表达至少一种选自globo h、gb3、gb4和gb5的球系列聚糖。
[0233]
此外,本发明的一个方面涉及包含一种球系列聚糖结合多肽的药物组合物,所述球系列聚糖结合多肽包含特异性结合选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖的至少一种单域抗体,根据kabat编号,其中所述至少一种单域抗体通过替换位于fr1中的位置1、5、11、28和30、fr2中的位置44和45、fr3中的位置74、75、76、83、84、93和94,fr4中的位置104和108的一个或多个氨基酸残基,用于癌症的治疗和/或癌症的诊断,其中所述癌症的癌细胞在其表面上表达选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖。
[0234]
本发明的一个优选实施方案是球系列聚糖结合多肽,其包含特异性结合选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖的至少一种单域抗体,根据kabat编号,其中所述至少一种单域抗体通过替换位于fr1中的位置1、5、11、28和30、fr2中的位置44和45、fr3中的位置74、75、76、83、84、93和94,fr4中的位置104和108的一个或多个氨基酸残基,或包含所述多肽的药物组合物,于癌症的治疗和/或诊断,其中所述癌症的癌细胞在其表面上表达选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖,并且其中所述癌症选自脑癌、肝癌、胆管癌、肾癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、小细胞肺癌、卵巢癌、宫颈癌、食道癌、胃癌、胰腺癌和结肠直肠癌。
[0235]
本发明的更优选的实施方案是一种球系列聚糖结合多肽,其包含特异性结合选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖的至少一种单域抗体,根据kabat编号,其中所述至少一种单域抗体通过替换位于fr1中的位置1、5、11、28和30、fr2中的位置44和45、fr3中的位置74、75、76、83、84、93和94,fr4中的位置104和108位的一个或多个氨基酸残基,并进一步包含至少一个连接到所述单域抗体的效应分子,其中所述效应分子是选自修饰的半胱氨酸缺失的鲎抗菌肽-1、bmap28a、polybia-mp1的裂解肽,或包含所述多肽的药物组合物,用于治疗癌症,其中所述癌症的癌细胞在其表面上表达选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖。
[0236]
本发明的更优选的实施方案是一种球系列聚糖结合多肽,其包含特异性结合选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖的至少一种单域抗体,根据kabat编号,其中所述至少一种单域抗体通过替换位于fr1中的位置1、5、11、28和30、fr2中的位置44和45、fr3中的位置74、75、76、83、84、93和94,fr4中的位置104和108位的一个或多个氨基酸残基,并进一步包含至少一个连接到所述单域抗体的效应分子,其中所述效应分子是选自包含修饰的半胱氨酸缺失的鲎抗菌肽-1、bmap28a、polybia-mp1的组的裂解肽,或包含所述多肽的药物组合物,用于癌症的治疗,其中所述癌症的癌细胞在其表面上表达至少一种选自globo h、gb3、gb4和gb5的球系列聚糖,其中所述癌症选自脑癌、肝癌、胆管癌、肾癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、小细胞肺癌、卵巢癌、宫颈癌、食道癌、胃癌、胰腺癌和结肠直肠癌。
[0237]
本发明的另一个实施方案涉及特异性结合球系列聚糖的多肽,其包含至少一种单域抗体,其中所述单域抗体是天然缺乏轻链且天然缺乏恒定区1的重链抗体的可变结构域,
或所述可变结构域的变体,其中所述单域抗体结合至少一种选自globo h、gb3、gb4和gb5的球系列聚糖,并且还包含至少一个car细胞外铰链区、至少一个car跨膜域、至少一个car共刺激结构域和至少一个car胞内激活域,其中所述单域抗体与car胞外铰链区连接,用于治疗癌症,其中所述癌症的癌细胞在其表面上表达选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖。
[0238]
本发明的另一个实施方案涉及特异性结合球系列聚糖的多肽,其包含至少一种单域抗体,其中所述单域抗体是天然缺乏轻链且天然缺乏恒定区1的重链抗体的可变结构域,或所述可变结构域的变体,并且其中所述单域抗体结合选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖,并且还包含至少一个细胞外cd8-α铰链区,至少一个cd8-α或cd28跨膜域,至少一个cd28、4-ibb、icos共刺激结构域和至少一个cd3-ζ细胞内激活域,其中所述单域抗体与car细胞外铰链区连接,用于治疗癌症,其中所述癌症的癌细胞在其表面上表达选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖。
[0239]
本发明的另一个实施方案涉及特异性结合球系列聚糖的多肽,其包含至少一种单域抗体,其中所述单域抗体是天然缺乏轻链且天然缺乏恒定区1的重链抗体的可变结构域,或所述可变结构域的变体,其中所述单域抗体结合至少一种选自globo h、gb3、gb4和gb5的球系列聚糖,并且还包含至少一个car细胞外铰链区、至少一个car跨膜域、至少一个car共刺激结构域和至少一个car胞内激活域,其中所述单域抗体与car胞外铰链区连接,用于治疗癌症,其中所述癌症的癌细胞在其表面上表达至少一种选自globo h、gb3、gb4和gb5的球系列聚糖,其中所述癌症选自脑癌、肝癌、胆管癌、肾癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、小细胞肺癌、卵巢癌、宫颈癌、食道癌、胃癌、胰腺癌和结肠直肠癌。
[0240]
本发明的另一个实施方案涉及特异性结合球系列聚糖的多肽,其包含至少一种单域抗体,其中所述单域抗体是天然缺乏轻链且天然缺乏恒定区1的重链抗体的可变结构域,或所述可变结构域的变体,其中所述单域抗体结合选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖,并且还包含至少一个细胞外cd8-α铰链区,至少一个cd8-α或cd28跨膜域、至少一个cd28、4-ibb、icos共刺激结构域和至少一个cd3-ζ细胞内激活域,其中所述单域抗体与car细胞外铰链区连接,用于治疗癌症,其中所述癌症的癌细胞在其表面上表达选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖,其中所述癌症选自脑癌、肝癌、胆管癌、肾癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、小细胞肺癌、卵巢癌、宫颈癌、食道癌、胃癌、胰腺癌和结肠直肠癌。
[0241]
本文还描述了一种用于治疗癌症的方法,其中所述癌症的癌细胞在其表面上表达选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖,该方法包括向患有所述癌症的患者施用治疗有效量的如本文公开的多肽或治疗有效量的包含所述多肽的药物组合物。
[0242]
具体而言,本发明描述了一种用于治疗癌症的方法,其中所述癌症的癌细胞在其表面上表达选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖,该方法包括向患有所述癌症的患者施用治疗有效量的包含至少一种单域抗体的特异性结合球系列聚糖的多肽,其中所述单域抗体是天然缺乏轻链且天然缺乏恒定区1的重链抗体的可变结构域,或所述可变结构域的变体,其中所述单域抗体结合选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖,或治疗有效量的包含所述多肽的药物组合物。
[0243]
本文还描述了一种用于治疗癌症的方法,其中所述癌症的癌细胞在其表面上表达选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖,所述方法包括向患有所述癌症的患者
施用治疗有效量的如本文公开的多肽或治疗有效量的包含所述多肽的药物组合物,其中所述癌症选自包括脑癌、肝癌、胆管癌、肾癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、小细胞肺癌、卵巢癌、宫颈癌、食道癌、胃癌、胰腺癌和结肠直肠癌的组。
[0244]
具体而言,本发明描述了一种用于治疗癌症的方法,其中所述癌症的癌细胞在其表面上表达至少一种选自globo h、gb3、gb4和gb5的球系列聚糖,所述方法包括向患有所述癌症的患者施用治疗有效量的球系列聚糖结合多肽,所述球系列聚糖结合多肽包含至少一种特异性结合至少一种选自globo h、gb3、gb4和gb5的球系列聚糖的单域抗体,根据kabat编号,其中所述至少一种单域抗体通过替换位于fr1中的位置1、5、11、28和30,fr2中的位置44和45,fr3中的位置74、75、76、83、84、93和94,fr4中的位置104和108处的一个或多个氨基酸残基而人源化,或治疗有效量的包含所述多肽的药物组合物。
[0245]
此外,本发明描述了一种用于治疗癌症的方法,其中所述癌症的癌细胞在其表面上表达至少一种选自globo h、gb3、gb4和gb5的球系列聚糖,所述方法包括向患有所述癌症的患者施用治疗有效量的球系列聚糖结合多肽,所述球系列聚糖结合多肽包含至少一种特异性结合至少一种选自globo h、gb3、gb4和gb5的球系列聚糖的单域抗体,根据kabat编号,其中所述至少一种单域抗体通过替换位于fr1中的位置1、5、11、28和30,fr2中的位置44和45,fr3中的位置74、75、76、83、84、93和94,fr4中的位置104和108处的一个或多个氨基酸残基而人源化,或治疗有效量的包含所述多肽的药物组合物,其中所述癌症选自脑癌、肝癌、胆管癌、肾癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、小细胞肺癌、卵巢癌、宫颈癌、食道癌、胃癌、胰腺癌和结肠直肠癌。
[0246]
更具体地,本发明描述了一种用于治疗癌症的方法,其中所述癌症的癌细胞在其表面上表达选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖,所述方法包括向患者施用治疗有效量的球系列聚糖结合多肽,所述球系列聚糖结合多肽包含特异性结合选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖的至少一种单域抗体,根据kabat编号,其中所述至少一种单域抗体通过替换位于fr1中的位置1、5、11、28和30,fr2中的位置44和45,fr3中的位置74、75、76、83、84、93和94,fr4中的位置104和108处的一个或多个氨基酸残基而人源化,并进一步包含至少一个连接到所述单域抗体的效应分子,其中所述效应分子是选自包含经修饰的半胱氨酸缺失的鲎抗菌肽-1、bmap28a、polybia-mp1的组的裂解肽,或治疗有效量的包含所述多肽的药物组合物。
[0247]
仍更具体地,本发明描述了一种用于治疗癌症的方法,其中所述癌症的癌细胞在其表面上表达至少一种选自globo h、gb3、gb4和gb5的球系列聚糖,所述方法包括向患有所述癌症的患者施用治疗有效量的球系列聚糖结合多肽,所述球系列聚糖结合多肽包含至少一种特异性结合至少一种选自globo h、gb3、gb4和gb5的球系列聚糖的单域抗体,根据kabat编号,其中所述至少一种单域抗体通过替换位于fr1中的位置1、5、11、28和30,fr2中的位置44和45,fr3中的位置74、75、76、83、84、93和94,fr4中的位置104和108处的一个或多个氨基酸残基而人源化;并进一步包含至少一个连接到所述单域抗体的效应分子,其中所述效应分子是选自包含经修饰的半胱氨酸缺失的鲎抗菌肽-1、bmap28a、polybia-mp1的组的裂解肽,或治疗有效量的包含所述多肽的药物组合物,其中所述癌症选自包含脑癌、肝癌、胆管癌、肾癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、小细胞肺癌、卵巢癌、宫颈癌、食道癌、胃癌、胰腺癌和结肠直肠癌的组。
[0248]
此外,本发明描述了一种用于治疗癌症的方法,其中所述癌症的癌细胞在其表面上表达至少一种选自globo h、gb3、gb4和gb5的球系列聚糖,所述方法包括向患有所述癌症的患者施用治疗有效量的球系列聚糖结合多肽,所述球系列聚糖结合多肽包含至少一种特异性结合至少一种选自globo h、gb3、gb4和gb5的球系列聚糖的单域抗体,并且还包含至少一个car细胞外铰链区、至少一个car跨膜域、至少一个car共刺激结构域和至少一个car细胞内激活域,其中所述单域抗体与car细胞外铰链区连接。
[0249]
此外,本发明描述了一种用于治疗癌症的方法,其中所述癌症的癌细胞在其表面上表达至少一种选自globo h、gb3、gb4和gb5的球系列聚糖,所述方法包括向患有所述癌症的患者施用治疗有效量的球系列聚糖结合多肽,所述球系列聚糖结合多肽包含至少一种特异性结合至少一种选自globo h、gb3、gb4和gb5的球系列聚糖的单域抗体,并且还包含至少一个car细胞外铰链区、至少一个car跨膜域、至少一个car共刺激结构域和至少一个car细胞内激活域,其中所述单域抗体与car细胞外铰链区连接,还包含至少一个细胞外cd8-α铰链区、至少一个cd8-α或cd28跨膜域、至少一个cd28、4-ibb、icos共刺激结构域和至少一个cd3-ζ细胞内激活域,其中所述单域抗体与car细胞外铰链区连接。
[0250]
还更具体地,本发明描述了一种用于治疗癌症的方法,其中所述癌症的癌细胞在其表面上表达至少一种选自globo h、gb3、gb4和gb5的球系列聚糖,所述方法包括向患有所述癌症的患者施用治疗有效量的球系列聚糖结合多肽,所述球系列聚糖结合多肽包含至少一种特异性结合至少一种选自globo h、gb3、gb4和gb5的球系列聚糖的单域抗体,并且还包含至少一个car细胞外铰链区、至少一个car跨膜域、至少一个globo系列聚糖结合多肽,至少一个car共刺激结构域和至少一个car胞内激活结构域,其中所述单域抗体与car胞外铰链区连接,其中所述癌症选自脑癌、肝癌、胆管癌、肾癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、小细胞肺癌、卵巢癌、宫颈癌、食道癌、胃癌、胰腺癌和结肠直肠癌。
[0251]
此外,本发明描述了一种用于治疗癌症的方法,其中所述癌症的癌细胞在其表面上表达至少一种选自globo h、gb3、gb4和gb5的球系列聚糖,所述方法包括向患有所述癌症的患者施用治疗有效量的球系列聚糖结合多肽,所述球系列聚糖结合多肽包含至少一种特异性结合至少一种选自globo h、gb3、gb4和gb5的球系列聚糖的单域抗体,并且还包含至少一个car细胞外铰链区、至少一个car跨膜域、至少一个car共刺激结构域和至少一个car细胞内激活域,其中所述单域抗体与car细胞外铰链区连接,并且还包含至少一个细胞外cd8-α铰链区、至少一个cd8-α或cd28跨膜域、至少一个cd28、4-ibb、icos共刺激结构域和至少一个cd3-ζ细胞内激活域,其中所述单域抗体与car细胞外铰链区连接,其中所述癌症选自脑癌、肝癌、胆管癌、肾癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、小细胞肺癌、卵巢癌、宫颈癌、食道癌、胃癌、胰腺癌和结肠直肠癌。
[0252]
另一个实施方案描述了一种诊断癌症的方法,所述癌症的特征在于癌细胞在其表面上表达至少一种选自globo h、gb3、gb4和gb5的球系列聚糖,所述方法包括以下步骤:
[0253]
a)将样品与如本文所公开的特异性结合至少一种选自globo h、gb3、gb4和gb5的球系列聚糖的多肽接触,
[0254]
b)检测所述多肽与所述样品的结合,
[0255]
c)将步骤b)中检测到的结合与标准进行比较,其中相对于所述样品的结合差异是诊断癌症的特征,其特征在于,所述癌症的癌细胞在其表面上表达选自globo h、gb3、gb4和
gb5的至少一种球系列聚糖。
[0256]“病症(disorder)”是将受益于用本文所述的物质/分子或方法治疗的任何病况。
[0257]“细胞增殖性病症”和“增殖性病症”是指与一定程度的异常细胞增殖相关的病症,例如癌症。
[0258]“癌症”和“癌变(cancerous)”是指或描述哺乳动物中通常以细胞增殖性病症为典型特征的生理状态。癌症通常包括但不限于上皮癌、淋巴瘤(例如霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤)、母细胞瘤、肉瘤和白血病。癌症的更具体实例可包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝瘤、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌(liver cancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、白血病和其他淋巴组织增生性病症,以及各种类型的头颈癌。
[0259]“肿瘤”是指所有肿瘤细胞生长和增殖,无论是恶性的还是良性的,以及所有癌前和癌变的细胞和组织。如本文所述,术语“癌症”,“癌变”、“细胞增殖性病症”、“增殖性病症”和“肿瘤”不是相互排斥的。
[0260]“转移”是指癌症和/或肿瘤从其原发部位扩散到个体体内的其他位置。
[0261]“治疗(treatment)”、“治疗(treat)”或“治疗(treating)”是指试图改变所治疗个体的病症的自然过程的临床干预,并且可以用于预防或在临床病理过程中进行。期望的治疗结果包括但不限于预防病症的发生或复发、缓解症状、减轻病症的任何直接或间接病理后果、预防转移、降低进展速率、改善或缓和疾病状态以及缓解或改善预后。诸如,治疗可包括向受试者施用治疗有效量的包含抗globo h抗体的药物制剂以延迟癌症的发展或减缓癌症的进展,其中所述癌症的癌细胞在其表面上表达至少一种选自globo h、gb3、gb4和gb5的球系列聚糖。
[0262]“药物制剂”是指使活性成分的生物活性有效的形式的制剂,并且其不含对施用制剂的受试者有毒的额外的组分。
[0263]“药学上可接受的载体”是指药物制剂中除活性成分之外的成分,其对其施用的受试者无毒。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
[0264]“治疗有效量”是指实现所需治疗或预防结果,例如治疗或预防受试者的疾病或病症的活性成分或药剂(例如药物制剂)的量。在癌症的情况下,治疗剂的治疗有效量是减少癌细胞数量的量;减小原发性肿瘤大小;抑制(即在一定程度上减缓并优选停止)癌细胞浸润到外周器官中;抑制(即在一定程度上减缓并优选停止)肿瘤转移;在一定程度上抑制肿瘤生长;和/或在一定程度上缓解与癌症相关的一种或多种症状。在药物可以阻止生长和/或杀死现有癌细胞的程度上,它可具有细胞抑制性和/或细胞毒性。对于癌症治疗,可以通过例如存活持续时间、疾病进展时间(ttp)、响应率(rr)、响应持续时间,和/或生活质量来评估体内疗效。
[0265]“个体”或“受试者”是指哺乳动物,包括但不限于家养动物(例如牛、羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物如猴)、兔和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。
[0266]“抗癌治疗剂”是指用于治疗癌症的药剂。示例性抗癌治疗剂包括但不限于化学治疗剂、生长抑制剂、细胞毒性剂、放射疗法中使用的药剂、抗血管生成剂、凋亡剂、抗微管蛋白剂和其它治疗癌症的药剂、抗cd20抗体、血小板衍生生长因子抑制剂、cox-2抑制剂、干扰
素、细胞因子、结合一种或多种靶标(例如pdgfr-β、april、bcma受体、trail/apo2)的拮抗剂、其它生物活性剂和有机化学剂及其组合。
[0267]
单域抗体用于诊断癌症的用途
[0268]
本发明的另一个实施方案是用于检测细胞的诊断试剂盒,所述细胞在其表面上表达选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖,所述诊断试剂盒包含球系列聚糖结合多肽,所述球系列聚糖结合多肽包含特异性结合选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖的至少一种单域抗体,其中所述单域抗体是天然缺乏轻链且天然缺乏恒定区1的重链抗体的可变结构域,或所述可变结构域的变体。除了与选自globo h、gb3、gb4和gb5的一种球系列聚糖结合的所述多肽之外,试剂盒还可以包含标记和/或检测和/或定量抗原结合细胞所需的试剂。
[0269]
稍加改写(sightly,reworded),本发明还涉及诊断试剂盒,其包含球系列聚糖结合多肽,所述球系列聚糖结合多肽包含至少一种单域抗体,所述单域抗体特异性结合至少一种选自globo h、gb3、gb4和gb5的球系列聚糖,或所述可变结构域的变体,所述诊断试剂盒用于筛选癌症,所述癌症的特征在于细胞在其表面上表达至少一种选自globo h、gb3、gb4和gb5的球系列聚糖。
[0270]
本发明的另一个方面是诊断试剂盒,其包含球系列聚糖结合多肽,所述球系列聚糖结合多肽包含至少一种单域抗体,所述单域抗体特异性结合至少一种选自globo h、gb3、gb4和gb5的球系列聚糖,其中所述单域抗体是天然缺乏轻链且天然缺乏恒定区1的重链抗体的可变结构域,或所述可变结构域的变体,其中所述至少一种单域抗体通过替换位于fr1中的位置1、5、11、28和30,fr2中的位置44和45,fr3中的位置74、75、76、83、84、93和94,fr4中的位置104和108位的一个或多个氨基酸残基而人源化,用于筛选以在其细胞表面上表达选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖为特征的癌症。
[0271]
如上所述,当与作为可检测标记的效应分子连接时,本发明的单域抗体可以用于诊断目的。
[0272]
合适的可检测标记和用于附接、使用和检测它们的技术对于本领域技术人员来说是清楚的,并且例如包括但不限于荧光分子(例如荧光素、异硫氰酸酯、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛和荧光胺以及荧光金属,例如eu或来自镧系元素的其他金属)、磷光分子、化学发光分子或生物发光分子(例如鲁米诺、异鲁米诺、热吖啶酯、咪唑、吖啶盐、草酸酯、二氧乙烷或gfp及其类似物)、放射性同位素、金属、金属螯合物或金属阳离子,或其他特别适合在体内、体外使用或原位诊断和成像的金属或金属阳离子,以及发色团和酶(如苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-v-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、生物素-抗生物素蛋白过氧化物酶(biotinavidin peroxidase)、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-vi磷酸脱氢酶、糖化酶和乙酰胆碱酯酶)。
[0273]
因此,本发明的另一个实施方案是诊断试剂盒,其包含特异性结合球系列聚糖的多肽,所述多肽包含至少一种单域抗体,或所述可变结构域的变体,其中所述单域抗体结合至少一种选自globo h、gb3、gb4和gb5的球系列聚糖,并且还包含至少一种与所述单域抗体连接的效应分子,所述诊断试剂盒用于筛选癌症,所述癌症的特征在于细胞在其表面上表达至少一种选自globo h、gb3、gb4和gb5的球系列聚糖,其中所述效应分子选自荧光分子、
磷光分子、化学发光分子、生物发光分子、放射性同位素和发色团。
[0274]
含有多聚体单域抗体的多肽。
[0275]
本发明的一个实施方案是特异性结合球系列聚糖的多肽,其包含至少一种单域抗体,其中所述单域抗体是天然缺乏轻链且天然缺乏恒定区1的重链抗体的可变结构域,或所属可变结构域的变体,其中所述单域抗体结合选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖,并且其中结合选自globo h、gb3、gb4和gb5的至少一种球系列聚糖的单域抗体的数目为至少两个。
[0276]
包含至少两个单域抗体的此类多肽具有对靶点的更高亲和力的优点,如sdab46三聚体所示(图23)。
[0277]
本发明的一个特定实施方案是特异性结合球系列聚糖的多肽,其包含至少一种单域抗体,其中所述单域抗体是天然缺乏轻链且天然缺乏恒定区1的重链抗体的可变结构域,或所述可变结构域的变体,其中所述单域抗体结合至少一种选自globo h、gb3、gb4和gb5的球系列聚糖,其中结合至少一种选自globo h、gb3、gb4和gb5的球系列聚糖的单域抗体的数目为至少两个,并且其中所述两个或更多个单域抗体在序列上是不同的。
[0278]
本发明的一个更具体的实施方案是特异性结合球系列聚糖的多肽,其包含至少一种单域抗体,所述单域抗体是天然缺乏轻链且天然缺乏恒定区1的重链抗体的可变结构域,或所述可变结构域的变体,其中所述单域抗体结合至少一种选自globo h、gb3、gb4和gb5的球系列聚糖,其中结合至少一种选自globo h、gb3、gb4和gb5的球系列聚糖的单域抗体的数目为至少两个,并且其中所述两个或更多个单域抗体在序列上是相同的。
[0279]
本发明的一个更具体的实施方案是特异性结合包含至少一种单域抗体的球系列聚糖的多肽,其中所述单域抗体是天然缺乏轻链且天然缺乏恒定区1的重链抗体的可变结构域,或所述可变结构域的变体,其中所述单域抗体结合至少一种选自globo h、gb3、gb4和gb5的球系列聚糖,其中结合至少一种选自globo h、gb3、gb4和gb5的球系列聚糖的单域抗体的数目为3,并且其中所述两种或更多种单域抗体在序列上相同。
[0280]
本发明的另一个更具体的实施方案是特异性结合包含至少一个单域抗体的球系列聚糖的多肽,其中所述单域抗体是天然缺乏轻链且天然缺乏恒定区1的重链抗体的可变结构域,或所述可变结构域的变体,其中所述单域抗体结合至少一种选自globo h、gb3、gb4和gb5的球系列聚糖,其中结合至少一种选自globo h、gb3、gb4和gb5的球系列聚糖的单域抗体的数目为三个,其中所述单域抗体与seq id no 5具有至少90%的序列同一性。
[0281]
可以使用本领域已知的方法或任何未来的方法来连接单域抗体,以形成本文公开的特异性结合球系列聚糖并且包含一个以上单域抗体的任何多肽。单域抗体可以非共价地(例如使用链霉抗生素蛋白/生物素组合、抗体/标签组合)或共价地连接。它们也可以通过氨基酸残基与有机衍生剂反应的化学交联融合。
[0282]
或者,单域抗体可以在dna水平上遗传融合。连接单域抗体的一种方式是通过遗传途径,直接或通过肽接头连接单域抗体编码序列。例如,单域抗体的c-端可以与下一个单域抗体的n-端连接。这种连接模式可以扩展,以便连接另外的单域抗体,用于构建和产生三、四等功能结构。此外,单域抗体可以通过谷胱甘肽s-转移酶(gst)连接以形成二聚体(例如,如smith db,johnson ks,gene 1988;tudyka t,skerra a,protein sci 2008中所述),也可以使用来自结核分枝杆菌mtdod的支架蛋白十二烷酸连接以形成十二聚体(bordeaux等
人,sci rep 2020;ca3076791 a1)。
附图说明
[0283]
图1:用于开发特异性结合球系列聚糖的本发明的羊驼sdabs的程序方案。
[0284]
图2:球系列聚糖globoh、gb3、gb4、gb5、ssea3及ssea4的结构。
[0285]
图3:电泳印迹以评估globoh上crm 197载体蛋白的负载。
[0286]
图4:血清抗体与天然球系列聚糖的结合。第0周(红色)和第7周(蓝色,最后一周)的免疫羊驼血清的流式细胞术结果表明能够结合表达球系列聚糖的乳腺癌细胞(mcf-7)的抗体的产生。
[0287]
图5:聚糖阵列的打印样式。将聚糖一式三份打印在环氧树脂涂覆的载玻片上。每种颜色显示一种特定的聚糖类型。对照组和寡糖组在网格旁边指示,并且包括半乳糖、6xhis标记的sdab、globo h和不同类型的糖基磷脂酰肌醇(gpis)。图例:对照组;pb,缓冲剂;fs8,半乳糖;c6,鼠李糖;2his标签,6xhis特异性抗体的sdab对照(atto 6479);297,fuc(a1-2)gal(b1-3)galnac(b1-3)gal(a1-4)gal(b1-4)glc(b1-1)氨基戊醇-globo h;221,glc(a1-4)galnac(b1-4)[man-6-petn(a1-2)man(a1-6)man(a1-4)glcn(a1-6)ino(1-p)硫代磷酸己醇-gpi;222,galnac(b1-4)[man-6-petn(a1-2)man(a1-6)]man(a1-4)glcn(a1-6)ino(1-p)硫代磷酸己醇-gpi 29(t.gondii);223,galnac(b1-4)[man-6-petn(a1-2)man(a1-6)]man-2-petn(a1-4)glcn(a1-6)ino(1-p)硫代磷酸己醇-gpi 32(哺乳动物);224,galnac(b1-4)[man(a1-2)man(a1-6)]man(a1-4)glcn(a1-6)ino(1-p)硫代磷酸己醇-gpi 37(非天然的);228,glcn(a1-6)ino(1-p)硫代磷酸己醇-gpi假二糖;225,glc(a1-4)galnac(b1-4)man(a1-1)氨基戊醇-gpi亚结构;226,glc(a1-4)galnac(b1-4)[man(a1-2)man(a1-1)氨基戊醇-gpi亚结构;227,glc(a1-4)galnac(b1-4)[man-6-petn(a1-2)man(a1-6)]man(a1-1)氨基戊醇-gpi亚结构;172,gal(b1-3)galnac(b1-3)gal(a1-4)gal(b1-4)glc(b1-1)氨基戊醇-gb5(氨基连接剂(aminolinker));174,gal(a1-4)gal(b1-4)glc(b1-1)氨基戊醇-gb3(氨基连接剂);371,glcnac(b1-3)gal(a1-4)gal(b1-4)glc(b1-1)氨基戊醇;11,gal(b1-4)glc(b1-1)氨基己醇-乳糖(氨基连接剂);位置d2-d10、e3、f4-f6表示原料化合物在96孔板上的位置,其被打印机器人用于个性化每个样品的位置。
[0288]
图6:聚糖阵列结果的量化,其显示免疫的羊驼对合成的globo h和gb5的免疫应答每周逐渐增加。
[0289]
图7:用于血清检查的第7周(最后一周)的聚糖阵列图像,其显示血清抗体与不同球家族合成聚糖的特异性结合(图示结构)。黑色星号表示对照聚糖结构。
[0290]
图8:通过聚糖阵列分析亲和洗脱抗体的globo hglobo h结合。图形条表示从空珠粒(红色)和globo h包被珠粒(蓝色)洗脱的抗体的平均荧光强度。结果显示亲和纯化抗体的特异性,然后将其进行凝胶电泳以分离sdab。
[0291]
图9:亲和纯化抗体的凝胶电泳分离。绿色箭头表示从凝胶中提取的13kda sdabs(vhh),用于进一步的胰蛋白酶消化和质谱分析。
[0292]
图10:所选单域抗体序列在大肠杆菌中的重组表达。a)样品的凝胶电穿孔,该样品是在被工程化以表达sdab46的arctic大肠杆菌的细胞提取物进行不同的纯化
和清洁步骤之后预提取的样品。arctic细胞的斑块(p)和裂解物(l)、流过物(ft)、洗涤级分1和2(w1和w2),镍-nta之后的洗脱液(e)和最终的sdab产物(sdab)。箭头指示最终清洁步骤和高纯度sdab样品的存在。b)下图显示sdab46的s200尺寸排阻色谱,其指示了与14kda蛋白质相关的高产率(50mau)的表达和洗脱体积(箭头)。
[0293]
图11-13:纯化的sdabs与合成的globo h的结合。将合成的globo h聚糖固定在c1表面等离子体共振芯片上,并测试不同的sdabs的结合。在测试的不同sdabs中,显示了sdab37(图11)、sdab46(图12)和sdab62(图13)。sdab46显示平均亲和力为54nm的最高值。
[0294]
图14:纯化的sdabs与表达天然球家族聚糖的癌细胞的结合。进行流式细胞术(facs)分析,以测试不同sdabs与表达球家族聚糖的癌细胞(mcf-7)的结合(上图)。使用共聚焦显微镜进一步验证阳性结果(下图)。使用市售的抗globo h抗体vk9作为阳性对照,使用单独的二抗来排除二抗的非特异性结合(右下图)。
[0295]
图15:显示表达和纯化的sdabs与mcf-7癌细胞的结合水平的facs结果的图示。
[0296]
图16:通过facs结合试验测定的不同球系列聚糖的结合特异性。sdabs与不同癌细胞的特异性结合由于所分析的癌细胞表面上球家族聚糖的表达水平的差异而不同。在表达不同球系列聚糖的癌细胞系上测试sdab62的特异性。结果表明由于hek293肾细胞上不同的gb3表达,导致结合群体大小(黑色曲线)存在差异。
[0297]
图17:结合globo h的sdab的纯化。sdab在shuffle 细胞中表达,其通过弗氏细胞压碎器裂解来提取,并通过ni
2+-nta亲和色谱和尺寸排阻色谱(sec)纯化。a)在纯化sdab46期间采集的样品的sds-page。凝胶用pageblue蛋白染色溶液染色。m,pageruler预染色蛋白梯10-180kda。ft,流过物。w1,洗涤1级分。w2,洗涤2级分。b)sec色谱图显示280nm处检测蛋白质洗脱的uv吸光度。hiload 16/600superdex 75(s75)预备级(prep grade)柱与fplc系统一起使用。星号(*)表示用于sds-page的级分。
[0298]
图18:通过饱和转移差异核磁共振(std nmr)分析的globo-h与sdab46的结合表位和结合构象。a)反映sdab46与globo-h的相互作用的std nmr实验。从上到下:(1)globo-h的参考光谱。显示磁化传递的隔离信号以粗体突出显示。(2)在60μm sdab46存在下4mm globo-h的std光谱。(3)在110μm sdab46存在下,4mm gb5的std光谱。(4)4mm globo-h的std光谱。未抑制残留水信号,以允许观察fuc和gal3异头质子。b)来自4秒的单一饱和时间的与sdab46结合的globo-h的结合表位。由于信号重叠,无法提供未指示质子的std扩增因子。std核磁共振实验在600mhz和277k下获得。xxx=100-67%;xx=67-33%;x=33-0%;c)在600mhz和298k条件下,globo-h(含和不含sdab46)的noe累积率与混合时间(ms)的关系。曲线表示吡喃糖(fuc-ch3/fuc-h5)内和吡喃糖(fuc-h1/gal5-h2)间部分的连接性。sdab与碳水化合物的比例为1:16.4,i)globo-h+sdab46,fuc-ch3/fuc-h5;ii):globo-h+sdab46,fuc-h1/gal5-h2;iii)无globo-h,fuc-ch3/fuc-h5,iv)无globo-h,fuc-h1/gal5-h2。
[0299]
图19:三价sdab46融合蛋白的产生和纯化,a)分子克隆策略的示意图。进行突变pcr以插入终止密码子(*),以排除裂解肽tachy的表达。b)pcr产物(左)和限制性内切酶消化的产物(右)的琼脂糖凝胶电泳,l,1kb的dna梯状条带。c)sdab46三聚体结构在shuffle细胞中的表达测试。显示了iptg诱导前(pre)后(post)细菌斑块的sds-page。d)sdab46三聚体结构的溶解度测试。细胞通过超声裂解后的斑块和裂解物的sds-page。e)-f)使用fplc对
sdab46三聚体包涵体进行ni
2+-nta纯化。色谱图显示在e)中,输入、流过物(ft)和洗脱级分1-4的sds-page凝胶图像显示在f)中。m=pageruler预染色的蛋白质阶梯10-180kda(m=pageruler prestained protein ladder 10-180kda)。
[0300]
图20:sdab46单体和sdab46三聚体与癌细胞的结合。a)-c)imr5神经母细胞瘤细胞(阴性对照)和mcf7乳腺癌细胞分别用sdab46单体、sdab46三聚体或globo h特异性商业抗体vk9染色,然后用抗-6xhis-af647或抗-igg-atto635二抗染色。a)流式细胞术直方图显示荧光标记的imr5细胞(上图)和mcf7细胞(下图)的频率。仅有二抗的对照在左侧以灰色显示。左边的图是用vk9抗体获得的,右边的图是用sdab46获得的。数据代表三个独立实验,每个实验分别重复两遍或三次,b)基于a)中指示的门控(gates)的阳性细胞的频率,c)mcf7(左)和imr5(右)的共聚焦激光扫描显微镜检查。红色:检测由抗-6xhis-af647或抗-igg-atto635二抗产生的信号。细胞核用dapi(蓝色通道)染色。tm光,透射光。白色比例尺,20μm。
[0301]
包括以下实施例以说明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当理解,以下实施例中公开的技术代表发明人发现的在本发明的实践中发挥良好作用的技术,因此可以被视为构成其实践的优选模式。然而,根据本发明,本领域技术人员应当理解,在不脱离本发明的范围的情况下,可以对所公开的具体实施方案进行许多改变,并且仍然获得相同或相似的结果。
[0302]
鉴于本说明书,本发明的各个方面的进一步修改和替代实施例对于本领域技术人员将是显而易见的。因此,本说明书仅被解释为说明性的,并且是为了教导本领域技术人员实施本发明的一般方式。应当理解,本文所示和描述的本发明的形式将被视为实施例的示例。可以替代本文所示和所述的元件和材料,部分和过程可以颠倒,并且本发明的某些特征可以独立地使用,所有这些对于本领域技术人员在受益于该

技术实现要素:
之后将是显而易见的。在不脱离如下述权利要求中描述的本发明的范围的情况下,可以对本文描述的元件进行改变。
实施例
[0303]
方法:
[0304]
用于羊驼免疫的crm197-硫醇globoh糖缀合物的制备。
[0305]
用0.6当量(eq.)树脂结合的三(2-羧乙基)膦(tcep)在120μl水中以1500rpm还原1mg经硫醇连接剂官能化的globoh 1小时。通过0.22μm针头式过滤器过滤除去树脂,并将过滤器用50μl水洗涤五次。通过薄层色谱和糖染色分析最后一次的洗涤液,以确保过滤器上没有残留globoh。合并滤液和所有洗涤馏分并冷冻干燥。将100当量的琥珀酰亚胺基3-(溴乙酰氨基)丙酸酯溶于30μl二甲基甲酰胺(dmf)中,在搅拌的同时,将其滴加至于750μl耦合缓冲液(0.1mna2hpo4/nah2po
4 ph 7.4)中的1mg crm197的溶液。1小时后,用350μl水在平衡的0.5ml离心过滤器(amicon ultra,mwco=10k)上以10,000rpm洗涤溶液4次,每次8分钟,在最后一次洗涤前,收集10μl等分试样用于质谱分析,随后,将溶液用350μl缀合缓冲液(0.1m na2hpo4/nah2po4于ph 8.0)洗涤,并且通过用倒置的所述过滤器(with the filter upside down)以1000rpm离心2分钟收集到新管中。将冻干的还原的globoh在缀合缓冲液(ph 8)中进行恢复,并加入到蛋白质溶液中。该反应溶液缓慢搅拌24小时。
[0306]
第二天,用350μl水洗涤反应溶液三次。在最后一次洗涤之前,收集10μl等分试样
用于质谱分析。随后,将溶液用350μl缀合缓冲液(ph 8)洗涤溶液,并将150当量的半胱氨酸直接添加到离心过滤器上。孵育1h后,用350μl水洗涤反应溶液三次。在最后一次洗涤之前,收集10μl等分试样用于质谱分析。最后,用350μl无菌磷酸盐缓冲盐水洗涤溶液,并且通过用倒置的所述过滤器以1000rpm离心2分钟收集到新管中。在对整个缀合过程中收集的样品进行质谱分析后,通过比较缀合之前和之后的质量峰来确定crm 197的globoh负载(如下所示)(图3)。
[0307][0308]
羊驼免疫
[0309]
用在磷酸盐缓冲盐水中含有15μg globoh/剂量的crm197-globoh糖缀合物免疫成年雌性羊驼。使用22g针沿脖颈底部皮下注射羊驼。每周免疫接种,总共6轮,包括第3次和第4次注射之间的两周间隔,使得疫苗接种天数为:0/7/14/28/35/42。在最后一次免疫后9天(第51天)进行全血提取。
[0310]
血清和外周血单核细胞(pbmcs)的分离
[0311]
将用于血清分离的全血(150ml)被收集到50ml的多个试管中,并在室温下孵育1小时,然后以2000g/10分钟/rt离心。将血清等分到无菌15ml试管(每个7.5ml)中,并使用液氮快速冷冻,以便在-80℃下进一步储存。
[0312]
对于pbmc分离,将100ml全血被收集到10ml edta涂覆的多个试管(bd vacutainer
tm
)中并倒置10次。使用uni-sepmaxi u16(novamed)通过在1000g/30分钟/rt下不间断地离心分离来自未稀释的全血的pbmc。将pbmc层分离到无菌50ml试管中,并用pbs通过在400g/10分钟/4℃下离心3轮进行洗涤。最后的25ml离心后溶解在14ml rnalater
tm
中。将细胞以每小瓶5*107/ml pbmc,分到1.5ml不含rna酶的试管中,并在-80℃下在缓慢冷冻容器(mr.frosty
tm
)中储存24小时,然后在-80℃下储存。
[0313]
聚糖阵列以测定血清抗体与合成球系列聚糖的结合。
[0314]
在实验室中,使用0.2mm合成聚糖和250μg/ml his标记的sdab作为对照,将聚糖微阵列打印到环氧树脂涂覆的载玻片上。每个载玻片含有重复的聚糖网格,每个网格含有16个不同聚糖点。打印样式如图5所示。将载玻片在37℃下封闭在补充有1%bsa的hepes缓冲液(10mm hepes(ph 7.4),1mm cacl2,1mm mgcl2)中1小时。同时,将相同缓冲液中sdab为4、10和20μg/ml的50μl溶液与1:5000稀释的6xhis特异性抗体(atto647)在30℃下在黑暗中孵育。封闭的载玻片用不含bsa的hepes缓冲液清洗一次,用ddh2o清洗一次。为了除去任何液体,将载玻片以300g下离心3分钟。将载玻片组装到微孔板支架上,以便使用不同的sdab对
单个网格进行单独染色。用移液管将sdab/抗体混合物移至孔中,并在30℃下在黑暗中的加湿室中使sdab-聚糖结合1小时。这些孔用添加有0.05%吐温的hepes缓冲液洗涤三次,用ddh2o洗涤一次,在离心干燥后使用聚糖阵列扫描仪axon gene4300a直接扫描。使用genepix pro7分析结合。
[0315]
vhh cdna文库构建及高通量测序
[0316]
使用rneasy minikit(qiagen)从羊驼pbmc分离rna。使用oligo-dt引物和superscriptii逆转录酶试剂盒(invitrogen)产生cdna。在两步巢式pcr中,从cdna特异性扩增出vhh可变区。在第一步中,使用引物call001:gtcctggctgctcttctacaagg(前导序列特异性,seq id no132)和call002:ggtacgtgctgttgaactgttcc(ch2特异性,seq id no 133)。在凝胶纯化和大小选择600bp区域之后使用minelute cleanup(qiagen),使用引物vhh_back:gatgtgcagctgcaggagtctggrggagg(seq id no 134)和vhh_for:ggactagtgcggccgctggagacggtgacctgg(seq id no 135)进行第二次pcr操作,来提取vhh区域,然后凝胶提取400bp条带。
[0317]
按照truseq方案,在没有剪切的情况下创建illumina测序文库,即从末端修复步骤开始。在illumina miseq仪器上使用2x250bp化学组成对每个文库进行测序,每个样品产生6.9/660万个读取对。bbmerge(https://github.com/biolnfotools/bbmap/blob/master/sh/bbme rge.sh)用于重叠正向和反向读取,以重建原始pcr片段。
[0318]
亲和纯化globoh特异性经典的和仅有重链的抗体以从羊驼血清中分离globoh结合vhh片段
[0319]
合成globoh-偶联珠粒的制备。
[0320]
用0.6当量的树脂结合tcep在120μl水中以1500rpm的转速还原1mg经硫醇连接剂官能化的globoh,在室温下持续1h。通过0.22μm针头式过滤器过滤除去树脂,并用50μl水洗涤过滤器五次。通过薄层色谱和糖染色分析最后一次洗涤液,以确保过滤器上没有残留globoh。合并滤液和所有洗涤级分并冷冻干燥。根据制造商的说明,将还原的globoh与1ml琼脂糖珠sulfo偶联树脂(赛默飞世尔科技公司(thermo fisher scientific))结合。
[0321]
使用蛋白a/g珠粒分离iggs和重链抗体。
[0322]
为了分离常规iggs和仅有重链的抗体,将羊驼血清样品解冻,并用67.5ml于ph=7的20mm磷酸钠稀释7.5ml等分试样,并使用0.22mm过滤器过滤。用ph=7的20mm磷酸钠预洗涤3ml蛋白a/g磁珠(pierce)。此后,将这些样品在室温下旋转孵育1小时。收集流过物后,用100ml于ph=7的20mm磷酸钠洗涤珠粒。使用39ml于ph=2.75的100mm柠檬酸将结合的抗体洗脱到的50ml试管中,试管中预先填充有用于中和洗脱的抗体的11ml ph=8.8的1.5m tris。将洗脱样品合并,在室温下使用amicon 10kda进行浓缩,并用5l ph=7.4的20mm磷酸钠透析过夜。
[0323]
使用合成的聚糖偶联珠粒分离globoh特异性抗体。
[0324]
globoh-偶联珠粒/空珠粒对照柱用水洗涤三次,然后用ph=7的20mm磷酸钠洗涤。使用a/g珠粒获得的透析抗体样品均匀分布在空的和globoh偶联珠粒柱(经用透析缓冲液预平衡的)之间,并在室温下旋转1小时。然后在室温下将来自每个柱的流过物在柱之间再额外切换1小时。使用ph=7的20mm磷酸钠和增加的nacl浓度(100mm/500mm/1m/3m)进行从
两个柱中的洗脱,然后用调节至ph5.2的20mm nah2po4进行最终洗涤步骤。使用amicon 10kd浓缩来自两个柱的每个洗涤步骤的75ml体积的洗涤液,并在4℃下用木瓜蛋白酶消化缓冲液(20mm磷酸钠/10mm edta ph=7.1)透析过夜。
[0325]
木瓜蛋白酶切割globoh特异性抗体
[0326]
在添加5mm l-半胱氨酸(sigma-aldrich)的情况下,将20mm磷酸钠/10mm edta缓冲液中亲和纯化的抗体与10-20μl木瓜蛋白酶固定化珠粒(thermo fisher scientific)在37c/300rpm下孵育长达90分钟。然后将混合物离心,并将上清液加载到4-20%丙烯酰胺sds-page凝胶上,用于提取对应于vhh结构域的13kda条带(图9)。
[0327]
亲和纯化vhh片段的质谱分析。
[0328]
从凝胶中切下来自sds-page分离的vhh片段,并用胰蛋白酶消化。从凝胶中提取所得胰蛋白酶分解形成的肽,并使用c18stagetips脱盐。在与ultimate 3000rslcano系统(dionex,thermo fisher scientific)在线偶联的orbitrap fusiontm lumostm tribridtm质谱仪(thermo fisher scientific)上进行lc-ms/ms分析。洗脱的肽通过简易喷雾源(easy-spray source)(thermo fisher scientific)离子化。流动相a由水、0.1%v/v甲酸组成,流动相b由80%v/v乙腈和0.1%v/v甲酸组成。ms数据是使用具有ms1和ms2光谱高分辨率的lumos仪器,在以最高速度选项的数据相关模式下获取的。hcd用于片段化。使用ms convert生成ms数据的峰列表。使用实验室改进的mascot搜索引擎(matrix science)与llama magic v1.0(https://github.com/fenyolab/llama-magic)的本地安装和默认参数的组合进行针对高通量cdna测序文库的数据库搜索。
[0329]
结合球系列聚糖的sdab的表达
[0330]
细菌转化:用于转化的质粒载体(pet-22(+)b)含有sdab序列,该序列融合了c-端组氨酸标签、iptg诱导型调节系统、氨苄青霉素抗性和pelb周质信号序列。根据制造商的方案,使用热休克转化,将载体转化到arctic(de3)大肠杆菌感受态细胞中。将20ng dna加入到20-40μl细菌中。在热休克后,随后在37℃下在soc培养基中孵育1小时,将转化的细胞铺展在lb琼脂平板上,该lb琼脂平板含有针对arctic细胞的庆大霉素抗性和针对携带所需sdab序列的表达质粒的氨苄青霉素抗性。将板在37℃下孵育过夜。
[0331]
菌落pcr:在菌落pcr中测试转化细胞的单菌落的转化效率。使用2x pcr master mix、0.1μm的相应的正向和反向引物和10μl无核酸酶水,在冰上的pcr管中反应,制备pcr反应混合物。用10μl移液管尖采集每个转化方案的三个克隆,直接移液并重悬于反应混合物中。根据制造商推荐的热循环条件进行pcr反应,如表2所示。将2μl的6x dna加载染料加入pcr产物中并在1%琼脂糖凝胶上分析。
[0332]
表2:菌落pcr的热循环条件
[0333][0334]
细菌的储存:将成功转化的细胞的菌落接种并在添加50μg/ml氨苄青霉素和20μg/ml庆大霉素的5ml lb培养基中,在37℃下在振荡培养箱(250rpm)中生长过夜。第二天早晨,将750μl过夜培养物与750μl 50%甘油混合,并将原液储存在-80℃中。
[0335]
源自arcticexpress细胞的globoh sdabs的表达和纯化:通过在转化后将阳性克隆接种在lb琼脂平板上,或通过在补充有50μg/ml氨苄青霉素和20μg/ml庆大霉素的lb培养基中接种冷冻原液,来开始过夜培养。将起始物在37℃振荡器(250rpm)中孵育过夜。第二天早晨,将150ml或1l主要培养物用50μg/ml氨苄青霉素传代培养,并将过夜培养物以1:100稀释。将这些培养物在30℃下以250rpm振荡孵育直至od600达到0.6。将500μl每种培养物移液到干净的微量离心管中作为非诱导样品进行表达测试。将培养物转移到250rpm的12℃振荡器中,用0.4mm iptg诱导并孵育24小时。在孵育时间结束后,对于每种培养物,另取一个500μl样品作为诱导样品。通过在4℃下以6000g离心20分钟收获细菌,并将斑粒状沉淀物储存在-20℃条件下。为了测试表达效率,用lb培养基稀释未诱导和诱导的样品至1ml体积,od600为0.1。将这些悬浮液以14000g离心5分钟。将斑粒状沉淀物溶解于20μl pbs和5μl 5x sds样品缓冲液中,并通过sds-page分析样品。
[0336]
arctic细胞的裂解和globoh sdab的纯化:sdab质粒中的pelb信号序列诱导表达的sdab分泌到大肠杆菌周质中。为了获得大肠杆菌细胞的周质部分,仅需要破坏外膜。将来自150ml培养物的斑粒状沉淀物解冻,并重悬于补充有蛋白酶抑制剂混合物的300μlpbs中。在使用干冰和37℃水浴进行六次冷冻和解冻循环后,将样品在3200g和4℃下离心1小时。裂解物直接用于mcf-7细胞上的结合测定。将来自1l培养物的斑粒状沉淀物解冻,并重悬于含有蛋白酶抑制剂的20ml磷酸钠样品缓冲液中。如前所述进行冷冻和解冻循环,并将20单位的dna酶i加入样品中,然后在4℃下以42000g离心20分钟。裂解物直接用于进一步纯化。
[0337]
镍-nta亲和色谱:为了亲和纯化,将1ml镍-nta珠粒装入色谱柱中,用两个柱体积(cv)的ddh2o洗涤,并用两个cv的样品缓冲液平衡。从1l大肠杆菌arctic细胞获得的裂解物被添加到珠粒中并在室温下旋转孵育90分钟。然后,收集流过物,并用1cv的样品缓冲液、2cv的洗涤缓冲液1和2cv的洗涤缓冲液2洗涤珠粒。用2cv的洗脱缓冲液从镍珠上洗脱sdabs。从所有纯化和洗涤步骤中提取样品,用于随后的sds-page分析。将洗脱液在4℃下以3200g在具有3kda尺寸排阻极限的ultra离心过滤装置单元中浓缩,并且在
该过程期间通过用nanodrop
tm
测量280nm处的吸光度来确定浓度。如果浓度不超过2.5mg/ml,则将洗脱液浓缩至小于2ml的最终体积,并使用截留分子量为3500的snakeskin
tm
透析管在4℃下在pbs(ph 7.4)中透析过夜。
[0338]
sds-page(图10a)以验证纯化程序
[0339]
为了验证sdab的纯化过程,在该期间采集以下样品:冷冻和解冻样品离心后的arctic细胞的斑粒状沉淀物(p)和裂解物(l)、流过物(ft)、洗涤级分1和2(w1和w2)和镍-nta后的洗脱液(e),以及最终的sdab产物(sdab)和/或在fplc色谱图中显示的其他蛋白质峰。用5xsds样品缓冲液制备样品,并在95℃下变性5分钟。如laemmli所述进行不连续sds-page分析,并且在微波中快速煮沸后将凝胶用pageblue
tm
蛋白染色溶液染色15分钟。用ddh2o进行脱色,并且使用gel doc ez成像仪对凝胶进行成像。
[0340]
尺寸排阻色谱(图10b):
[0341]
使用fplc(快速蛋白质液相色谱)进行尺寸排阻,其中hiload
tm superdex 16/600 75pg柱连接至纯化器。将透析的样品注入2ml加载环管中,并在经过滤和脱气的pbs(ph 7.4)中以0.75ml/分钟的流速运行。用uv280测定蛋白质峰,并在96深孔板中收集1ml级分。预期sdab在75ml至85ml之间洗脱,但所有含有蛋白质的级分的样品均在sds-page中分析。合并含有sdab的级分,并在4℃和3200g下,在3kda截止(cut-off)中浓缩至约1mg/ml的最终浓度,并直接用于进一步的测定或等分,在液氮中冷冻并储存在-80℃。
[0342]
表面等离子体共振(spr)
[0343]
使用biacore t100仪器(ge healthcare)进行spr测量。通过胺偶联化学将7.5μg合成globoh固定在商业c1传感器芯片(ge healthcare)上。该芯片预先用补充有0.3%triton x-100的100mm甘氨酸-naoh(ph=12)活化。在10mm乙酸钠缓冲液(ph 5.5)中以700s的接触时间和15μl/分钟的流速进行固定化。芯片含有两个流动池,其中一个用作空白(流动池3),且在其中一个上固定聚糖(流动池4)。sdab在4℃下在spr运行缓冲液(hepes缓冲液)中透析过夜。每种sdab的接触、解离时间、流速和最大测试浓度是不同的,如表3所示。在五种不同浓度下测试每种sdab,其中较低浓度是指定最大浓度的1:2连续稀释液。对于每次亲和事件(association event)后的再生,使用补充有2m mgcl2的相同缓冲液。使用biacore t200对照和评估软件(ge healthcare)分析传感图,评估两个流动池之间的信号差异,以进行数据分析。通过亲和力和动力学分析确定平衡解离常数(kd)。在亲和力分析中,将基于稳态结合水平的结合响应相对于sdab浓度作图,并确定平衡解离常数。通过使用bia评估软件将传感图拟合至1:1结合模型来获得动力学参数。通过软件评估测量的准确性,并以卡方值表示。
[0344]
表3:在globoh固定化的c1芯片上使用sdabs37、sdabs46和sdabs62进行spr测量的参数。
[0345]
sdab最大浓度[μg/ml]接触时间[s]解离时间[s]流速[μl/min]37250904502546756070025622209050050
[0346]
哺乳动物细胞的培养
[0347]
所有细胞在37℃、5%co2下培养。将mcf-7细胞和hek293t细胞在补充有10%胎牛血清(fbs)、1%青霉素/链霉素(p/s)、2mm谷氨酰胺和1%非必需氨基酸的dmem中培养。通过用pbs(w/oca
2+
/mg
2+
)洗涤每2-3天传代一次,随后用胰蛋白酶处理以脱离粘附的细胞。用培养基停止胰蛋白酶处理,并将细胞以300g离心5分钟除去胰蛋白酶。将斑粒状沉淀物重悬于新鲜培养基中,并将细胞以对于mcf-7为1:3/1:4的比例和对于hek293t细胞以1:6/1:8的比例铺板在新的培养皿中。将mda-mb 231细胞在补充有10%fbs和1%p/s的rpmi 1640中培养。每2-3天更新一次培养基,并如上所述以1:4的比例每周传代一次细胞。
[0348]
为了制备冷冻的等分试样,如前所述,收集汇合的75cm2培养瓶中的细胞,并重悬于补充有5%dmso的1ml培养基中,并在冷冻容器中在-80℃冷冻一天。将冷冻的细胞转移到液氮中。将细胞在37℃下快速解冻2分钟,并立即重悬于新鲜培养基中。将它们斑粒沉淀以除去dmso,再次重悬于新鲜培养基中并接种在75cm2培养瓶中。
[0349]
sdab与癌细胞结合的流式细胞术分析
[0350]
facs分析的最佳设置的建立:为了在流式细胞术中分析sdabs与癌细胞的结合,需要初步确定以下参数:检测sdabs的二抗(用atto647标记的抗6xhis标签)的浓度,用作阳性对照的抗globoh抗体克隆vk9的浓度,对于测试的每个细胞系,流式细胞术测量期间正向和侧向散射的电压,以及fitc(异硫氰酸荧光素)和apc(别藻蓝素)检测器。对于每个流式细胞术分析,如上文在“哺乳动物细胞培养”下所述收获70-80%汇合的细胞。将细胞颗粒重悬于pbs+1%bsa中,每种条件下将0.5x106个细胞转移到一个1.5ml ependorf管中。在以250g再次斑粒沉淀这些细胞5分钟后,将一个细胞颗粒在pbs中稀释作为空白细胞,并将一个细胞斑粒状沉淀物重悬于250μl facs缓冲液(pbs+1%bsa+sybr
tm safe(在fitc通道中计数)。为了调节抗his抗体的稀释度,测试了在pbs+1%bsa中1:100、1:500、1:1000和1:5000的稀释度。将斑粒状沉淀物重悬于50μl相应的溶液中,并在室温下孵育45分钟。同时,将三个斑粒状沉淀物在vk9为5、10或20μg/ml的50μl的pbs+1%bsa中孵育。然后通过离心洗涤细胞两次并重悬于500μl pbs+1%bsa中。在室温下,用抗小鼠二抗(alexa fluor 635)对vk9处理的样品再染色45分钟,然后进行如前所述的洗涤。在最后一次离心步骤后,将染色的细胞斑粒状沉淀物重悬于250μl facs缓冲液中。将所有样品转移到facs管中,并在facscanto
tm
ii装置(bd)上进行数据采集。
[0351]
使用mcf-7细胞筛选与球系列聚糖结合的抗体
[0352]
在mcf-7细胞上直接测试如上所述从150ml培养物获得的大肠杆菌裂解物。为此目的,如上所述收获细胞,并将每个样品0.5
×
106个细胞转移到1.5ml试管中。以300g离心5分钟后,将细胞斑粒状沉淀物重悬于50μl相应的裂解物中,并在室温下在振荡器上孵育45分钟。另外,所有运行中均包括仅具有pbs的阴性对照和具有5μg/ml vk9的阳性对照。然后将细胞洗涤两次,并且在最后一次洗涤步骤后,将除vk9对照之外的所有斑粒状沉淀物重悬于前一步骤中确定的抗his抗体溶液(1:1000在pbs+1%bsa中)中,并在室温下在振荡器上再孵育45分钟。将vk9染色的细胞重悬于50μl 1:400稀释的相应荧光抗小鼠抗体(alexafluor 635)中。再洗涤两次后,将细胞固定在100μl含4%多聚甲醛(pfa)的pbs中,离心后将斑粒状沉淀物重悬于250μl facs缓冲液中。使用前一步骤中确定的设置记录数据,并使用软件进行分析。对记录的事件进行门控以仅选择单个完整细胞用于分析。将门
控应用于所有样品,并且通过将sdab染色细胞的apc直方图与阴性对照细胞的apc直方图重叠,可以通过峰的移位观察到结合。为了量化位移并对最强潜在结合物进行排序,在单细胞选择上创建了另外的门控,其定义了结合物的阳性门控。使用软件测定所有sdabs的亲本门控上的apc
+
细胞(单细胞)的频率。
[0353]
不同细胞系上纯化的sdabs的流式细胞术结合测定
[0354]
在如上所述测试大肠杆菌裂解物的结合后,从鉴定的阳性结合物中纯化sdabs,并进一步测试在mcf-7细胞上的结合。程序与筛选中所述相同,不同之处在于将细胞斑粒状沉淀物,而不是大肠杆菌裂解物,重悬于0.4mg/ml纯化sdab的50μl pbs溶液中。通过使用相同的浓度,比较不同sdabs的结合强度。另外,对表达所有球家族聚糖的mda-mb 231细胞和不表达globoh的hek293t细胞进行相同的结合测定。
[0355]
共聚焦激光扫描显微镜(lsm)
[0356]
为了使用共聚焦显微镜验证sdabs与mcf-7细胞的结合,在测定前两天,将20000个细胞接种在24孔细胞培养板中的12mm盖玻片上,以达到50-60%汇合而用于染色。吸出培养基,并用pbs冲洗细胞两次,然后将它们在室温下在4%pfa中固定10分钟。为了除去pfa,将孔在pbs中洗涤3
×
5分钟,然后在pbs+1%bsa中封闭1小时。将一滴50μl的1μg/μl纯化sdab置于一片石蜡膜上,并将具有贴壁细胞的盖玻片置于顶部。一个盖玻片留在孔中作为阴性对照,并且将pbs中的5μg/ml vk9用作阳性对照。将盖玻片与sdabs在室温下在加湿室中孵育1小时。然后,将它们放回孔中,并在pbs中洗涤3
×
5分钟。将200μl atto 647抗6xhis抗体(在pbs+1%bsa中1:5000)加入细胞中,并在室温下轻微振荡孵育1小时。将vk9阳性对照用1:400稀释的小鼠igg特异性(alexafluor635)二抗在pbs+1%bsa中染色。用pbs再洗涤三次后,将10μl封固剂移液到显微镜载玻片上,并将具有染色细胞的盖玻片置于顶部。将载玻片干燥过夜,并在第二天使用axio成像仪进行显微镜检查。m2共焦lsm 800(zeiss)。基于阴性对照和作为阳性对照的vk9染色来设置测定的参数。
[0357]
表4:序列表的描述
[0358]
[0359]
[0360]
[0361]
[0362]
[0363]
[0364]
[0365]
[0366]
[0367][0368]
重组的结合globo h的单域抗体sdab46、sdab56和sdab59的纯化
[0369]
先前,globo h sdabs是通过用合成聚糖免疫羊驼而产生的。鉴定并获得各自的基因序列,作为用于蛋白质表达的商业合成载体。在先前的筛选中使用mcf7癌细胞确定最强的globo h结合物。
[0370]
为了验证和进一步表征聚糖结合,现在分析了最有希望的sdabs在体外与合成聚糖的结合。已经可获得纯化的sdab37、sdab62和sdab63的冷冻等分试样;必须首先纯化sdab46、sdab56和sdab59。因此,将pet-28b(+)-sdab质粒转化到被扩充至1l细菌培养物的shuffle e.coli competent中。用0.5mm iptg诱导蛋白质表达。将重组sdabs经his标记,并通过ni
2+-nta亲和色谱纯化,然后进行尺寸排阻色谱(sec)以分析聚集或多聚化。斑粒状沉淀物、裂解物、流过物(ft)、洗涤液1(w1)、洗涤液2(w2)、ni
2+-nta亲和色谱的洗脱液、以及尺寸排阻色谱(sec)的含蛋白质部分的样品进行sds-page。图17a显示代表性的纯化sds-page图像和来自sec的色谱图。sdab46的理论分子量为16.8kda,对应于观察到的条带。虽然纯化的纳米体单体是部分可溶的,但大量蛋白质裂解后保留在斑粒状沉淀物中。洗涤缓冲液2含有30mm咪唑,其已经导致一些纳米体洗脱和产物损失。然而,其他蛋白质杂质仍然存在,并仍被发现于在洗脱液中。对于随后的尺寸排阻色谱,pbs预洗涤的16/60075(s75)制备级柱与fplc系统一起使用。
[0371]
实施例1:sdab的产生和选择
[0372]
羊驼的免疫
[0373]
对于羊驼免疫,将合成的globo h与载体蛋白crm197(交叉反应性材料-197)缀合,所述载体蛋白是白喉毒素的突变形式,其中第52位的甘氨酸单氨基酸交换为谷氨酸使得蛋
白质无毒。用globoh-crm197缀合物(详情参见方法部分)对羊驼进行总共6轮的按周进行的免疫,包括第三次和第四次注射之间的两周间隔。在第51天收集全血。
[0374]
经免疫的羊驼的免疫反应的评价
[0375]
在免疫之前(第0周)和结束时(第7周)收集的血清样品用于测试与天然球家族聚糖的结合。将血清样品与已知表达球家族聚糖的mcf-7细胞直接孵育,并在室温下孵育45分钟。然后将细胞洗涤两次,重悬于含有fitc缀合的抗美洲驼二抗的溶液中,并在室温下再孵育45分钟。另外两次洗涤后,将细胞固定,重悬于facs缓冲液中,并在流式细胞仪上分析。如图4所示,免疫7周的羊驼血清含有能够结合乳腺癌细胞(mcf-7)的抗体。此外,使用如详细方法部分中所述的聚糖阵列测试血清样品。图6显示了经免疫的羊驼对合成globo h的免疫应答的每周逐渐增加,直至第7周。图7描绘了用最后第7周的血清样品获得的聚糖阵列图像,其显示血清抗体与图中所示的不同球家族合成聚糖的特异性结合。
[0376]
文库构建:
[0377]
从羊驼血清中分离sdab结构域。
[0378]
使用蛋白a/g磁珠从免疫的羊驼血清中分离总抗体。然后将这些样品用于通过使用globoh包被的珠粒和未包被的对照珠粒的亲和纯化来分离globoh特异性sdabs。然后通过聚糖阵列测试这些抗体与globo h的结合。图8显示了用在不同氯化钠浓度下从空珠粒(黑色)和globoh珠粒(灰色)洗脱的抗体样品获得的平均荧光强度。使用100mm、500mm和1m氯化钠获得的样品获得最高的荧光强度,然后在木瓜蛋白酶切割后进行凝胶电泳sds-page以获得13kda的单域抗体(sdab)。图9显示在消化之前,用100mm、500mm和1mnacl获得的样品含有常规iggs(150kda)和仅有重链的abs(55kda)。木瓜蛋白酶消化后,这些样品含有fc和fab片段(均为约25kda)、未消化的抗体片段(约50kda)和13kda的单域抗体。因此,从这些条带中提取sdabs,并在胰蛋白酶消化后进行质谱分析。
[0379]
通过生物信息学分析检索sdab序列。
[0380]
如方法部分所述,使用羊驼pbmcs的cdna,通过两步巢式pcr特异性扩增vhh可变区(sdab),然后进行测序。
[0381]
通过比较pbmcs(cdna)的高通量测序和质谱法(肽)获得的两个文库,进行生物信息学分析以检索亲和纯化的sdab的全长序列(图1中描绘的程序)。为此,使用“llama magic software”v1.0.(https://github.com/fenyolab/llama-magic),以及内部修改版的mascot软件,这是一个用于蛋白质识别的搜索引擎。该软件的修改版本能够将高通量测序的非常大的数据库与蛋白质组学分析的非常大的数据库进行比较,并运行来自ms的每个肽解离光谱,并与通过高通量测序产生的开放阅读框进行比较。
[0382]
该分析能够检索102种不同的sdab序列,并选择36种用于通过在大肠杆菌中重组表达的进一步分析和进一步的结合测定。
[0383]
实施例2:选择的sdabs在大肠杆菌中的表达和进一步分析
[0384]
如方法部分中详细描述的,选择的sdabs序列在arctiv细胞(e.coli)中表达。图10(图a和b)使用sdab46作为实例证明了该程序的有效性。然后通过表面等离子体共振(spr)测试分离的sdabs在已知以低水平表达globoh gb4和gb5的mcf-7细胞上的结合。图11-13显示了sdabs37、sdabs46和sdabs62上的spr的结果。sdab46显示出最高的亲和力值,平均亲和力为54nm。此外,通过流式细胞术测试分离的sdabs与表达球系列聚糖的细
胞的结合(图14、15、16)。同样在这些实验中的结果是,sdab 46是对globoh具有最高结合能力的抗体。
[0385]
这些结果表明,分离的单域抗体可以以相对高的亲和力结合癌细胞上表达的天然球家族结构,以及spr芯片上的合成和充分表征的globo h结构。
[0386]
例如,sdab62结果具有比mcf-7或mda-mb-231细胞更高的亲和力以结合hek293细胞(图16)。该发现表明,sdab62与由hek293表达的聚糖gb3和gb4结合的亲和力高于由mcf-7表达但不由hek293细胞表达的globoh。
[0387]
实施例3:nmr表征globo-h与sdab46的结合表位和结合构象
[0388]
饱和转移差示核磁共振(std nmr)光谱是用于在原子分辨率下研究聚糖-蛋白质相互作用的有力技术,检查与蛋白质接触的碳水化合物部分。
[0389]
为了检查sdab46结合所需的最小识别基序,我们通过std nmr绘制了sdab46结合的globo h的结合表位。从蛋白质到配体的饱和的正确磁化转移需要4s的大饱和时间。几乎所有来自fucα(1

2)galβ-部分的质子都接收来自蛋白质的饱和磁化转移,但由于信号重叠,仅获得质子子集的std扩增因子(图18a)。相应的结合表位表明,fucα(1

2)galβ-基序与位于蛋白质结合口袋中的质子更紧密地接触(图18b)。gb5在110μm sdab46存在下未显示显著的std信号,这表明岩藻糖是配体识别必需的。
[0390]
为了进一步支持sdab46与globo-h的结合,我们在存在和不存在sdab46的情况下从globo-h获得了转移的核overhauser效应(trnoes)。在sdab46存在下观察到globo-h的noe积累速度显著加快,进一步证实了globo-h与蛋白质的结合(图18c)。
[0391]
总之,nmr结果表明,所选择的单域抗体特异性结合明确定义的合成结构以及含有这些表位的细胞表面。
[0392]
实施例4:sdab46三聚体的分子克隆
[0393]
为了改善sdab结合,下一个目标是构建sdab46的三价形式。从单独的项目中,可获得商业获得的表达质粒,其编码由通过gs-linkers连接的三个sdab46单元、在n-端的his-标签和在c-端的裂解肽(鲎抗菌肽-i,缩写为tachy)组成的融合蛋白。通过分子克隆产生排除tachy肽的三价sdab46构建体,其中在tachy编码序列之前插入终止密码子(图19a)。设计诱变引物,并进行pcr反应以产生包括另外的终止密码子的dna序列。使用琼脂糖凝胶电泳验证pcr反应,并观察到大小为约1500bp(预期大小:1448bp)的产物。pcr产物和质粒均用相同的限制酶(xbai、xhoi)消化,并将产物再次在琼脂糖凝胶上电泳。对于6571bp质粒的消化,预期5192bp和1385bp的大片段,但在约6000bp和1500bp处观察到稍大的条带。然而,假设上部条带代表主链,并将其提取并与用作插入物的消化的pcr产物连接。通过dna测序证实了克隆成功。
[0394]
转化后,蛋白质在shuffle细胞中成功表达,如sds-page所示,其中观察到预期大小为46.2kda的条带(图19b)。然后裂解细胞斑粒状沉淀物以评估sdab46三聚体构建体的溶解度,但不幸的是,仅在斑粒状沉淀物样品中而不是在裂解物中观察到对应于三聚体构建体的条带,表明包涵体的形成。先前也观察到原始sdab46三聚体-tachy构建体。优化表达条件(不同的iptg浓度、表达温度、表达持续时间)的尝试不能改善tachy构建体的溶解度,因此考虑建立sdab46三聚体的包涵体分离和重折叠方案。基于li xu等人(biotechnol appl bioc,2017)的方案进行分离。在洗涤步骤之后,获得几乎完全溶解在6m尿素的无色斑粒状
沉淀物。使用配备有histrap柱的快速蛋白质液相色谱(fplc)仪,采用5步咪唑梯度洗脱法,通过ni
2+-nta纯化进一步纯化溶解的包涵体。第二洗脱步骤(~39mm咪唑)已经足以洗脱sdab46三聚体,其在色谱图中观察到并通过sds-page确认。用~97mm咪唑的浓度达到280nm处的最高吸光度值,~170mau,并且更高的咪唑浓度仅导致剩余结合蛋白的边缘洗脱。流出物的sds-page分析显示大部分靶蛋白保持未结合。尽管如此,虽然并非所有变性的单域抗体都被重折叠,但还是获得了1.1mg的折叠的蛋白质。
[0395]
实施例5:三价globo h单域抗体的细胞结合
[0396]
用表达globo h的乳腺癌细胞系mcf7进行体外结合测定。不表达globo h的神经母细胞瘤细胞系imr5用作阴性对照。这些类型的测定通过流式细胞术和荧光显微镜进行。
[0397]
对于流式细胞术,将细胞与0.4mg/ml的sdab46单体或sdab46三聚体溶液一起孵育。使用5μg/ml的抗globo h igg vk9作为阳性对照。抗igg-atto635和抗6xhis-af647用作二抗。将通过流式细胞术测定的荧光强度与仅二抗的阴性对照进行绘图比较。使用基于仅二抗对照的荧光强度产生的“阳性细胞”门控来定量与细胞的结合(图20a)。如所预期的,仅在mcf7细胞(73.47
±
4.83%)中观察到vk9结合,但在imr5细胞(0.04
±
0.13%)中未观察到vk9结合,证实了mcf7细胞上的globo h表达(图20b)。与先前的数据一致,在直方图中看到两个mcf7群体,指示不同的globo h表达水平。对于用sdab46单体(1.17
±
0.71%)和sdab46三聚体(4.19
±
3.92%)孵育的imr5细胞,观察到轻微位移,但mcf7细胞更频繁地被sdabs结合(对于单体为3.65
±
0.51%(曲线i),对于三聚体为50.58
±
20.82%(曲线ii))。双样品t检验显示,与mcf7的结合增加对于vk9和两种sdab构建体是显著的。如所预期的,与sdab46单体相比,sdab46三聚体显示出改善的mcf7结合。
[0398]
对于基于共聚焦激光扫描显微术的测定(图20c),将细胞接种在聚-l-赖氨酸涂覆的盖玻片上,并与0.4mg/ml的单域抗体溶液或0.5μg/ml的vk9一起孵育。抗igg-atto635和抗6xhis-af647用作二抗,并且细胞核用dapi染色。mcf7的二抗对照未显示对于任何抗体的荧光信号,但观察到非特异性抗-6xhis-af647与imr5细胞的结合。如所预期的,观察到vk9与mcf7而不是与imr5的结合,并且在流式细胞术实验中检测到的两个mcf7群体在显微镜下也可以通过不同的荧光强度来区分。sdab46结合也得到了证实,但令人惊讶地,对于单体和三聚体没有观察到荧光强度的差异。有趣的是,两种sdab46形式的染色模式与vk9抗体的染色模式不同,因为两种形式的sdab46主要在细胞内观察到,而vk9在细胞膜上检测得更强烈,就如斑块一样。虽然imr5细胞被抗6xhis-af647非特异性染色,但用sdab46单体和三聚体观察到增加的荧光,表明nb结合较弱,这与流式细胞术结果一致的。
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