一株抗棉花黄萎病的根瘤菌DG3-1及其用途

本发明涉及微生物应用技术领域，具体涉及一株抗棉花黄萎病的根瘤菌dg3-1及其用途。

背景技术：

棉花黄萎病为害棉花生产的主要病害之一，棉田一旦感染黄萎病,就会常年发生,目前暂无有效防治手段，有人称它为“癌症″。黄萎病的发病机理主要是土壤中的黄萎病病菌侵染棉株，危害茎干内的维管束组织，影响养分和水分向蕾铃输送，导致棉株叶片枯干脱落，严重的会导致棉田大幅减产，黄萎病的发病一般伴随棉花的整个生长过程。

新疆是我国棉花的主要产地之一，在新疆棉花已成为南北疆的主要经济作为，是新疆经济发展不可缺少的一部分。随着连年不断的种植，新疆棉花黄萎病的发生也不断加重，棉花黄萎病成为限制新疆棉花品质与产量的重要因素。棉花黄萎病是由半知菌亚门丛梗孢目轮枝菌属大丽轮枝菌(verticilliumdahliaekleb)引起的维管束土传病害，具有寄主范围广、变异性强、有较强抗逆性等特点，这也是棉花黄萎病发生猖獗的主要原因。目前，防治棉花黄萎病方面主要采用化学防治、选育抗病品种为主，农业防治为辅，对于黄萎病较重的棉田，可采取水旱轮作的方式以降低土壤病菌基数，尤其是与水稻等禾本科作物进行轮作，对抑制黄萎病有较好的效果，但是不适于大面积棉田种植地，轮作倒茬困难。

从生物方面对棉花黄萎病进行防治有重要意义，然而，目前国内外关于棉花黄萎病的拮抗菌株的研究较少，能够抑制棉花黄萎病的菌种资源少。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明提供了一株抗棉花黄萎病的根瘤菌dg3-1，利用该菌株与病原菌具有同等的生态位，能抑制病原菌的生长，削弱致病菌的能力，从而提高寄主抗病性。

本发明的第一个目的是提供了一株抗棉花黄萎病的根瘤菌dg3-1，所述根瘤菌dg3-1的保藏编号为cctccno：m2021122。

本发明第二个目的是提供了上述根瘤菌dg3-1在防治棉花黄萎病中的用途。

本发明第三个目的是提供了上述的根瘤菌dg3-1制备得到的生防菌剂。

进一步地，所述生防菌剂为防治棉花黄萎病的生防菌剂。

本发明第四个目的是提供了上述的根瘤菌dg3-1生防菌剂的制备方法，具体制备过程为：将所述根瘤菌dg3-1接种于lb液体培养基中，28℃，180r/min振荡4d，获得的发酵液即为根瘤菌dg3-1生防菌剂。

进一步地，所述发酵液中活菌数为10⁷cfu/ml。

进一步地，所述发酵液中活菌数为8ⅹ10⁷cfu/ml。

本发明第五个目的是提供了上述的根瘤菌dg3-1生防菌剂在防治棉花黄萎病中的用途。

进一步地，所述根瘤菌dg3-1生防菌剂用于抑制大丽轮枝菌。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1、本发明获得的根瘤菌dg3-1是首次在棉株内部分离出的内生根瘤菌，也是首次发现其对于大丽轮枝菌具有强拮抗性；

2、本发明从棉株内分离获得的内生根瘤菌dg3-1对棉花黄萎病菌(大丽轮枝菌)的抑菌防治率为56.63％。

3、本发明获得的根瘤菌dg3-1可以作为生防菌对棉花黄萎病菌进行防治，能够应用于棉花的大规模生产。

生物材料保藏信息说明

dg3-1，在本申请中称作根瘤菌dg3-1，已于2021年1月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：m2021122，保藏单位地址是中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，分类命名为根瘤菌属j(dg3-1)，rhizobiumspp.j(dg3-1)。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例分离获得的根瘤菌dg3-1的16srdna扩增结果图；

图2为本发明实施例分离获得的根瘤菌dg3-1对棉花黄萎病菌的防治效果图。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

本发明提供了一株抗棉花黄萎病的根瘤菌dg3-1及其用途。

具体实施例如下：

实施例1

一、材料

(1)供试病原菌为大丽轮枝菌(verticilliumdahliaekleb)，由植保专业病理实验室提供；

(2)培养基

na培养基(g/l)：牛肉膏3g/l，蛋白胨10g/l，氯化纳5g/l，琼脂15g/l，水1l，ph7.3±0.1。

lb培养基(g/l)：胰蛋白胨10gl，酵母提取物5gl，琼脂粉15g/l，氯化钠10g/l，水1l。

pda培养基(g/l)：马铃薯200g/l，葡糖糖20g/l，琼脂15g/l，水1l，自然ph。

(3)供试棉株

选择新疆阿拉尔农科所实验站的棉株为样本，品种为新陆中70，采用五点取样法分别采集棉田中发病棉株和健康棉株，装入密封袋中，置于6℃冰箱保存备用。

(4)主要试剂和仪器

试剂：taqmastermix；16srdna基因通用引物27f/1492r；琼脂糖。

仪器：pcr扩增引物、2×tsingkematermix恒温培养振荡器；pcr仪；电泳仪和凝胶成像分析仪。

二、内生拮抗细菌的分离

(1)将采集的棉株用灭菌后的剪刀分成根茎叶三部分，用自来水进行清洗，洗去表面灰尘及土壤，洗净晾干后放入超净工作台内，将茎切成2-3cm左右小段，并用灭菌后的手术刀剖成两半，根切成3-5cm左右，叶切成3cm左右方块，按下列方法进行消毒处理；

根、叶：在75％乙醇中浸泡30s，灭菌水冲洗2-3次，再放入3％naclo溶液中浸泡5min，再用无菌蒸馏水冲洗2-3次；

茎：在75％乙醇中浸泡30s，灭菌水冲洗2-3次，再放入3％naclo溶液中浸泡5min，再用无菌蒸馏水冲洗2-3次。

(2)取最后一次洗涤蒸馏水涂于na固体培养基作为对照，以确定棉株表面消毒是否彻底。

(3)处理好的样品分别按每皿五块组织，一株样品根、茎、叶各一个培养基；

放入植物组织的na培养基放入27℃培养箱中，12h观察一次，待看到菌落长出及时分离纯化。

三、病原菌平板制作

打菌饼：7mm打孔挑取大丽轮枝菌菌饼接种到pda培养基正中央，置于25℃恒温培养箱中培养。

点接：挑取大丽轮之菌菌丝接于pda培养基正中央，置于25℃恒温培养箱中培养。

四、拮抗菌的筛选、鉴定

(1)初筛：采用平板对峙法筛选拮抗细菌，把上述过程中分离得到的细菌点接种在生长良好的病原菌平板上，每个平板点接4个，静置20-30min，倒置于27℃恒温培养，5-7d后观察是否有抑菌圈产生，记录产生抑菌圈的菌株并测量抑菌圈直径，筛选出对病原菌有拮抗作用的菌株，获得根瘤菌dg3-1；

(2)复筛：采用打孔法进行复筛；

从大丽轮枝菌平板上打孔7mm的菌饼，三块，接入250ml的pda培养基中，28℃，120r/min振荡6d，发酵液用四层无菌纱布过滤，滤液用无菌水稀释四个浓度梯度，采用血球板计数法计算，获得1×10⁵个/ml的大丽轮枝菌孢子悬浮液，将复筛菌株接入液体lb培养基中，28℃，120r/min振荡1d得发酵液，取100μl、1×10⁵个/ml的大丽轮枝菌菌悬液涂布pda平板上，在距培养基中心20mm处对称用打孔器打2个7mm的孔，每孔内加入150μl的菌株发酵液，以加入无菌水为对照，25℃培养3d，测量抑菌圈(如图2所示)。

(3)根瘤菌dg3-1的16srdna鉴定

提取根瘤菌dg3-1的dna；

然后利用通用引物27f：5′-agagtttgatcctggctcag-3′和1492r：5′-acggctaccttgttacgactt-3′对其进行pcr扩增，扩增结果如图1所示；

25μlpcr反应体系：taqmastermix12.5μl12.5μl，dna模板1μl，27f/1492r引物(10μmol/l)各0.5μl，ddh2o10.5μl。pcr反应条件：94℃3min；94℃30s，51℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min。pcr产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测，目标条带送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，最终通过系统发育比对分析鉴定为dg3-1菌株为根瘤菌。

如图2所示，本发明分离获得的棉花内生菌为根瘤菌dg3-1，对棉花黄萎病菌(大丽轮枝菌)具有高效的拮抗作用，通过抑菌率可以得出其对棉花黄萎病防治率为56.63％。

抑菌率计算过程为：

抑菌率＝(对照大丽轮枝菌菌落半径-处理大丽轮枝菌菌落半径)/对照大丽轮枝菌菌落半径×100％

本发明中对照组菌落平均半径为3.52cm，三个处理组平均半径分别为1.50cm，1.48cm，1.60cm；抑菌率分别为57.39％，57.95％，54.55％，最终抑菌率为56.63％。

(4)根瘤菌dg3-1生防菌剂的制备

将所述根瘤菌dg3-1接种于lb液体培养基中，28℃，180r/min振荡4d，获得的细菌发酵液即为根瘤菌dg3-1生防菌剂，活菌数为8ⅹ10⁷cfu/ml。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。