一株阿泽拉霉新种及其应用

本发明属于微生物应用技术领域，具体涉及一株阿泽拉霉新种及其应用。

背景技术：

真菌是一种重要的天然资源，它可以产生纤维素降解酶，也可以产生大量的抗菌化合物。例如，森林凋落物中富含木质纤维素，它们在自然界的降解主要依赖于真菌等微生物产生木质纤维素降解酶。抗菌化合物方面，真菌可以产生青霉素、灰黄霉素、棘白菌素等著名抗生素。目前发现的真菌超过148000种，其中大部分真菌还未被充分开发利用。目前纤维素降解酶及抗菌化合物的商业化真菌，主要集中在木霉属(trichoderma)、青霉属(penicillium)、曲霉属(aspergillus)等少数菌属真菌。每年有超过2000种真菌新种被报道，它们的产纤维素降解酶或抗菌化合物的能力也值得被筛选。

目前应用的纤维素降解酶生产菌主要集中在几个属中，而且尝试利用了多种方法激发其潜能。即使如此，每年还有大量的富含纤维素的可再生资源被浪费，说明产纤维酶真菌研究还有待进一步提高。目前有大量真菌资源未被研究利用，寻找新型产纤维酶真菌作为替代资源，有望进一步提高纤维素资源的利用率。

阿泽拉霉属(arxiella)真菌属于座囊菌纲(dothideomycetes)，最初于1967年分离自森林凋落物，该属真菌的典型的形态学特点是可以产生独特的舟形孢子，并且孢子末端有斜尖角。目前该属包含：陆生阿泽拉霉(arxiellaterrestris)，鹰爪藤阿泽拉霉(arxielladolichandrae)和月孢阿泽拉霉(arxiellalunata)三个种。陆生阿泽拉霉(arxiellaterrestris)是该属最早被发现的物种，被报道具有果胶酶活性及蛋白酶活性，但该菌不具有纤维素分解活性(jacobm.studiesondiversity,ecologyandactivityofthemicrofungiassociatedwithficusbenghalensislinn.andcarissacongestawightfromgoastate[d].goauniversity,2000.)，目前尚未发现该属真菌具有抗真菌活性。

技术实现要素：

本发明为了寻找新的具有产纤维素酶能力及抗菌活性的真菌，提供了一株阿泽拉霉新种，所述阿泽拉霉的菌株编号为sgsf303，将其命名为长孢阿泽拉霉(arxiellalongispora),所述阿泽拉霉的分类命名为arxiellasp.sgsf303，于2021年1月18日保藏在位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：m2021101。

进一步地限定，所述阿泽拉霉分离自大兴安岭森林林下凋落物。

本发明还提供了阿泽拉霉在农业废弃物纤维素降解或与纤维素降解利用相关的堆肥过程中的应用。

所述的阿泽拉霉在防治立枯丝核菌中的应用。

所述的阿泽拉霉在生产纤维素酶中的应用。

进一步地限定，上述应用为利用麸皮诱导所述阿泽拉霉产生纤维素酶。

优化地，生产纤维素酶的培养基配方的组成为麸皮15g，蛋白胨5g，磷酸二氢钾2g和水1l。

本发明还提供了所述的阿泽拉霉在生产抗菌化合物中的应用。

进一步地限定，上述应用为利用烟酰胺诱导所述阿泽拉霉产生抗立枯丝核菌的化合物。

有益效果

本发明通过对大兴安岭森林林下凋落物进行分离，得到了一株阿泽拉霉属的一个新种sgsf303，通过实验证明该菌株兼具较好的纤维素降解活性及抗真菌活性。在产纤维素酶方面，诱导该菌株产纤维素酶的最佳碳源为麸皮，最佳氮源为蛋白胨。其中，当麸皮作为发酵底物时，酶活力提高约2倍以上，并且其内切酶产量相对较高，具体酶活：内切酶活力达0.86u/ml，外切酶活力达0.58u/ml，β-葡萄糖苷酶活力0.26u/ml，滤纸酶活力为0.32u/ml。抗菌活性方面，该菌可以在烟酰胺诱导下产生抗立枯丝核菌的活性化合物。

附图说明

图1.不同培养条件对sgsf303菌落生长的影响，其中，图1中的a为不同温度对sgsf303菌落生长的影响；图1中的b为不同ph值对sgsf303菌落生长的影响；

图2.菌株sgsf303形态特征，其中图2中的a(1)为菌落正面；图2中的a(2)为菌落反面；图2中的b为菌丝及孢子特征，标尺：20μm；

图3.不同碳、氮源对菌株sgsf303产纤维素酶的影响，其中，图3中的a为添加不同碳源(1.5％)培养第5d菌株sgsf303纤维素酶生产情况，添加不同氮源(0.5％)培养第5d菌株sgsf303纤维素酶生产情况，柱形图上不同字母表示同一种酶不同培养基诱导产生纤维素酶差异显著(p<0.05)。

具体实施方式

以下结合具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

按以下培养基配方配制培养基备用：

(1)马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potatodextroseagar，pda)：马铃薯200g20min沸水浸提液，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水定容至1l。

(2)玉米粉琼脂培养基(cornmealagar，cma)：玉米粉60g，琼脂20g，蒸馏水定容至1l。

(3)燕麦培养基(oatmealagar，oa)：燕麦30g1h沸水浸提液，琼脂20g，蒸馏水定容至1l。

(4)麦芽浸粉培养基(maltextractagar，mea)：麦芽浸粉40g，琼脂20g，蒸馏水定容至1l。

(5)筛选培养基：羧甲基纤维素钠15g，氯化钠5g，磷酸二氢钾1g，七水硫酸镁0.2g，蛋白胨10g，酵母浸粉5g，琼脂20g，蒸馏水定容至1l。

(6)马铃薯葡萄糖液体培养基(potatodextrosebroth，pdb)：马铃薯200g20min沸水浸提液，葡萄糖20g，蒸馏水定容至1l。

(7)滤纸降解实验液体培养基：磷酸二氢钾1g，氯化钠0.1g，七水硫酸镁0.3g，硝酸钠2.5g，氯化铁0.01g，无水氯化钙0.1g，1cm×6cm滤纸条若干，蒸馏水定容至1l。

(8)产酶基础培养基：羧甲基纤维素钠15g，酵母浸粉5g，磷酸二氢钾2g，蒸馏水定容至1l。

(9)麦芽糖酵母浸粉培养基(sabouraudmaltoseyeastextractagar，smya)：蛋白胨10g，麦芽糖40g，琼脂4g，酵母浸粉10g，蒸馏水定容至1l。

(10)lb琼脂培养基(luriabertaniagar，lba)：氯化钠5g，胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，琼脂15g，加水定容至1l。

(11)pdb+烟酰胺(pdbplusnicotinamide，p+nic)：马铃薯200g20min沸水浸提液，葡萄糖20g，烟酰胺0.2g，蒸馏水定容至1l。

实施例1、阿泽拉霉sgsf303的分离与鉴定

(1)阿泽拉霉sgsf303的分离

以从大兴安岭森林采集的林下凋落物为分离源，进行菌株的分离。首先将采集到的凋落物样品经风干后粉碎成100–200μm的颗粒状，然后将颗粒用无菌水冲洗离心，以1％羧甲基纤维素钠(cmc-na)溶液制成颗粒悬浮液；再利用稀释涂布平板法将不同浓度的颗粒悬浮液50μl加在1/4pda培养基(琼脂外其他组分稀释至1/4)，并用涂布器将颗粒均匀涂布在培养基上；于25℃条件下进行培养，培养期间每12h观察一次，待真菌菌落长出，将菌落挑取至pda平板，进行纯化并保存于斜面中。经纯化培养得到一株真菌，将其编号为sgsf303。

(2)测试不同培养基、温度及ph值对sgsf303菌落生长的影响

将菌株sgsf303接种在4种不同培养基(pda、cma、oa、mea)上对其进行不同培养基对菌落生长速率的测定；将菌株sgsf303接种在pda培养基上，分别于15℃、20℃、25℃、30℃和35℃进行培养并对菌落生长速率进行测定；将菌株sgsf303分别接种在ph值为4、5、6、7、8、9和10的pda培养基上并对菌落生长速率进行测定。菌落生长速率的测定方法为利用十字交叉法测定菌落直径(除去接种菌饼直径6mm)。

测试结果如图1所示，表明菌株sgsf303在pda培养基上生长的最适温度为20–25℃，培养温度为30℃时或更高时生长速度下降明显，在15℃生长速率减慢但优于30℃。相比于温度的影响，不同ph值对菌落生长影响较小，ph值为5–10时相对生长较快，在ph值为4时生长速度下降明显。

(3)阿泽拉霉sgsf303的形态学鉴定

将菌株sgsf303接种在pda培养基上，在25℃下暗培养，利用体视显微镜观察真菌菌落，用光学显微镜拍摄其产孢细胞及孢子等结构。

菌株sgsf303在pda培养基上的菌落形态如图2中的a所示，光学显微镜拍摄的其形态如图2中的b所示，观察可知，菌落培养特征为菌落初期均呈白色，后期菌落内呈现环状褐色或深灰褐色，外边缘为米白色，菌落全缘或具有波纹；菌落背面为深棕色，有褶皱。菌丝与孢子的特征为：初生菌丝透明、疏松、具有分支，直径1.5μm–3μm，老菌丝为棕色、有隔、厚壁且部分膨大，直径为2μm–5μm。产孢细胞为球形或卵球形，孢子为透明、舟形，偶有相连，中间具有0–1个分隔，其大小为(14–22)μm×(3–4)μm，长度超过20μm，最大至24μm，平均长宽比大于5μm。未发现厚垣孢子。

根据菌株sgsf303产生舟形分生孢子等特点可知该菌株属于阿泽拉霉属(arxiellasp.)真菌。但是其孢子大于所有已知阿泽拉霉(arxiellasp.)。

(4)阿泽拉霉sgsf303的分子生物学鉴定

首先利用ctab法对已纯化的菌株sgsf303进行总dna的提取，然后利用真菌通用引物its1和its4对内转录间隔区(internaltranscribedspacer，its)进行pcr扩增，用于分子生物学鉴定。pcr产物经电泳检测后，送至测序公司进行双向测序。将测序后获得的可信序列，利用ncbi网站的blast(basiclocalalignmentsearchtool，https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)进行比对分析，并利用mega7.0软件进行可信序列拼接及系统发生学分析。

菌株sgsf303的its序列的genbank登录号为mt921658。其its序列最相近的分类单元是陆生阿泽拉霉(arxiellaterrestris)，它们序列之间的相似性低于98％。此外sgsf303的its序列与鹰爪藤阿泽拉霉(arxielladolichandrae)及月孢阿泽拉霉(arxiellalunata)序列相似性为都低于90％。系统发生树分析，sgsf303号菌与陆生阿泽拉霉(arxiellaterrestris)、鹰爪藤阿泽拉霉(arxielladolichandrae)形成单系群。

阿泽拉霉属(arxiellasp.)目前包含3个物种，根据它们的分生孢子大小及dna序列分为陆生阿泽拉霉(arxiellaterrestris)、月孢阿泽拉霉(arxiellalunata)及鹰爪藤阿泽拉霉(arxielladolichadndrae)。将菌株sgsf303的形态学特征和分子生物学特征与其相似菌进行比较发现：阿泽拉霉属的菌株孢子都为舟形(底部平)或月亮形(底部弯曲)，但sgsf303的孢子大于这3个已知种，并且孢子更加长(平均长宽比大于5)。而陆生阿泽拉霉的舟形孢子大小为(6–16)μm×(3–4.5)μm，长宽比约为2.9；月孢阿泽拉霉的月孢形孢子大小为(10–17)μm×(3–4)μm，长宽比约为3.9；鹰爪藤阿泽拉霉的舟形孢子大小为(10–11)μm×(2.5–3)μm，长宽比约为3.8(ruscoeqw1970，crouspw2014)。根据上述对菌株sgsf303的its序列分析结果可知，其最相似的菌株为陆生阿泽拉霉，但sgsf303的孢子平均大小明显超过陆生阿泽拉霉，而且在pda培养基上，sgsf303的菌落呈现黑棕色与陆生阿泽拉霉的黑绿色有所不同。此外，经测试陆生阿泽拉霉不具有纤维素分解活性(papendorfmc,twonewgeneraofsoilfungifromsouthafrica[j].transactionsofthebritishmycologicalsociety,1967,50(1):69,in6-75,in6.)，(11.jacobm.studiesondiversity,ecologyandactivityofthemicrofungiassociatedwithficusbenghalensislinn.andcarissacongestawightfromgoastate[d].goauniversity,2000.)，但sgsf303具有纤维素降解活性。因此将菌株sgsf303鉴定为阿泽拉霉的一个新种，命名为长孢阿泽拉霉(arxiellalongispora)，并将其保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccm2021101。

实施例2、阿泽拉霉sgsf303在生产纤维素酶中的应用

(1)纤维素降解活性的定性测试

①刚果红染色试验

首先利用打孔器在菌落边缘处获得菌饼，接种至筛选培养基(羧甲基纤维素钠15g，氯化钠5g，磷酸二氢钾1g，七水硫酸镁0.2g，蛋白胨10g，酵母浸粉5g，琼脂20g，蒸馏水定容至1l)中，设置三次重复。将其置于25℃恒温培养箱中培养4d后，加入1mg/ml的刚果红溶液对筛选培养基染色，1h后倒出染液，并用流水冲洗1至2次，再加入1mol/l的nacl溶液浸没脱色30min。观察菌落生长情况、降解圈大小与透明程度，并记录降解圈直径(d/cm)与菌落直径(d/cm)，测定其纤维素降解活性。

结果表明，菌株sgsf303形成的降解圈清晰可见，且降解圈直径为1.54±0.27cm，菌落直径为0.86±0.06cm，降解圈与菌落直径比值为1.79±0.22，即在具有羧甲基纤维素钠的培养基上，该菌株可将长链的纤维素断裂，说明菌株sgsf303具有纤维素降解活性。

②滤纸条降解试验

采用改良滤纸条降解方法，用手术刀将pda中菌落切为若干个5mm×5mm的小块，接种于pdb液体培养基中，在25℃、转速180r/min条件下培养4d后，吸取3ml接种于50ml的无淀粉滤纸降解培养基中，在25℃、转速180r/min的条件下进行恒温摇床培养10d。设有添加等量无菌水作的空白对照，每天观察滤纸条断裂效果。

滤纸条降解试验结果表明，在接种菌株sgsf303的4d后滤纸条被降解成圆形小片，呈无定形状，10d后滤纸条呈糊状，具有较小的纤维分散悬浮在液体培养基中，说明其具有较强降解纤维素的潜力。

(2)不同碳、氮源对菌株sgsf303产纤维素酶的影响

采用液体培养制备粗酶液：分别将羧甲基纤维素钠、微晶纤维素、玉米芯粉、麸皮、稻草粉、玉米秸秆粉作为碳源，添加量为1.5％。除上述碳源外，还添加0.5％酵母浸粉(氮源)，0.2％磷酸二氢钾，制备成培养基。以6％的接种量将菌株sgsf303的pdb种子悬液接种于50ml的6种不同碳源产酶培养基，在250ml三角瓶中发酵。液体发酵条件为25℃转速180r/min下培养5d，然后将发酵液移至于灭菌的离心管中，4℃转速12000r/min条件下离心10min，并获取上清液，即得酶活反应所需粗酶液，通过下述方法测定酶活力。得到最优碳源后，利用酵母浸粉、蛋白胨、硝酸钠、硫酸铵、硝酸铵五种氮源，测定在其添加量为0.5％时，粗酶液的酶活力。

内切酶、外切酶、β-葡萄糖苷酶、滤纸酶酶活力的测定采用3,5-二硝基水杨酸(dns)测定还原糖的方法，具体步骤如下：分别用1ml的1％羧甲基纤维素钠溶液、1％微晶纤维素溶液、1％水杨苷溶液作为反应底物，添加0.5ml的ph4.8±0.05的0.05mol/l柠檬酸盐缓冲液(分别配置0.05mol/l的柠檬酸及柠檬酸钠溶液，按比例混配最终ph值为4.8±0.05)，加入适当稀释后的酶液0.5ml，50℃水浴30min后，立即加入1.5mldns试剂后沸水浴5min，冷水浴至室温后用蒸馏水定容，以等体积的灭活酶液参与反应作为空白对照测定酶活力。利用分光光度计在540nm处测定其吸光值，并记录。滤纸酶活力测定，以1cm×6cm新华一号滤纸条与1.5ml柠檬酸盐缓冲液作为反应底物，添加滤纸酶反应时间为60min，其余操作同上述酶的测定。根据行业标准qb-t2583-2003，参照葡萄糖标准曲线计算出葡萄糖含量，并依此计算对应的酶活力(darweshom,el-maraghysh,abdel-rahmanhm,etal.improvementofpaperwastesconversiontobioethanolusingnovelcellulosedegradingfungalisolate[j].fuel,2020,262:116518.)，(赵钰.产纤维素酶菌株的筛选及酶学性质研究[d].沈阳:沈阳农业大学,2017.)，(王学奎,黄见良.植物生理生化实验原理与技术[m].北京:高等教育出版社,2015.01.)。酶活力定义为：在50℃、ph值为4.8±0.05的条件下，每1ml酶液每1h水解底物，产生相当于1mg还原糖的量(以葡萄糖计算)，为1个酶活力单位，以u/ml表示。

计算公式为：

如图3中的a所示，不同基质羧甲基纤维素钠、微晶纤维素、玉米芯粉、麸皮、稻草粉、玉米秸秆粉对菌株sgsf303产酶具有显著影响，其中麸皮可以显著诱导sgsf303产生更多纤维素酶。当麸皮作为发酵底物时，菌株sgsf303产生的内切酶活力达0.86u/ml(与其他基质相比提高了2–4倍)，外切酶活力达0.58u/ml，β-葡萄糖苷酶活力0.26u/ml，滤纸酶活力为0.32u/ml。可见在筛选的碳源中，麸皮可以有效的提高真菌产纤维素酶的能力。以麸皮作为碳源测试了不同氮源对菌株sgsf303的产酶效果，由图3中的b可以看出，除了β-葡萄糖苷酶外(nano3最优)，以蛋白胨产酶效果优于其他氮源。由此，得到了生产纤维素酶的培养基配方，该配方由如下组成制备：麸皮15g，蛋白胨5g，磷酸二氢钾2g和水1l。

实施例3、阿泽拉霉sgsf303在生产抗菌化合物中的应用

抗菌活性测定

提取物制备方法如下：将菌饼接种于smya培养基(种子发酵培养基)，在25℃转速为180r/min的条件下培养3d。分别在液体培养基pdb或p+nic中加入0.5ml的种子发酵液，培养发酵14d。发酵结束后，加入发酵量两倍体积的乙酸乙酯，浸泡24h，将过滤后的提取液减压浓缩得到粗提物。将粗提物溶于10％二甲基亚砜(dmso)中，于4℃冰箱中保存。

抗菌活性测定方法如下：利用打孔药剂扩散法。将含有测试细菌的lba培养基倒入培养皿中，待其凝固后，用无菌打孔器打5个孔。或将真菌接种至pda平板中央，均匀在平板四周打5个孔。分别在孔中加入6mg/ml真菌粗提物溶液、溶剂对照为10％dmso、阳性对照为6mg/ml两性霉素溶液。每组实验均设置三组重复。放入25℃培养箱中，每日观察记录结果。

表3.菌株sgsf303的抗菌活性

注：“–”表示无抑制效果；“+”表示具有抑菌效果；pdb代表pdb培养基发酵粗提物；p+nic代表pdb添加烟酰胺发酵粗提物。

菌株sgsf303抗菌活性的初步筛选结果如表3所示，该菌株两种培养基的发酵产物对供试细菌均不存在抑制能力，同时发现p+nic培养基发酵粗提物对真菌立枯丝核菌具有一定的抑制作用，浓度为3mg/ml～6mg/ml时，具有明显抗菌活性，而pdb培养基发酵粗提物不具有的抗菌活性，并且同批次筛选的其它菌株的p+nic粗提物不具有该活性。说明烟酰胺可以激活菌株sgsf303产生具有抗菌活性的次生代谢产物，即菌株sgsf303可以产生抗菌化合物。

对比目前已知阿泽拉霉属真菌的抗菌活性，发现菌株sgsf303是该属第一个具有抗真菌活性的菌株，其它阿泽拉霉未见抗真菌活性的报道。