一种解淀粉芽孢杆菌、筛选方法、鉴定方法及应用

本发明属于功能微生物筛选及应用
技术领域：
，尤其涉及一种解淀粉芽孢杆菌、筛选方法、鉴定方法及应用。
背景技术：
：目前：随着规模化、集约化水产养殖业的迅速发展，水产养殖病害频繁发生，为了控制疾病，一些抗生素药物在水产养殖中被广泛使用和滥用。不仅造成环境中药物残留、细菌耐药性增加，而且由于水体环境的流动性，耐药基因更容易水平转移，造成更多耐药株的出现。为了应对耐药性，养殖中不得不加大用量并不断更换药物种类，进而造成恶性循环。另一方面药物的大量使用，药物在水产动物体内残留造成的食品安全问题也日益引起关注。在我国，抗生素残留使我国的动物产品出口遭受巨大损失。随着我国加入wto，环保养殖方式的建立愈显重要。因此，替代抗生素的的生物防治(biocontrol)措施成为当前水产养殖的热点，其中益生菌的应用在水产养殖中越来越受到重视，益生菌是益生菌能够从抑制病原菌生长、产生营养因子或分解酶促进消化、增强宿主机体免疫表达和净化水体环境等多个方面减少疾病的产生，此外还具有提高饲料利用率、促进养殖动物生长等方面的功效，对动物和人无毒副作用，节约饲料成本，减少药物使用，减少对环境的破坏。同时，益生菌的使用，将为人类提供绿色、安全的食品提供保障。因此，益生菌的开发和应用，将会取得良好的经济效益和生态效益。通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：药物在水产动物体内残留造成的食品安全问题，抗生素残留使我国的动物产品出口遭受巨大损失。益生菌的应用在水产养殖中日益受到重视，一些关于水产养殖益生菌分离和作用效果的报道也迅速增多，市场上水产用益生菌产品，名目繁多，层出无穷。目前商业化的水产用益生菌绝大部分来源于陆生动物和人类，其作用效果及在动物体内命运(存活时间和定植能力)均有不确定性。为了维持水生动物肠道一定数量的益生菌，发挥可能的益生效应，需要持续的投喂含有高浓度益生菌的饲料，这显然大大增加了养殖成本。近十余年来，一些研究者开始着手从海洋、海水养殖动物栖息环境和肠道土著菌群中筛选益生菌。2016年(申请号201610126559)赵彦翠等从刺参肠道中分离出具有产蛋白酶和淀粉酶活性的解淀粉芽孢杆菌，对刺参生长有明显促进作用，可以有效提高刺参免疫力和对灿烂弧菌的抵抗能力。2017年(申请号201711090798.3)咸洪泉等从刺参养殖池底泥中分离出解淀粉芽孢杆菌nc58对多种病原菌有抑制作用，能够用于刺参腐皮综合征的防治。2018年(申请号201811347161.2)林俊芳等从新鲜解剖带鱼肠道中分离出解淀粉芽孢杆菌jfl21对19种常见食源性病原菌和水产病原菌有广谱抗菌活性，但是未对该菌株在水产养殖和生物保鲜中的功能进行鉴定。这些来自海洋、海水养殖动物栖息环境和肠道的菌株显示良好的应用潜力，但是，以往研究筛选水产动物土著益生菌时，将肠道菌群作为一个整体研究，实际上以肠道粪样为主，粪样在很大程度上体现的是肠道过路菌群的特征。因此混淆了肠道过路菌群和肠壁定植菌群间的差别。缺乏肠道过路菌群和肠壁定植菌群的区分。肠壁定植菌群直接粘附于动物肠道粘膜上皮，提供了一道屏障，阻止病原菌的入侵；此外，它们对食物的分解和自身代谢所产生的营养物质能以最快捷的方式被吸收。肠壁定植菌群对于水产动物的疾病抵抗和营养吸收扮演更为重要的角色。因此，有必要从分离具有肠壁定植能力的新型益生菌。本发明筛选的益生菌能够在南美白对虾肠壁定植，将具有更强的促进对虾生长、改善免疫、提高对虾对细菌性病害的抵抗力的作用，同时可以大量减少益生菌的使用量(因具备定植能力)，节约饲料成本，减少药物使用，减少对环境的破坏。同时，对虾益生菌的使用，将为人类提供绿色、安全的对虾食品提供保障。因此，对虾新型益生菌的开发和应用，将会取得良好的经济效益和生态效益。技术实现要素：针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌、筛选方法、鉴定方法及应用。本发明是这样实现的，一种解淀粉芽孢杆菌，所述解淀粉芽孢杆菌为e312菌株，保藏号为cgmccno:6796。进一步，所述16srdna序列的16srdna序列seqidno:1所示。本发明的另一目的在于提供一种所述解淀粉芽孢杆菌在改善海水养殖水体环境中的应用，将所述解淀粉芽孢杆菌的发酵液添加到水产动物养殖水体中。本发明的另一目的在于提供一种所述解淀粉芽孢杆菌在喂食南美白对虾中的应用。本发明的另一目的在于提供一种动物饲料添加剂，所述动物饲料添加剂包含所述解淀粉芽孢杆菌。本发明的另一目的在于提供一种水体净化剂，所述水体净化剂包含所述解淀粉芽孢杆菌。本发明的另一目的在于提供一种海产品保鲜剂，所述海产品保鲜剂包含所述解淀粉芽孢杆菌。本发明的另一目的在于提供一种所述解淀粉芽孢杆菌的筛选方法，所述解淀粉芽孢杆菌的筛选方法包括以下步骤：(1)菌株分离，将水样接种于5ml无菌离心管中，摇匀后于90℃恒温水浴锅中水浴10min，尽可能除去其他微生物，涂布于2216e固体培养基，30℃培养24h，取不同形态的单菌落共15株，分别命名为e301～e315，在培养基上划线纯化，2216e液体培养基培养，加入15％甘油-80℃保存；(2)菌株筛选，为检测分离菌株是否生产胞外脂肪酶、蛋白酶和纤维素酶，将单菌落分别接种于2216e固体培养基中；30℃培养48小时后，观察和测量菌落周围透明圈大小，筛选分泌胞外酶的细菌。进一步，所述将单菌落分别接种于含有1％tween80、1％羧甲基纤维素和1％脱脂奶粉的2216e固体培养基中。本发明的另一目的在于提供一种所述解淀粉芽孢杆菌的鉴定方法，所述解淀粉芽孢杆菌的鉴定方法应用细菌16srdna基因通用引物，正向引物为27f，反向引物为1492r，扩增海洋细菌e312的16srdna序列，经过扩增产物测序得到大小为1406bp的基因片段，碱基序列如seqidno:1所示；将测序结果与ncbi及ezbiocloud数据库中的16srdna序列进行同源性比对，结果显示菌株e312与解淀粉芽孢杆菌dsm7t亲缘关系最近，同源性达到99.64％；选取菌株e312及同源性相近菌株的16srdna序列，试用mega4.0、nj算法构建系统进化树，得到进化树结果。结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明的芽孢杆菌菌株具有良好的肠道定植能力，能抑制致病弧菌菌的生长，具有病害防治效果；且能大量分泌多种蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶，提高饲料转化率，促进水产动物的生长，降解水体残饵中的蛋白质和淀粉，减少氨氮和cod含量，改善养殖环境。已有研究表明，芽孢杆菌能产生内生芽孢，具有极强的抗逆能力，易于储藏与运输，作为饲料添加剂、水体改良剂和食物保鲜剂都有良好的应用前景。本发明涉及一株解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)e312及其应用，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号cgmccno:6796。菌株可产生脂肪酶、蛋白酶、纤维素酶，抑制多种病原弧菌的生长，对养殖水体主要污染物有明显降解作用，可以有效提高海水养殖动物饲料利用率，促进生长，控制由病原菌和水体污染引起的海水养殖动物疾病的发生，降低养殖动物死亡率，减少抗生素和化学消毒剂的用量，减少环境污染，可进一步开发作为益生菌剂、生物保鲜剂和水体净化剂，应用前景广阔。本发明的解淀粉芽孢杆菌的发酵液添加到水产动物养殖水体中，降低水体中蛋白质、淀粉、氨氮和cod含量；解淀粉芽孢杆菌的发酵液添加到水产动物养殖饲料中，控制海水养殖病原弧菌的感染；解淀粉芽孢杆菌的发酵液上清用浸泡的方式对海产品进行处理，延长海产品货架期。本发明筛选的解淀粉芽孢杆菌作为生物抑菌剂、水体净化剂及饲料添加剂在海水动物养殖、储运过程中的抑菌作用，减少致病菌引起的污染。与现有技术相比，本发明的解淀粉芽孢杆菌e312有较强的产蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶能力，能促进营养物的消化吸收、提高动物生长和饲料转化率，促进生长发育，改善水质。本发明的解淀粉芽孢杆菌e312能够定植于南美白对虾的肠道内，对创伤弧菌vibrio.vulnificusatcc27562、轮虫弧菌v.rotiferianusmccc1a08742和坎氏弧菌v.campbelliimccc1a0874等海洋动物常见弧菌病原菌有显著抑制效果，能够作为生物抑菌剂应用于水产养殖中病原菌污染的控制，有效降低感染弧菌南美白对虾死亡率，也可以控制海产品中致病菌的污染，可进一步开发作为饲料添加剂、生物保鲜剂、水体净化剂，用于食品防腐、防治水产动物病害，降低抗生素及化学药物使用量，减少环境污染，保障养殖产品质量安全，减少抗生素和化学消毒用量，具有良好的经济效益和生态效益。附图说明为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是本发明实施例提供的解淀粉芽孢杆菌、筛选方法、鉴定方法及应用图2是本发明实施例提供的基于16srdna序列的菌株e312系统发育树示意图。图3是本发明实施例提供的解淀粉芽孢杆菌e312饲料添加对南美白对虾感染v.campbelliimccc1a0874128天累计死亡率的影响，具有相同字母上标表示无统计学差异；其中p<0.05为具有统计学差异。图4是本发明实施例提供的解淀粉芽孢杆菌e312对鱼肉样品中病原弧菌的控制效果示意图，*，p<0.05；**，p<0.01。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌、筛选方法、鉴定方法及应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。本发明的解淀粉芽孢杆菌e312新菌株，该菌株可以抑制多种水产动物致病弧菌的生长，分泌多种消化酶、具有养殖水体净化效果，可作为水产养殖饲料添加剂、水体净化剂和海产品保鲜剂，减少抗生素和违禁药物的使用。本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌e312，该菌株是经过分离培养及16srdna序列分析等方法，从厦门近海海水中分离得到的一株新菌株，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期为2012年11月9日，保藏号为cgmccno:6796；分类命名为：解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)；该菌株于2012年11月9日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心收到，并登记入册，于2012年11月9日检测，检测结果为存活。本发明解淀粉芽孢杆菌e312，其16srdna序列如seqidno:1所示，具体为：本发明解淀粉芽孢杆菌e312具有广谱抑制常见海洋动物病原弧菌并生产多种消化酶的功能，将本发明解淀粉芽孢杆菌e312喂食南美白对虾，发现其具有促进南美白对虾生长、提高对病原菌感染的抵抗能力。本发明还提供一种水产动物饲料添加剂，其包括有效剂量作为活性成分的解淀粉芽孢杆菌e312。本发明还提供用于一种水产动物养殖水体环境的水体净化剂，其包括有效剂量作为活性成分的解淀粉芽孢杆菌e312。本发明还提供用于一种海产品保鲜剂，其包括有效剂量作为活性成分的解淀粉芽孢杆菌e312。如图1所示，本发明提供的解淀粉芽孢杆菌的筛选方法包括以下步骤：s101：菌株分离，将水样接种于5ml无菌离心管中，摇匀后于90℃恒温水浴锅中水浴10min，尽可能除去其他微生物，涂布于2216e固体培养基，30℃培养24h，取不同形态的单菌落共15株，分别命名为e301～e315，在培养基上划线纯化，2216e液体培养基培养，加入15％甘油-80℃保存。s102：菌株筛选，为检测分离菌株是否生产胞外脂肪酶、蛋白酶和纤维素酶，将单菌落分别接种于含有1％tween80、1％羧甲基纤维素和1％脱脂奶粉的2216e固体培养基中；30℃培养48小时后，观察和测量菌落周围透明圈大小，筛选分泌胞外酶的细菌。本发明提供的解淀粉芽孢杆菌的筛选方法业内的普通技术人员还可以采用其他的步骤实施，图1的本发明提供的解淀粉芽孢杆菌的筛选方法仅仅是一个具体实施例而已。下面结合实验对本发明的技术方案作进一步的描述。实施例1：解淀粉芽孢杆菌e312分离鉴定与保藏(1)样品，实验样品为厦门近海海水水样。(2)培养基：液体培养基：2216e(海博生物hb0132)固体培养基：2216e培养基中加入质量分数1.5％琼脂。(3)菌株分离，将水样接种于5ml无菌离心管中，摇匀后于90℃恒温水浴锅中水浴10min，尽可能除去其他微生物，涂布于2216e固体培养基，30℃培养24h，取不同形态的单菌落共15株，分别命名为e301～e315，在培养基上划线纯化，2216e液体培养基培养，加入15％甘油-80℃保存。(4)菌株筛选，为检测分离菌株是否生产胞外脂肪酶、蛋白酶和纤维素酶，将单菌落分别接种于含有1％tween80、1％羧甲基纤维素和1％脱脂奶粉的2216e固体培养基中。30℃培养48小时后，观察和测量菌落周围透明圈大小，筛选分泌胞外酶的细菌。其中羧甲基纤维素培养基需要添加碘液(每300mlddh2o中含2.0gki和1.0gi2)染色，具体结果如表1所示。表1筛选菌株产酶能力注：“+”表示阳性，“-”表示阴性选取用牛津杯法检测菌株是否具有病原菌抑制活性。用三株病原弧菌包括创伤弧菌vibrio.vulnificusatcc27562、轮虫弧菌v.rotiferianusmccc1a08742和坎氏弧菌v.campbelliimccc1a08741作为测试病原菌。用2216e培养基将分离的菌株在液体培养基中30℃培养48小时，8000g离心20分钟，取上清液。将上清液通过孔径为0.22μm的滤菌过滤器。取上清液150μl加入到已经接种105cfu/ml的病原菌的琼脂平板牛津杯中。30℃培养24小时，观察病测量抑菌圈的大小，筛选出对弧菌有拮抗效果的细菌。表2：筛选菌株抗弧菌活性注：“+”为抑菌区域直径6～10mm，“+”为抑菌区域直径11～20mm，“+++”抑菌区域直径21～30mm。结果获得一株海洋细菌e312,能同时产生三种消化酶，并且对三株病原弧菌都具有抑制作用。(5)菌株鉴定，应用细菌16srdna基因通用引物，正向引物为27f(5’-agagtttgatc(c/a)tggctcag-3’)，反向引物为1492r(5’-ggttaccttgttacgactt-3’)，扩增海洋细菌e312的16srdna序列，经过扩增产物测序得到大小为1406bp的基因片段，碱基序列如seqidno:1所示。将测序结果与ncbi及ezbiocloud数据库中的16srdna序列进行同源性比对，结果显示菌株e312与解淀粉芽孢杆菌dsm7t亲缘关系最近，同源性达到99.64％。然后，选取菌株e312及同源性相近菌株的16srdna序列，试用mega4.0、nj算法构建系统进化树(bootstrap重复1000次)，得到进化树结果如图2所示。(6)安全性验证，采用浸浴实验室判断益生菌对养殖动物安全性的常用方法。南美白对虾在实验室动物房连续充气的水箱中于28℃饲养两周以适应环境。对虾喂食基础饲料，每日头尾饲料3次，日投饵量为对虾体重5％。每日清理粪便并换水1次，日换水量20％。挑选初始均重为(1.9±0.3g)的健康个体90尾，随机分成2组，每组3个重复，第一组为实验组，水体中添加107cfu/ml解淀粉芽孢杆菌e312菌液，第二组为不添加菌液的对照组。浸浴实验进行7d，7d后统计南美白对虾死亡率。结果表明在107cfu/ml菌液浸浴下，南美白对虾死亡率为零，说明解淀粉芽孢杆菌e312对南美白对虾是安全的。实验例2解淀粉芽孢杆菌e312对南美白对虾的生长的影响。(1)解淀粉芽孢杆菌e312添加饲料的制备将分离的解淀粉芽孢杆菌e312接种在2216e液体培养基中，30℃培养24h，然后4℃5400g离心15min。弃去上清，沉淀用无菌生理盐水重悬离心两次，浓度调整为109cfu/ml,与经过灭菌处理的商品对虾饲料混合。本实验中试用的四种饲料含解淀粉芽孢杆菌e312分别为0、106、107和108cfu/g。饲料中含菌量由平板菌落计数法测定。混合后的饲料室温下干燥，然后保藏在4℃。为了保证饲料含菌量稳定，喂食实验过程中每两周制备一次添加解淀粉芽孢杆菌e312的饲料。(2)南美白对虾饲养，南美白对虾经过两周实验室饲养的适应期后，初始均重为(2.1±0.3g)的健康南美白对虾随机分成4个喂食剂量组(e312含量分别为0、106、107和108cfu/g)，每组包括3个400l水缸，分别装50条南美白对虾。喂食实验进行四周，结束后每个水缸随机选取10条南美白对虾进行称重。生长指标的计算公式分别为：增重率＝[100×(最终体重-初始体重)(初始体重)-1]特定生长率(％)＝100×(ln最终体重－ln初始体重)/投喂天数饲料系数＝摄食量/(最终体重-初始体重)采用spss软件进行单因素方差分析，计算不同饲料投喂对南美白对虾生长的影响，差异显著时进行duncan’s多重比较。解淀粉芽孢杆菌e312对南美白对虾生长、饲料利用和存活率的影响实验数据结果如表3所示。实验开始前各组南美白对虾之间体重没有显著差异，经过4周的喂养后，喂食含e312量为106、107和108cfu/g南美白对虾的增重率和特定生长率均显著高于饲料中无e312添加的对照组(p<0.05)。其中107cfu/g实验组的增重率和特定生长率最高，饲料系数最低。饲料中添加e312的实验组和无添加的对照组在存活率上的差别不具备统计学差异。表3饲料中添加解淀粉芽孢杆菌e312对南美白对虾生长的影响0cfu/g106cfu/g107cfu/g108cfu/g增重率63.55±5.65a81.41±8.65b90.02±8.02b87.51±9.62b特定生长率1.83±0.07a2.34±0.11b2.46±0.13b2.27±0.08b饲料系数1.75±0.14a1.58±0.13b1.26±0.10b1.32±0.09b存活率(％)85.86±3.02a88.36±2.33a93.53±2.65a87.66±2.81a注：生长数据数值表示为平均值±标准差的形式，具有相同字母商标表示无统计学差异，其中p<0.05为具有统计学差异。实施例3：解淀粉芽孢杆菌e312在南美白对虾肠道的定植能力通过ncbi检索获得与解淀粉芽孢杆菌e312亲缘关系接近的芽孢杆菌菌株(见图2)16srrna序列，找到e312与其它芽孢杆菌存在差异的可变区序列，根据这些序列采用设计e312特异性引物为f:cggggctaataccggatggttgt；r：gccgttcaaatagggcggc。以解淀粉芽孢杆菌e312添加浓度分别为0、106、107和108cfu/g的饲料分别喂食南美白对虾28天。结束后测定喂饲后0、7和14d肠道样品中解淀粉芽孢杆菌的量。在无菌条件下挤出肠道粪样，以灭菌海水清洗掉残余粪样，无菌条件下剪碎肠道，提取肠壁定植细菌dna。以提取的基因组dna为模板采用特异性引物行荧光定量pcr扩增，结果如表4.由表4可以看出在喂饲结束后两周内，对虾肠道中解淀粉芽孢杆菌的量显著高于喂饲前的水平，(约高出1个数量级)，标明解淀粉芽孢杆菌e312以高出肠道中该种菌原始状态一个数量级的水平至少定植14d，说明这株芽孢杆菌菌能够适应对虾消化道的环境，对增加肠道有益菌群数量和改善菌群组成有重要的作用。表4不同肠道样品中解淀粉芽孢杆菌的量注：对喂饲结束后肠道样品与适应期样品中解淀粉芽孢杆菌的菌量进行显著性比较：*p<0.05,**p<0.01。实验例4解淀粉芽孢杆菌e312在南美白对虾弧菌病预防中的应用弧菌感染前，各组南美白对虾分别喂食解淀粉芽孢杆菌e312量分别为0、106、107和108cfu/g的饲料28天。每组随机选取20条南美白对虾，分别注射20μl浓度为106cfu/mlv.campbellii。取基础饲料喂养的对虾注射20μl生理盐水作为阴性对照，注射后的对虾每天投喂基础饲料，实验结束后统计各组南美白对虾死亡数目，解淀粉芽孢杆菌e312对南美白对虾弧菌病预防效果实验结果如图3所示。在饲料中添加解淀粉芽孢杆菌e312能显著降低南美白对虾感染弧菌死亡率。其中107cfu/g的饲料添加计量保护效果最高。实施例5解淀粉芽孢杆菌e312对残饵的降解能力饵料培养基：南美白对虾饵料磨成粉末，取20g溶于1000ml海水中浸泡过夜，6000g/min离心15min，上清液加入0.5g牛肉膏，121℃下灭菌20min。解淀粉芽孢杆菌e312接种到饵料培养基中，30℃下160r/min震荡培养48h后，取2ml培养液，6000g/min离心5min，取上清液测定培养基中蛋白质、淀粉含量、氨氮和cod值。采用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量；碘显色法测定淀粉含量；碱性高锰酸钾法测定cod，纳氏试剂分光光度法测定氨氮含量。结果显示，南美白对虾饵料溶解物中的蛋白质、淀粉、氨氮和cod的含量分别降低了63.4％、51.8％、32.7％和48.8％。实施例6解淀粉芽孢杆菌e312在海产品中的弧菌抑制作用解淀粉芽孢杆菌e312接种在2216e液体培养基中，30℃培养24h，然后在4℃，6000g离心15min。将上清液通过孔径为0.22μm的滤菌过滤器过滤。除去鱼皮的鱼肉切成面积为2×2cm的小块，将肉块过火焰灭菌，在鱼肉上滴加1×104cfu/ml创伤弧菌、轮虫弧菌和坎氏弧菌混合菌液20μl，10分钟后，滴加20μl解淀粉芽孢杆菌e312发酵上清液，同时设立滴加弧菌混合菌液和生理盐水的对照。将样品置于20℃环境中，1、4、24和48h取样，加入1ml生理盐水，将样品用无菌研磨棒研磨破碎，梯度稀释进行平板涂布计数。结果如图4所示，在加入解淀粉芽孢杆菌e312发酵上清液的实验组中，4h后弧菌菌数相比对照组降低0.48log，24h和48h后比对照组分别降低了1.17log和1.93log，说明解淀粉芽孢杆菌e312对海产品中的弧菌生长有良好的抑制作用。以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。序列表<110>闽江学院<120>一种解淀粉芽孢杆菌、筛选方法、鉴定方法及应用<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1406<212>dna<213>解淀粉芽孢杆菌e312(bacillusamyloliquefaciense312)<400>1gtcgagcggacagatgggagcttgctccctgatgttagcggcggacgggtgagtaacacg60tgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggatggt120tgtttgaaccgcatggttcagacataaaaggtggcttcggctaccacttacagatggacc180cgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgac240ctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcag300cagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatga360aggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaacaagtgccgttcaaatagggcg420gcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaa480tacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagggctcgcaggcggtttct540taagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactggggaactt600gagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggag660gaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctgaggagcgaaagcgtg720gggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgt780tagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagta840cggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgt900ggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaatccta960gagataggacgtccccttcgggggcagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcg1020tgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagc1080attcagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacg1140tcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacagaacaaag1200ggcagcgaaaccgcgaggttaagccaatcccacaaatctgttctcagttcggatcgcagt1260ctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtg1320aatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccga1380agtcggtgaggtaacctttatggagc1406当前第1页12