一种香茶菜发酵制剂的制备方法及其抗肿瘤治疗的应用

本发明属于中药的微生物发酵领域，具体涉及传统草药香茶菜在食用菌株枯草芽孢杆菌中的发酵工艺，并利用该发酵工艺获得可直接服用的制剂及其在放化疗消化道副作用的改善和抗肿瘤免疫方面的应用。

背景技术：

香茶菜属植物在我国几乎遍布全国，全世界有152余种，我国有90种以上，资源极为丰富。目前研究认为，此类植物及其有效成分有体内外抗菌、抗肿瘤、肝脏保护、抗缺氧、降低血压及抗脂质过氧化损伤等作用，在我国传统中医中广泛运用(如胡庆余堂的胃富春等)，但其活性成分的提取和鉴定是限制其推广和世界认可的主要原因之一。其中内折香茶菜广泛分布于江苏、安徽和山东等地，近年来研究表明其含有的大量二萜类化合物(如内折香茶菜乙素等)都具有显著体内外肿瘤抑制效应，但传统的中药炮制方法对这些有效成分都有不同程度的损伤，寻找有效的炮制方式或制剂工艺对这类药物的创新开发具有重要的探索意义。

作为益生菌的一种，枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)作为对机体代谢和生理功能具有重要调节功能被广泛列于《可用于食品的菌种名单》，其在不同发酵条件下所产生的乳酸、短链脂肪酸、共轭亚油酸、γ-氨基丁酸、胞外多糖和乳酸菌素等活性营养成分在机体中具有抑制外源微生物、抗氧化、抗肿瘤、菌群调节、免疫调节等多种生理活性，近年来越来越引起人们的广泛重视。

枯草芽孢杆菌易在枯草浸汁中繁殖、生长速度快，、对营养要求比较低，且不会产生毒素，是一种无致病性的安全微生物。其在生长环境恶劣、营养物质缺乏等不适宜的环境下进入孢子休眠期，并且形成具有极强抗逆作用、在高温、酸碱等极性环境下亦可生存的芽胞，从而适应环境得以生存。一旦环境变得适宜生长、营养充足，芽胞会自动进入生殖生长期，芽胞重新生长为枯草芽孢杆菌。能高效分泌的代谢产物(枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质、各种活性酶和b族维生素)可以发挥抑制肠道致病菌、增强营养吸收和机体免疫等功能。目前otc药物枯草杆菌二联活菌颗粒(妈咪爱)里面重要的有效活菌成分之一就是枯草芽孢杆菌，其主要用于消化不良、食欲不振、营养不良、肠道菌群紊乱引起的的腹泻、便秘、腹胀、肠道内异常发酵、肠炎，使用抗生素引起的肠粘膜损伤等症。这些都说明枯草芽孢杆菌作为药物开发的潜力可能性。

但目前尚没有通过利用枯草芽孢杆菌可以在植物浸汁中生长的特性，优化发酵工艺，制备微生物中药发酵制剂，从而充分利用他们不同的药物特性、代谢产物和生物学调节功能的报道。我们发现，采用本发明的混合发酵工艺技术能够大幅简化和提高香茶菜的有效成分获取，综合发挥枯草芽孢杆菌和香茶菜在消化道肿瘤中的防治作用。本发明的目的是提供具有特定抑制肠道炎症和肠道肿瘤发生发展的益生菌发酵菌株和中药，制备了一种安全无毒的中药益生菌发酵制剂，用于结直肠肿瘤的预防和治疗。

技术实现要素：

鉴于传统中药香茶菜的药理学功效及传统炮制特点，无法有效、充分利用其多种药效成分而达到抗炎、抗菌和抗肿瘤的目的，本发明主要解决的问题是寻找能在香茶菜中发酵的益生菌菌株和生物学发酵工艺，利用其温和的工艺流程和生物学降解过程使香茶菜的药效成分得到充分、高效释放的同时，兼顾益生菌菌株的生物学效应，进而机体体内达到结直肠癌的防治疗效。

本发明的第一个方面，所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于：保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(chinageneralmicrobiologicalculturecollectioncenter，cgmcc)，其cgmcc编号为1.15792。经过实验验证，本发明使用的枯草芽孢杆菌可以有效降解香茶菜中粗纤维成分，充分释放药效成分，该菌株为一株具有发酵中药能力、简化有效成分提取的枯草芽孢杆菌菌株。

本发明的第二个方面，所述的发酵液，其制备方法为：将所述的枯草芽孢杆菌通过菌种复苏和扩大培养获得菌种培养液，经离心、收集菌泥，接种于香茶菜原料液中，微生物继续发酵温度为30±2℃，3-5天，发酵终点为ph4.5±0.5，将发酵液过滤除菌，形成制剂即得。

本发明的第三个方面，本发明进一步提供枯草芽孢杆菌发酵的香茶菜的发酵中药制剂的制备方法，包括香茶菜原料液的制备、菌种培养基的制备、菌泥的制备和发酵中药的制备过程。步骤如下：

所述的可以用于枯草芽孢杆菌发酵的香茶菜原料液，其制备方法为：将中药香茶菜原料粉碎过40目筛，制成香茶菜粉，加入10-15倍重量的去离子水和0.5-1倍重量的红糖浸泡2小时，形成香茶菜原料液。

所述的菌种培养基，为：牛肉膏4.5g，蛋白胨9g，氯化钠5g，水1000ml，ph7.2～7.4，121℃，灭菌20min。上述药品都使用化学纯标准。

所述的菌泥制备方法为：将所述的枯草芽孢杆菌平板复苏后接种于所述的菌种培养基中，利用好氧发酵按发酵培养基4％的量将二级芽孢杆菌菌种接种到发酵培养基中进行梯度扩培，时间2-3天，菌体含量为10⁹cfu/ml时；培养后的菌液8000r/min离心，制备成菌泥。

将所述的发酵中药的制备方法为：在香茶菜原料液中接种菌泥，接种量按原料液∶菌泥体积比为9∶1接种，发酵温度为30±2℃，37℃，供氧发酵3-5天，发酵终点以ph值4.5±0.5为准，获得发酵液。

本发明提供一种发酵中药制剂，其结合药学上接受的辅料制备成各种类型的产品，包括但不限于口服液、胶囊剂或片剂。

附图说明

图1、香茶菜枯草芽孢杆菌发酵口服液：香茶菜菌剂口服液(bo液)；

图2、bo液增加dss结直肠炎症模型小鼠的体重：对照con组体重基本维持不变，在第1-4天，模型dss组和bo组体重都逐渐下降，在第5天之后，bo组较模型dss组体重有明显回升，二者有统计学差异(p＜0.05)；

图3、bo液抑制了dss结直肠炎症模型小鼠的结肠萎缩：与对照con相比，模型dss组结直肠长度明显变短；而给予bo后结直肠长度显著增长，二者有统计学差异(p＜0.05)；

图4、bo液降低了dss结直肠炎症模型小鼠疾病评分：与模型dss组相比，给予bo液后模型小鼠的疾病评分明显降低，二者有统计学差异(p＜0.05)；

图5、bo液减轻了dss结直肠炎症模型小鼠的肠道炎症侵润：与模型dss组相比，给予bo液治疗后模型小鼠的炎性细胞浸润、隐窝破坏和杯状细胞丢失状况明显减轻，基本恢复至con组状态；

图6、bo液增加dss结直肠炎症模型小鼠的肠道紧密结构蛋白：结肠组织免疫组化染色结果表明，与dss组相比，bo治疗组肠上皮细胞紧密连接蛋白zo-1、occludin表达量明显增多，二者有统计学差异(p＜0.05)；

图7、bo液增加dss结直肠炎症模型小鼠的肠粘膜屏障：结肠组织阿利新蓝染色：与dss组相比，bo治疗组酸性黏液明显增多，肠粘膜屏障的化学屏障基本恢复至con组状态；

图8、bo液降低了dss结直肠炎症模型小鼠的内毒素水平：血清生化指标：与dss组相比，bo治疗组血清d-乳酸、内毒素含量明显降低，二者有统计学差异(p＜0.05)；

图9、bo液抑制了dss结直肠炎症模型小鼠脾脏免疫抑制细胞的浸润：脾脏免疫细胞变化：与dss组相比，bo治疗组脾脏巨噬细胞髓系来源的抑制细胞mdsc明显减少，二者有统计学差异(p＜0.05)；

图10、bo液抑制了dss结直肠炎症模型小鼠结肠免疫抑制细胞的浸润：与dss组相比，bo治疗组结肠巨噬细胞明显减少，二者有统计学差异(p＜0.05)；与dss组相比，bo治疗组结肠髓系来源的抑制细胞mdsc有减少趋势，但二者无统计学差异(p＞0.05)；

图11、bo液改善了dss结直肠炎症模型小鼠结肠菌群紊乱：主成分分析结果显示，与dss组相比，bo治疗组肠道菌群的组成有明显的位置偏移；α多样性显示，与dss组相比，bo治疗组out的数量、chao指数、香农指数无明显变化；

图12、bo液抑制了dss结直肠炎症模型小鼠肠道致病性肠杆菌的数量：群落结构分析结果显示，在目水平，与dss组相比，bo治疗组肠杆菌目含量明显降低、脱硫弧菌目含量明显增加；在科水平，与dss组相比，bo治疗组肠杆菌科含量明显降低；

图13、bo液抑制了aom/dss结直肠癌模型小鼠的结肠萎缩：与con组相比，cac组结直肠长度明显变短；与cac组相比，bo治疗组结直肠长度显著增长，二者有统计学差异(p＜0.05)；

图14、bo液抑制了aom/dss结直肠癌模型小鼠的直肠腺瘤的发生发展：与cac组相比，bo治疗组的肿瘤数量、肿瘤大小、肿瘤负荷明显减少，二者有统计学差异(p＜0.05)(图14)；

图15、bo液抑制了aom/dss结直肠癌模型小鼠的结直肠粘膜下层和肌层固有层的肿瘤细胞数量；

图16、bo液改善了aom/dss结直肠癌模型小鼠机体抗肿瘤免疫功能：与dss组相比，bo治疗组肿瘤组织cd4+t细胞、cd4+t细胞数量明显增加，二者有统计学差异(p＜0.05)；巨噬细胞髓系来源的抑制细胞mdsc明显减少，二者有统计学差异(p＜0.05)；树突状细胞dc无明显变化(p＞0.05)。

具体实施方式

以下结合附图及具体实例详细描述本发明，以便更好地理解本发明，但所述内容并不限制本发明的保护内容。

实施例1：香茶菜枯草芽孢杆菌发酵口服液的制备

1)将中药香茶菜原料粉碎过40目筛，制成香茶菜粉，加入10-15倍重量的去离子水和0.5-1倍重量的红糖浸泡2小时，形成香茶菜原料液。

2)取牛肉膏4.5g，蛋白胨9g，氯化钠5g，去离子水1000ml，ph7.2～7.4，121℃，灭菌20min后，制备菌种培养基；

3)将所述的枯草芽孢杆菌平板复苏后接种于上述的菌种培养基中，进行10倍梯度扩培，培养条件为：接种量4％，37℃摇瓶培养2天，菌体含量为1.0×10⁸-1.0×10⁹cfu/ml；培养后的菌液8000r/min离心，制备成菌泥。然后接种量按香茶菜原料液∶菌泥体积比为9∶1接种，口服液发酵的起始ph值为5.0±0.5℃，接种后视制备的量选择发酵容器，37℃，好氧发酵3-5天，发酵终点以ph值3±0.5℃为准，获得发酵液；

4)在发酵液中按体积重量比加入5％的麦芽糖醇，充分混匀，用0.22μm过滤除菌、封装即得到香茶菜枯草芽孢杆菌发酵口服液(命名为，香茶菜菌剂口服液，制品代号为bo液，见图1)。

实施例2：香茶菜枯草芽孢杆菌发酵口服液抑制小鼠dss诱导的结直肠炎研究

6-8周龄c57bl/6j小鼠20只(18-22g，雌性)，购自南京大学模式动物研究所。所有小鼠都为spf级，饲养条件为温度23±2℃，湿度为55±5％。采取12小时光照/黑暗交替，保证小鼠正常饮水。小鼠购买后适应性喂养一周后用于实验。实验方法遵循江苏省实验动物管理委员会的相关规定。所有实验步骤都得到了南京大学医学院动物实验伦理标准委员会的批准。实验分为对照组(con，6只)、肠炎组(dss，7只)、治疗组(bo，7只)。其中6只小鼠用作正常对照组，其余小鼠采用dss诱导肠炎的造模。造模小鼠于实验开始第1天，给予小鼠3％dss水溶液连续自由饮用7d，其他时间段常规饮用实验室提供的水溶液，建立急性肠炎动物模型，在第10天处死小鼠。3％dss水溶液隔天换一次，以防止造模效果受到影响。治疗组在给予3％dss水溶液期间，同时给予香茶菜枯草芽孢杆菌发酵口服液10ml/kg灌胃，对照组每日给予10ml/kg蒸馏水灌胃。造模期间，仅肠炎组死亡2只。

结果：

1.各组体重变化：con组体重基本维持不变，在第1-4天，dss组和bo组体重都逐渐下降，在第5天之后，bo组较dss组体重有明显回升，二者有统计学差异(p＜0.05)(图2)。

2.各组结肠长度：与con相比，dss组结直肠长度明显变短；与dss组相比，bo组结直肠长度显著增长，二者有统计学差异(p＜0.05)(图3)。

3.肠炎疾病评分：与dss组相比，bo组的疾病评分明显降低，二者有统计学差异(p＜0.05)(图4)。

4.结肠组织病理学染色：与dss组相比，bo治疗组炎性细胞浸润、隐窝破坏和杯状细胞丢失状况明显减轻，基本恢复至con组状态(图5)。

5.结肠组织免疫组化染色：与dss组相比，bo治疗组肠上皮细胞紧密连接蛋白zo-1、occludin表达量明显增多，二者有统计学差异(p＜0.05)(图6)。

6.结肠组织阿利新蓝染色：与dss组相比，bo治疗组酸性黏液明显增多，肠粘膜屏障的化学屏障基本恢复至con组状态(图7)。

7.血清生化指标：与dss组相比，bo治疗组血清d-乳酸、内毒素含量明显降低，二者有统计学差异(p＜0.05)(图8)。

8.脾脏免疫细胞变化：与dss组相比，bo治疗组脾脏巨噬细胞髓系来源的抑制细胞mdsc明显减少，二者有统计学差异(p＜0.05)(图9)。

9.结肠免疫细胞变化：与dss组相比，bo治疗组结肠巨噬细胞明显减少，二者有统计学差异(p＜0.05)；与dss组相比，bo治疗组结肠髓系来源的抑制细胞mdsc有减少趋势，但二者无统计学差异(p＞0.05)(图10)。

10.肠道菌群16srrna测序结果：主成分分析结果显示，与dss组相比，bo治疗组肠道菌群的组成有明显的位置偏移；α多样性显示，与dss组相比，bo治疗组out的数量、chao指数、香农指数无明显变化(图11)；群落结构分析结果显示，在目水平，与dss组相比，bo治疗组肠杆菌目含量明显降低、脱硫弧菌目含量明显增加；在科水平，与dss组相比，bo治疗组肠杆菌科含量明显降低(图12)。

实施例3：香茶菜枯草芽孢杆菌发酵口服液在小鼠aom/dss结直肠肿瘤模型中的抑瘤效应

6-8周龄c57bl/6j小鼠25只(18-22g，雌性)，购自南京大学模式动物研究所。所有小鼠都为spf级，饲养条件为温度23±2℃，湿度为55±5％。采取12小时光照/黑暗交替，保证小鼠正常饮水。小鼠购买后适应性喂养一周后用于实验。实验方法遵循江苏省实验动物管理委员会的相关规定。所有实验步骤都得到了南京大学动物实验伦理标准委员会的批准。实验分为对照组(5只)、cac组(10只)、bo治疗组(10只)。其中5只小鼠用作正常对照组，其余小鼠采用aom/dss联合诱导癌前病变的造模。造模小鼠于实验开始第1天，单剂量腹腔注射10mg/kg的aom，分别于第1、23、44天，给予小鼠2％dss水溶液连续自由饮用7d，其他时间段常规饮用实验室提供的水溶液，建立炎症性腺瘤致癌变动物模型，在第100天处死小鼠。2％dss水溶液隔天换一次，以防止造模效果受到影响。治疗组在给予2％dss水溶液的期间，同时给予制剂香茶菜枯草芽孢杆菌发酵口服液10ml/kg灌胃，对照组每日给予10ml/kg蒸馏水灌胃。造模期间，有6只小鼠死亡，cac组死亡4只，治疗组死亡2只。

结果：

1.各组结直肠长度；与con组相比，cac组结直肠长度明显变短；与cac组相比，bo治疗组结直肠长度显著增长，二者有统计学差异(p＜0.05)(图13)

2.各组结直肠腺瘤数量：与cac组相比，bo治疗组的肿瘤数量、肿瘤大小、肿瘤负荷明显减少，二者有统计学差异(p＜0.05)(图14)

3.结直肠肿瘤组织病理学染色：与dss组相比，bo治疗组浸润于粘膜下层、肌层固有层的肿瘤细胞明显减少(图15)。

4.肿瘤组织免疫细胞变化：与dss组相比，bo治疗组肿瘤组织cd4+t细胞、cd4+t细胞数量明显增加，二者有统计学差异(p＜0.05)(图16)；巨噬细胞髓系来源的抑制细胞mdsc明显减少，二者有统计学差异(p＜0.05)(图16)；树突状细胞dc无明显变化(p＞0.05)(图16)。

此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域的技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限范围。