一株多粘类芽孢杆菌及其菌剂的制备和应用

文档序号:26013660发布日期:2021-07-23 21:34阅读:303来源:国知局
一株多粘类芽孢杆菌及其菌剂的制备和应用

本发明涉及农用微生物技术领域,具体涉及一株多粘类芽孢杆菌及其菌剂的制备和应用。



背景技术:

丹参(salviamiltiorrhiza)为多年生草本药用植物,以根入药,具有祛瘀止痛、活血调经、养心除烦等功效,广泛用于心脑血管病的治疗。丹参是栽培面积较大的药材之一,在人工栽培条件下,由于种植生态环境中生物群落多样性差、丰富度低,病虫害优势种群突出,常常发生严重的病虫害,影响到丹参植株的生长发育,导致药材产量下降,品质变劣。

丹参根腐病属于典型的真菌传染性病害,病原菌孢子可在土壤中潜伏,且潜伏期较长,难以根治,成为第二年的初始侵染源。丹参根腐病是由腐皮镰刀菌(fusariumsolani)引起的一种土传病害,近年来传播蔓延较快,染病后的丹参植株长势衰弱,严重时地上部枯死,根的木质部完全腐烂成黑褐色,产量显著降低,其外观性状和品质均不符合药用要求。对丹参根腐病的防治,目前主要采用化学农药防治,但防效甚微;而利用有益微生物菌剂防治丹参真菌病害是解决中药材土传病害的最佳选择。

植物内生细菌是指能定殖在健康植物组织内,并与植物建立了和谐联合关系的一类微生物。内生细菌常分泌一些活性物质来促进植物生长和抵制病虫害。细菌具有生长速度快、容易成活等特点,从植物中分离具有抗菌活性的内生细菌用于防治植物病害具有重要意义。对药用植物而言,由于其内生菌与其“协同进化”的关系,决定了某些内生菌具有产生与宿主植物相同或相似的生物活性物质的能力。为了开发新的中药丹参资源、降低丹参真菌病害、提高丹参产量,需要一种内生细菌制成的丹参根腐病防治专用微生物肥料,既可以增加土壤营养元素,又可以改善丹参根际微生物群落结构研究,抑制土壤中病原菌的数量从而干扰病原菌对丹参根部的浸染,起到防病促生的双重功效。同时,由于微生物肥料成本低、肥效高、无污染,因此是丹参根腐病防治中经常使用的化肥、农药的最佳替代品。



技术实现要素:

针对上述现有技术,本发明的目的是提供一株多粘类芽孢杆菌及其菌剂的制备和应用。本发明对山东省泰安市某丹参种植基地的丹参植株进行了内生细菌的分离、纯化、培养,以丹参根腐病病原菌腐皮镰刀菌为靶标菌,分离到一株对腐皮镰刀菌有较强抑菌效果的细菌ds-r5,以此内生细菌制成的丹参根腐病防治专用微生物肥料,既可以增加土壤营养元素,又可以改善丹参根际微生物群落结构研究,抑制土壤中病原菌的数量从而干扰病原菌对丹参根部的浸染,起到防病促生的双重功效。

为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:

本发明的第一方面,提供一株多粘类芽孢杆菌(paenibacilluspolymyxa)ds-r5,其生物保藏号为:cctccno:m2021005。

保藏单位:中国典型培养物保藏中心,保藏单位地址:中国.武汉.武汉大学,保藏日期:2021年1月4日。

本发明的第二方面,提供一种微生物菌剂,以多粘类芽孢杆菌(paenibacilluspolymyxa)ds-r5为活性成分。

优选的,所述微生物菌剂为液体微生物菌剂或固体微生物菌剂。

本发明的第三方面,提供上述微生物菌剂的制备方法,包括以下步骤:

(1)菌种活化:将权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌ds-r5划线接种于固体lb培养基平板上,置于培养箱中培养,待长出单菌落后挑取单菌落继续划线接种于固体lb培养基平板上,培养箱中培养得到活化的ds-r5菌苔;

(2)一级种子液制备:将步骤(1)活化的ds-r5菌苔接种于液体lb培养基中,摇瓶培养作为一级种子液;

(3)二级种子液制备:将步骤(2)得到的一级种子液按照2%的体积百分比为接种并搅拌,发酵16h后作为二级种子液;

(4)液体菌剂制备:将步骤(3)得到的二级种子液按照5%的体积百分比接入发酵培养基并搅拌,发酵36h,得到液体微生物菌剂;

(5)固体菌剂制备:将步骤(4)得到的液体微生物菌剂经离心机离心,收集菌体后转移至搅拌器中,加入总重量5%的玉米粉作为载体基质,搅拌均匀后进行喷雾干燥,即为固体微生物菌剂。

优选的,二级种子液制备中,发酵温度37℃,通气量3m3/h,罐压维持在0.05mpa;液体菌剂制备中,发酵温度37℃,通气量30m3/h,罐压维持在0.05mpa。

优选的,所述发酵培养基配方:葡萄糖10.0g,蛋白胨20.0g,(nh4)2so42.0g,kh2po40.5g,mgso41.0g,nacl1.5g,蒸馏水1l;121℃、0.1mpa条件下灭菌20min。

本发明的第四方面,提供上述微生物菌剂的使用方法:液体微生物菌剂与水按照1:100的比例混合均匀,灌根施用;固体微生物菌剂按照5kg/亩用量,灌根施用。

本发明的第五方面,提供上述多粘类芽孢杆菌(paenibacilluspolymyxa)ds-r5或微生物菌剂在如下(1)-(4)至少一项中的应用:

(1)抑制植物病原菌;

(2)制备用于抑制植物病原菌的产品;

(3)防治由植物病原菌导致的药用植物根腐病;

(4)制备用于防治由植物病原菌导致的药用植物根腐病的产品。

优选的,所述植物病原菌包括真菌和细菌;所述真菌为腐皮镰刀菌、立枯丝核菌、链格孢菌、禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌、假禾谷镰刀菌、炭疽病菌或葡萄座腔菌;所述细菌为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌、黑胸败血菌、白色念珠菌或细菌性杨树溃疡病菌。

优选的,所述药用植物为丹参、黄精、黄芪或板蓝根;优选的,所述药用植物为丹参。

本发明的有益效果:

1.本发明拮抗细菌ds-r5具有较宽的拮抗谱,对常见的植物病原真菌均有不同程度的抑制效果;利用ds-r5菌株制成的菌剂可以有效防治由腐皮镰刀菌引起的丹参根腐病真菌土传病害,对常见病原细菌有拮抗效果,既能抑制真菌还能抑制细菌。本发明拮抗细菌ds-r5能够在丹参、黄精、黄芪等药用植物根际稳定定殖;在防治丹参根腐病病害的同时,还能促进丹参生长。本发明拮抗细菌ds-r5同时还具有快速降解纤维素的能力,有助于丹参、黄精、黄芪等药用植物秸秆直接还田,利于秸秆的快速腐解。

2.本发明菌剂的生产工艺简单、周期短、菌株ds-r5发酵性状好、成本低,利于工业化生产和运输。本发明的菌剂既可以增加土壤营养元素,又可以改善丹参根际微生物群落结构研究,抑制土壤中病原菌的数量从而干扰病原菌对丹参根部的浸染,起到防病促生的双重功效。同时,由于菌剂成本低、肥效高、无污染,是丹参根腐病防治所用化肥、农药的最佳替代品。本发明对于开发新的中药丹参资源、降低丹参真菌病害、提高丹参产量具有指导意义。

附图说明

图1a为菌株ds-r5在na培养基上的菌落形态;图1b为光学显微镜下菌株ds-r5菌体细胞形态;图1c为光学显微镜下菌株ds-r5芽孢形态;图1d为电子显微镜下菌株ds-r5菌体细胞形态。

图2为根据菌株ds-r5的16srdna序列构建的系统进化树。

图3为菌株ds-r5对部分病原真菌的抑菌谱;a为菌株ds-r5对腐皮镰刀菌的拮抗作用;b为菌株ds-r5对禾谷镰刀菌的拮抗作用;c为菌株ds-r5对立枯丝核菌的拮抗作用;d为菌株ds-r5对炭疽病菌的拮抗作用。

图4为菌株ds-r5对部分病原细菌的抑菌谱;a为菌株ds-r5对金黄色葡萄球菌的拮抗作用;b为菌株ds-r5对黑胸败血菌的拮抗作用;c为菌株ds-r5对白色念珠菌的拮抗作用;d为菌株ds-r5对细菌性杨树溃疡病菌拮抗作用;e为菌株ds-r5对新生隐球菌的拮抗作用;f为菌株ds-r5对大肠杆菌的拮抗作用。

图5是带有绿色荧光蛋白(gfp)标记的菌株ds-r5在荧光显微镜下的发出的绿色荧光。

图6为菌株ds-r5发酵液对腐皮镰刀菌孢子萌发的抑制作用。

图7a是菌株ds-r5纤维素刚果红水解透明圈;图7b是菌株ds-r5蛋白酶水解透明圈。

图8a菌株ds-r5纤维素酶酶活测定标准曲线;图8b是菌株ds-r5蛋白酶酶活测定标准曲线。

图9a为对照组菌丝,颜色发亮、细长且粗细均匀;图9b为受拮抗菌株ds-r5抑制的腐皮镰刀菌,菌丝体大部分发生畸变,菌丝缠绕、断裂,局部出现串珠状细胞。

图10是光学显微镜下菌株ds-r5对腐皮镰刀菌菌丝的抑制效果;a表示对照组,没有抑菌圈形成;c为加入发酵原液后的抑菌情况;b为加入2倍稀释发酵液的抑菌情况。

图11为光学显微镜下菌株ds-r5对腐皮镰刀菌孢子萌发的抑制效果;a为对照组,已经有相当多的孢子开始萌发;b为处理组,仅有偶见孢子萌发。

图12为腐皮镰刀菌实时荧光定量pcr标准曲线。

具体实施方式

应该指出,以下详细说明都是例示性的,旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明,本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案,以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料,均可通过商业渠道购买得到。

实施例1

1、菌株ds-r5的分离

取长势良好的丹参健康植株,用流水清洗干净,对材料表面按以下流程进行消毒:75%乙醇浸泡1min,无菌水冲洗3次;0.1%升汞中浸泡3min,无菌水冲洗3次。在无菌操作台中将处理过的丹参根、茎、叶等组织分别用研钵研磨成浆状,无菌水稀释10倍后涂布于na培养基上,37℃培养3d。待培养基上长出可见菌落时,及时挑取菌落,经多次划线分离获得纯培养物。

以腐皮镰刀菌为靶标病原菌,筛选丹参内生拮抗细菌。采用两点平板对峙法将分离到的丹参内生细菌进行病原真菌拮抗性能测试,取培养7d的腐皮镰刀菌,用直径5mm的打孔器打孔,将5mm的菌饼接种于pda平板中央,距菌饼2.5cm处上下平行划线接种分离到的丹参内生细菌,以不接拮抗细菌的真菌平板作为对照,置于30℃培养箱中恒温培养。待对照组病原菌菌落长满皿底时,测量处理组抑菌带宽度。

将上述获得的若干株纯培养物进行平板对峙试验,测量抑菌带宽度,筛选获得抗菌谱广、抗菌效果强的丹参内生拮抗细菌ds-r5菌株。

2、菌株ds-r5的鉴定

(1)菌体形态与菌落特征

菌株ds-r5在na培养基上培养36h后,菌落光滑、湿润,菌落形状为圆形,不易挑起;在光学显微镜下,菌体为杆状,革兰氏染色为阳性,产椭圆形芽孢,且芽孢中生;扫描电镜显示,菌体细胞大小为0.8μm×2.8μm左右(见图1)。

(2)生理生化特征

菌株ds-r5能利用葡萄糖、甘油发酵产酸,淀粉水解、明胶水解、厌氧生长、接触酶、硝酸盐反应、v-p反应、水解酪蛋白反应等均为阳性,氧化酶反应、柠檬酸盐反应、琥珀酸盐反应、h2s产生反应等均为阴性,在nacl含量为5%的培养基上不能生长(表1)。

表1菌株ds-r5的部分生理生化特征

(3)菌株ds-r5基于16srdna序列分析

菌株ds-r5的16srdna序列如seqidno.1所示,将此序列与ncbi数据库中序列进行blast分析比对,选取6株与菌株ds-r5序列相似性较高的菌株进行系统发育分析,利用mega7.0软件,采取neighbor-joining法构建以16srdna序列为基础的系统进化树(见图2)。结果表明菌株ds-r5与多粘类芽孢杆菌(paenibacilluspolymyxa)处于同一分支,结合菌株ds-r5培养特征和生理生化特征,我们将菌株ds-r5鉴定为多粘类芽孢杆菌。

菌株ds-r5的保藏单位:中国典型培养物保藏中心,保藏单位地址:中国.武汉.武汉大学,保藏日期:2021年1月4日,生物保藏号为cctccno:m2021005。

实施例2:菌株ds-r5对常见植物病原真菌抑菌谱测定

采用两点平板对峙法将分离到的丹参内生细菌ds-r5进行病原真菌拮抗性能测试。分别取培养7d的腐皮镰刀菌、立枯丝核菌、链格孢菌、禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌、假禾谷镰刀菌、炭疽病菌、葡萄座腔菌,用直径5mm的打孔器打孔,将5mm的菌饼接种于pda平板中央,距菌饼2.5cm处接种分离到的丹参内生细菌,以不接拮抗细菌的真菌平板作为对照,置于30℃培养箱中恒温培养。待对照组病原菌菌落长满皿底时,测量处理组抑菌带宽度,每个处理三次重复。试验结果表明菌株ds-r5对供试的8种病原真菌均有不同程度的拮抗效果,菌株ds-r5对8种病原真菌的抑制效果如表2所示,抑菌谱如图3所示。

表2菌株ds-r5对8种病原真菌的抑制效果

注:表中数据为平均数±标准差。同列数据后不同小写字母表示经邓肯新复极差法检验在p<0.05水平差异显著。

实施例3:菌株ds-r5对常见病原细菌抑菌谱测定

分别取一菌环金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌、黑胸败血菌、白色念珠菌、细菌性杨树溃疡病菌接入lb培养基中过夜培养,取20μl处于对数期的上述6种供试病原细菌加入到20ml未凝固的lb培养基中,混匀后倒入直径为7.5cm的无菌培养皿中。凝固后用灭菌牙签点种菌株ds-r5,37℃培养24h后观察菌株ds-r5对供试病原细菌的拮抗效果。试验结果表明,菌株ds-r5对6种对供试病原细菌均有不同程度的抑制效果(见图4)。

实施例4

1、菌株ds-r5在丹参、黄精、黄芪根际的定殖能力测定

(1)绿色荧光蛋白(gfp)标记菌株ds-r5-gfp的构建

首先按照常规方法制备菌株ds-r5感受态细胞备用,取100μl制备好的感受态细胞与适量质粒pht01-p43gfpmut3a混合后转移至预冷的电击杯上,用枪头轻轻吹吸,冰浴时间不超过5min。装入电击仪(伯乐micropulser电穿孔仪)后电击,电击转化条件:电压1.5kv,电阻300ω,电容2.5μf。电击后,立即添加900μl于30℃预热的luriabertani(lb)培养液并转移到试管中。30℃、200rpm条件下振荡3h后,将培养物涂布在含有5μg/ml氯霉素的lb板上。在荧光显微镜下观察生长在抗性平板上的菌落,观察细菌在蓝光下是否能激发绿色荧光。从图5中可以看出,构建的菌株ds-r5-gfp在蓝光激发下可以发出亮绿色荧光,说明菌株ds-r5的gfp标记菌株构建成功。

(2)定殖试验

将长势一致的丹参、黄芪、板蓝根幼苗植入直径30cm的花盆中进行扦插繁殖,花盆中装有泥炭土和珍珠岩以3:2比例混合的沙质土,以正常方式浇水管理。将菌株ds-r5-gfp接入含5mg/l氯霉素的lb液体培养基中培养12h左右,6000r/min离心10min后收集菌体加入适量无菌水充分振荡,使菌体分散均匀,取10ml菌液分别施入丹参、黄芪、板蓝根幼苗根部,分别于处理后第5、10、20、40、60d挖取土样,梯度稀释后涂布氯霉素抗性平板计数。菌株ds-r5-gfp在丹参、黄芪、板蓝根幼苗根际土的定量情况如图6所示。从图中可以看出,随着灌菌时间的延长,菌株ds-r5-gfp在丹参、黄芪、板蓝根幼苗根际土的定殖密度均呈现出先上升、后下降的趋势。在用菌株ds-r5-gfp处理的第5d,在丹参、黄芪、板蓝根幼苗根际土中回收的菌落数分别为3.5×106cfu/g、2.6×106cfu/g、1.9×106cfu/g;在用菌株ds-r5-gfp处理的第20d,丹参、黄芪、板蓝根幼苗根际土中回收的菌落数均达到最高值,分别为6.4×106cfu/g、5.4×106cfu/g、4.5×106cfu/g。20d以后菌落数开始下降,一直到第60d还分别可以回收到4.1×106cfu/g、4.3×106cfu/g、2.1×106cfu/g的ds-r5-gfp。这充分说明菌株ds-r5-gfp可以在丹参、黄芪、板蓝根幼苗根际土中长期定殖。

实施例5:菌株ds-r5对丹参根腐病的防病机制

(1)拮抗作用。拮抗作用是拮抗菌防治病害的重要机制。拮抗细菌通过合成分泌抗菌物质作用于病原真菌的细胞壁、细胞膜、蛋白合成系统或能量代谢系统等,抑制或者杀灭病原微生物。抗菌物质主要包括两大类:抗生素(肽类、细菌素等)和水解酶(几丁质酶、蛋白酶、纤维素水解酶、葡聚糖酶和溶菌酶等)。

本发明提供的多粘类芽孢杆菌ds-r5能够分泌纤维素酶和蛋白酶。将菌株ds-r5分别点种到纤维素刚果红培养基和脱脂乳培养基平板上,37℃倒置培养2-3d,观察结果。试验结果如附图7a、7b所示,从图中可以看出,菌株ds-r5能够纤维素刚果红平板和脱脂乳培养基平板上产生明显的透圈,表明菌株ds-r5能够产生纤维素酶和蛋白酶。通过对菌株ds-r5进行液体发酵,测得发酵液产生纤维素酶和蛋白酶的酶活分别达到46.7u/ml和68.4u/ml。纤维素酶和蛋白酶酶活测定方法参照中华人民共和国农业行业标准ny/t1847-2010,纤维素酶和蛋白酶酶活测定标准曲线见附图8a和8b。

试验中所需培养基配方如下:

纤维素刚果红培养基:微晶纤维素1.88g,刚果红0.2g,mgso40.25g,k2hpo40.5g,明胶2.0g,agar14.0g,蒸馏水1l。

纤维素酶液体发酵培养基:玉米粉40g、蛋白胨3.0g,(nh4)2so42.0g,na2hpo40.5g,mgso40.2g,feso4.7h2o0.1g,caco30.5g,蒸馏水1l。

蛋白酶液体发酵培养基:葡萄糖5g,na2hpo40.1g,蛋白胨5g,吐温-801ml,cacl20.1g,蒸馏水1l。

脱脂乳培养基:脱脂乳10.0g,k2hpo41.0g,mgso4.7h2o0.5g,kcl5.0g,feso4.7h2o0.1g,琼脂20.0g,蒸馏水1l。

(2)菌株ds-r5对病原真菌菌丝生长和孢子萌发的抑制作用

①用无菌牙签挑取病原菌正常生长菌丝以及受菌株ds-r5抑制的腐皮镰刀菌菌丝制片,在光学显微镜下观察拮抗菌株ds-r5对腐皮镰刀菌菌丝形态的影响。通过光学显微镜镜检发现,菌株ds-r5对腐皮镰刀菌菌丝生长具有明显的破坏作用。对照组菌丝颜色发亮、细长且粗细均匀(图9a),而受拮抗菌株ds-r5抑制的腐皮镰刀菌菌丝体大部分发生畸变,菌丝缠绕、断裂,局部出现串珠状细胞(图9b)。

②菌株ds-r5发酵液对病原真菌孢子萌发的抑制作用

孢子萌发平板试验:取一菌环菌株ds-r5接种至lb培养基中,200r/min、37℃条件下过夜培养,以2%接种量接入抗菌活性物质发酵培养基中,200r/min、30℃条件下发酵72h,6000r/min离心取上清液,过0.22μm无菌滤膜制备无菌发酵液。将腐皮镰刀菌孢子在2%葡萄糖溶液中制成孢子悬浮液,浓度为1×106孢子/ml为宜。将配好的pda培养基在121℃、0.1mpa条件下灭菌20min,冷却至50℃左右还未凝固时,按孢子悬浮液:pda培养基=1:100的比例向pda培养基中加入配好的孢子悬浮液,混合均匀后倒平板,待平板凝固后距平板中央2cm处均匀放置3个灭菌的牛津杯,向其中2个牛津杯中分别加入发酵液原液(图10c)和2倍稀释液(图10b),以加入200μl未接种的发酵培养基作为对照。试验结果如附图10所示,从图中可以看出,发酵液的加入可以抑制腐皮镰刀菌孢子萌发成菌丝,形成明显的抑菌圈,而且随着发酵液稀释倍数的增大,形成的抑菌圈明显变小,而对照组孢子正常萌发成菌丝,没有任何抑菌圈形成(图10a)。

孢子萌发镜检试验:将无菌发酵液原液与孢子悬浮液等体积混和,取10μl混和液滴于凹玻片上,盖上盖玻片后将凹玻片放于灭菌培养皿中,30℃培养箱中保湿培养,每隔8h镜检观察孢子萌发数,连续观察至32h。

萌发率、抑制率的计算公式为:

试验结果如附图11所示,孢子萌发镜检试验表明,菌株ds-r5发酵液能显著抑制腐皮镰刀菌孢子萌发,对照组中已经有相当多的孢子开始萌发(图11a),而处理组仅有偶见孢子萌发(图11b)。如表3所示,菌株ds-r5发酵液处理腐皮镰刀菌孢子后,处理组孢子萌发数和萌发率均远远小于对照组:8小时时,对照组孢子萌发数和萌发率分别为15%和17.3%;而处理组孢子萌发数和萌发率仅为3.7%和4.3%,此时孢子萌发抑制率为75.1%;32小时时,对照组孢子全部萌发,而处理组孢子萌发率仅为17.7%,孢子萌发抑制率为82.9%。表中数据有力地说明,菌株ds-r5对腐皮镰刀菌孢子萌发有强烈的抑制作用。

表3菌株ds-r5抗菌活性物质对腐皮镰刀菌孢子萌发的抑制作用

注:符号“*”表示处理组与对照组差异显著(p<0.05);同列间相比,无相同字母者表示差异显著(p<0.05)。

实施例6:多粘类芽孢杆菌ds-r5菌剂的制备

(1)菌种活化:将多粘类芽孢杆菌ds-r5划线接种于lb固体培养基平板上,置于37℃培养箱中培养24h,待长出单菌落后挑取单菌落继续划线接种于lb固体培养基平板上,37℃培养箱中培养24h后备用。

(2)一级种子液制备:

用接种环刮取一环活化的ds-r5菌苔,接种于装液量为100ml液体lb培养基的250ml三角瓶中,37℃、200r/min条件下摇瓶培养16h作为一级种子液。液体lb培养基配方如下:蛋白胨1%,氯化钠1%,酵母粉0.5%;121℃、0.1mpa条件下灭菌20min。

(3)二级种子液制备:将上述一级种子液按照体积百分比为2%的接种量接种至100l发酵罐中,搅拌桨转速200r/min,发酵温度37℃,通气量3m3/h,罐压维持在0.05mpa左右,培养16h后作为二级种子液。二级种子液培养基配方及灭菌条件与一级种子液一致。

(4)液体菌剂制备:将二级种子液按照体积百分比为5%的接种量接入装有发酵培养基的2吨发酵罐中,搅拌桨转速120r/min,发酵温度37℃,通气量30m3/h,罐压维持在0.05mpa左右,在此条件下培养36h,得到菌株ds-r5的液体菌剂,此液体菌剂芽孢得率>80%。

发酵培养基配方:葡萄糖10.0g,蛋白胨20.0g,(nh4)2so42.0g,kh2po40.5g,mgso41.0g,nacl1.5g,蒸馏水1l。121℃、0.1mpa条件下灭菌20min。

(5)固体菌剂制备:将发酵完成的ds-r5液体菌剂,经离心机10000r/min离心20min,收集菌体后转移至搅拌器中,加入总重量5%的玉米粉作为载体基质,搅拌均匀后进行喷雾干燥,即为菌株ds-r5固体菌剂,此固体菌剂活体菌数可达1200亿/g。

实施例7:多粘类芽孢杆菌ds-r5菌剂的应用

(1)盆栽试验1:菌株ds-r5对丹参根腐病的生物防治效果

选取长势良好的盆栽丹参幼苗40株,每盆一株,分成两组,每组20株。一组用本发明实施例4得到的微生物菌剂灌根处理,另一组为对照组。试验组为将实施例4得到的微生物菌剂灌根处理丹参幼苗,每株丹参幼苗加入微生物菌剂30ml,三天后灌根接种20ml腐皮镰刀菌孢子悬浮液,孢子浓度为1×106个/ml;对照组用不接菌的发酵培养基30ml灌根处理丹参幼苗,三天后灌根接种20ml腐皮镰刀菌孢子悬浮液,孢子浓度为1×106个/ml。120天后统计计算菌株ds-r5对丹参根腐病的防病效果。根据丹参幼苗的病斑面积将病情分为五级。1级为无病斑;2级为病斑面积<5%;3级为病斑面积在5-20%之间;4级为病斑面积在20-50%之间;5级为病斑面积>50%。各级没处理的植株总数分别为a、b、c、d、e,病情指数=(0×a+1×b+2×c+3×d+4×e)/(4×a+4×b+4×c+4×d+4×e)×100;防病效果=100%—(处理组病情指数/对照组病情指数)×100%。试验结果表明,实施例6中得到的微生物菌剂对丹参根腐病的防治效果可达67.3%。

(2)盆栽试验2:菌株ds-r5液体菌剂对丹参根腐病病原腐皮镰刀菌的拮抗作用

将长势一致的盆栽丹参幼苗移至直径30cm的花盆中,分不同组别进行腐皮镰刀菌灌根处理。对空对照ck:分别加浓度为1×106cfu/ml的腐皮镰刀菌孢子悬浮液和未接ds-r5菌株的发酵培养基20ml;空白对照ck1:分别加浓度为1×106cfu/ml的腐皮镰刀菌孢子悬浮液和灭活的ds-r5菌株发酵培养液20ml;处理组:分别加浓度为1×106cfu/ml的腐皮镰刀菌孢子悬浮液和ds-r5菌株的发酵培养液20ml。采用实时荧光定量pcr技术,加菌处理后每隔10d监测ds-r5菌株对腐皮镰刀菌孢子的抑制作用。试验结果见表4,腐皮镰刀菌实时荧光定量pcr标准曲线见附图12。从表4中可以看出,在加菌处理的第10d、20d和30d,对照组ck中腐皮镰刀菌的拷贝数呈现先下降然后又上升的趋势,取样第10d时丹参根际土中的腐皮镰刀菌的数量为27.3×105copies/g,第20d时的数量下降为8.4×105copies/g,第30d时的数量又升高到18.4×105copies/g。对照ck1和处理组的腐皮镰刀菌数量变化规律相同,均为一直下降的趋势;在第10d时ck1和处理组的腐皮镰刀菌数量分别为20.7×105copies/g和15.1×105copies/g,20d时分别下降至6.3×105copies/g和2.2×105copies/g,30d时处理组腐皮镰刀菌仅为3×103copies/g,远低于ck1的1.9×104copies/g。处理组的腐皮镰刀菌数量变化充分说明了ds-r5菌株对腐皮镰刀菌的抑制作用,同时也证明了ds-r5菌株能在丹参根际稳定定殖。

表4实时荧光定量pcr监测腐皮镰刀菌数量

(3)盆栽试验3:多粘类芽孢杆菌ds-r5菌剂对丹参的促生作用

为验证菌株ds-r5作为微生物菌肥在丹参种植生产中的促生作用,进行了丹参盆栽试验。将长势均匀一致的丹参幼苗移入直径30厘米的花盆中,进行如下试验设计:对照组为灌根接入灭活的菌株ds-r5液体菌剂,20ml/盆;处理组为灌根接入培养好的菌株ds-r5液体菌剂,20ml/盆。丹参幼苗生长3个月后,将处理组和对照组的丹参幼苗从花盆中取出,分别随机选取10棵幼苗,小心抖掉附着在丹参根际的土样后用自来水将丹参根际冲洗干净,晾干后对丹参的根系长度、丹参根组织干重、鲜重等生长量指标进行测定,试验结果见表5。结果表明,与对照组相比,处理组小麦根系长而分支多,根系平均长度23.6cm,丹参幼苗平均鲜重为1.55g,平均干重0.57g;对照组丹参幼苗根系平均长度为19.8cm,丹参幼苗平均鲜重为1.02g,平均干重0.42g。数据分析结果表明,处理组和对照组的根系长度、根组织平均鲜重、根组织平均干重等3个生长量指标均存在显著性差异。

表5丹参幼苗生长指标测定结果

以上所述仅为本申请的优选实施例而已,并不用于限制本申请,对于本领域的技术人员来说,本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本申请的保护范围之内。

sequencelisting

<110>山东第一医科大学(山东省医学科学院)

<120>一株多粘类芽孢杆菌及其菌剂的制备和应用

<130>2021

<160>1

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1517

<212>dna

<213>菌株ds-r5

<400>1

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