一种深海偏顶蛤抗菌蛋白及其应用的制作方法

本发明属于应用海洋生物
技术领域：
，具体涉及一种深海偏顶蛤抗菌蛋白及其应用。
背景技术：
：抗菌肽和抗菌蛋白的产生是真核生物防御宿主的重要手段。较大的抗菌蛋白，含有超过100个氨基酸，通常是裂解酶、营养结合蛋白或含有针对特定微生物大分子的位点。较小的抗菌肽主要通过破坏微生物细胞膜的结构或功能来发挥作用。从软体动物到人类，在多细胞动物的上皮层、吞噬细胞和体液中发现了数百种抗菌肽。深海偏顶蛤(bathymodiolusplatifrons)又称深海贻贝，是西太平洋很多热液和冷泉环境共有的优势种。在长期的适应性进化过程中，深海生物通过各种方式逐渐适应这些深海环境条件。随着对深海生物的探究不断的深入，依赖先天免疫系统抵抗病原入侵的深海偏顶蛤中蕴含了大量未知的抗菌蛋白和抗菌肽序列，是一个丰富的天然抗菌肽资源库。此外，根据深海生物的生存适应性需要，深海偏顶蛤来源的天然多肽可能也具有不同于普通贝类抗菌肽的特征。技术实现要素：本发明的目的是提供一种具有广谱抗菌效应的新型深海偏顶蛤抗菌蛋白bpl-uamp24-134，其具有显著的抗菌潜力，对海洋性细菌具有广谱抗菌效应。本发明的深海偏顶蛤抗菌蛋白bpl-uamp24-134，其氨基酸序列如seqidno.1的第24位-第134位所示。本发明的第二个目的是提供所述的深海偏顶蛤抗菌蛋白bpl-uamp24-134在制备抗细菌或真菌药物中的应用。所述的细菌为革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。所述的革兰氏阳性菌为痤疮丙酸杆菌或金黄色葡萄球菌。所述的革兰氏阴性菌为副溶血弧菌或大肠杆菌。本发明的第三个目的是提供一种抗菌药物，其含有所述的深海偏顶蛤抗菌蛋白bpl-uamp24-134作为活性成分。所述的抗菌药物是治疗海洋性细菌感染性疾病的药物。本发明通过全基因组比对，获得具有抗菌潜力的深海偏顶蛤抗菌蛋白bpl-uamp1，接着构建酵母表达系统获得新型深海偏顶蛤抗菌蛋白bpl-uamp24-134，对获得的抗菌蛋白bpl-uamp24-134进行抗菌检测，发现其具有广谱的抗菌效应。新型深海偏顶蛤抗菌蛋白bpl-uamp24-134对副溶血弧菌(vibrioparahaemolyticus)的抑菌ic50为1.998μm；痤疮丙酸杆菌(propionibacteriumacnes)的抑菌ic50为2.543μm；对大肠杆菌(escherichiacoli)的抑菌ic50为1.564μm；对金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)的抑菌ic50为5.334μm。同时，耐温实验证明深海偏顶蛤来源的抗菌蛋白在长时间高温处理后依然保持高效的杀菌活性。此外，抗菌蛋白bpl-uamp24-134对细胞毒性极低，高剂量口服也不会造成小鼠死亡。本发明不仅为进一步了解深海偏顶蛤抗菌系统，提供其应用价值奠定了基础，还为研制新型抗菌药物提供了一种新的途径。附图说明图1是深海偏顶蛤抗菌蛋白bpl-uamp1的序列分析；方框标注信号肽序列，灰色背景标注抗菌活性蛋白。图2是酵母表达系统的构建；a，转化平板图；b，pcr分析阳性克隆，m：dna标准品从下到上100、200、500、750、1000、1500、2000bp，1：阳性质粒，2-11：10株菌株，12：阴性对照。图3是蛋白表达鉴定wb分析；a，阳性菌株1#；b，阳性菌株3#；c，阳性菌株4#；d：阳性菌株5#；其中，m：蛋白标准品，1：gs115菌株培养72小时分泌上清，2：阳性菌株培养0小时分泌上清，3：阳性菌株培养24小时分泌上清，4：阳性菌株培养48小时分泌上清，5：阳性菌株培养72小时分泌上清，6：阳性菌株培养96小时分泌上清，7：阳性菌株培养120小时分泌上清。图4是抗菌蛋白bpl-uamp24-134对微生物的抑制作用；a，vibrioparahaemolyticus，副溶血弧菌，革兰氏阴性细菌；b，propionibacteriumacnes，痤疮丙酸杆菌，革兰氏阳性细菌；c，escherichiacoli，大肠杆菌，革兰氏阴性细菌；d，staphylococcusaureus，金黄色葡萄球菌，革兰氏阳性细菌；其中，1：pbs，2：氨苄青霉素，3：bpl-uamp24-134。图5是不同浓度抗菌蛋白bpl-uamp24-134对微生物的清除作用。图6是抗菌蛋白bpl-uamp24-134的耐温测试；a,bpl-uamp24-134孵育；b，pbs孵育。图7是bpl-uamp24-134生物毒性测试；a.新型深海偏顶蛤抗菌蛋白bpl-uamp24-134刺激条件下，动物细胞内ldh的释放指示细胞存活情况，表明天然抗菌肽bpl-uamp24-134对动物细胞的低毒性；b，新型深海偏顶蛤抗菌蛋白bpl-uamp24-134对小鼠气管灌注后的存活率，所测试的几个浓度均不影响小鼠的存活。具体实施方式以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。实施例1：深海偏顶蛤抗菌蛋白鉴定及酵母表达系统的构建1.深海偏顶蛤抗菌蛋白bpl-uamp1的鉴定全基因组比对，获得深海偏顶蛤具有潜在抗菌活性的蛋白bpl-uamp1，其氨基酸序列如seqidno.1所示。采用在线抗菌肽预测软件ampa(http://tcoffee.crg.cat/apps/ampa/do)对bpl-uamp1的蛋白序列进行分析，如图1所示，其包含有信号肽序列，位于1-23位氨基酸，两段具有抗菌活性的蛋白，分别位于47-66和92-106位氨基酸；由此获得具有抗菌活性的蛋白bpl-uamp24-134(其氨基酸序列如seqidno.1的第24位-第134位所示)，根据该氨基酸序列获取对应的编码dna序列(其核苷酸序列如seqidno.2所示)用于构建酵母表达系统。2.电转毕赤酵母细胞gs115冰浴电转杯，将10μlsaci线性化重组质粒ppic9k-bpl-uamp24-134(其中质粒中插入的编码dna序列的核苷酸序列如seqidno.3所示)加入到装有80μl毕赤酵母感受态细胞的1.5mlep管内，混匀转移至直径为0.2cm电转化杯中，然后把电转杯冰浴5min。电击条件为：电压1.5kv，电容25μf，电阻200ω，电击时间为4～10msec。电击完成后，将650μl冰上预冷的浓度为1m山梨醇溶液加入到电击转化杯里，用枪头轻轻地吹打溶液均匀。把电转杯中的全部液体转移到新的2mlep管中，30℃静置培养2h。低速离心收集菌体，全部涂布于md平板上，30℃恒温培养3-4d，结果如图2a所示；获得阳性克隆。3.pcr鉴定阳性克隆菌株待平板长出菌落，用接种环挑取平板上生长的单菌，将它接入到装有500μlypd液体培养基离心管，30℃，180r/min过夜培养。挑选10株克隆，使用载体上引物pcr鉴定，结果如图2b所示；鉴定确认获得阳性菌株。4.诱导表达取鉴定的阳性菌株1#、3#、4#、5#，50μl接入装有10mlbmgy培养基的锥形瓶中，30℃，220r/min过夜培养，摇至od600＝2-6(对数生长，大约16-18h)；室温离心5000r/min离心5min，收集细胞，去除上清，用10mlbmmy培养基重悬细胞，进行诱导表达；每24h从培养基中取样1ml，并加甲醇至终浓度0.5％继续诱导；以下各时间点0，24，48，72，96，120h样品10000r/min离心2min上清待检测。5.westernblotting检测取上清样品上样25μl；上样完毕后，聚丙烯酰胺凝胶先90v跑完积层胶，再将电压升至200v直到电泳结束。电泳结束后，取下凝胶进行转膜，恒压100v转膜，约为1.5h，恒流250ma。电转结束后，取下膜后先用pbst洗涤4次，每次5min。将膜置于5％脱脂奶粉封闭液中封闭37℃1h。用封闭液稀释一抗，膜在一抗稀释液中4℃过夜。次日将膜取出后用pbst洗膜4次，每次5min。用含5％牛奶的封闭液稀释二抗，膜在二抗中37℃反应1h。反应完毕后，把膜取出后置于干净的盒子中洗膜4次，每次5min。ecl显影，曝光结果如图3所示。说明阳性菌株1#、3#、4#菌都能表达分泌蛋白bpl-uamp24-134。实施例2：深海偏顶蛤抗菌蛋白bpl-uamp24-134的抑菌效果1.抑菌圈实验试验细菌分别为：a，vibrioparahaemolyticus，副溶血弧菌，革兰氏阴性细菌；b，propionibacteriumacnes，痤疮丙酸杆菌，革兰氏阳性细菌；c，escherichiacoli，大肠杆菌，革兰氏阴性细菌；d，staphylococcusaureus，金黄色葡萄球菌，革兰氏阳性细菌。在lb固体培养基上均匀涂布100μl稀释200倍的菌液。在平板上用打孔器在合适位置打三个孔，分别加入100μl阴性对照(pbs)、阳性对照(氨苄青霉素)和待测抗菌蛋白bpl-uamp24-134(200μm)。在37℃恒温培养箱培养过夜，结果如图4所示；说明抗菌蛋白bpl-uamp24-134具有广谱的抗菌效应。2.抗菌蛋白bpl-uamp24-134的细菌清除能力分析试验细菌分别为：a，vibrioparahaemolyticus，副溶血弧菌，革兰氏阴性细菌；b，propionibacteriumacnes，痤疮丙酸杆菌，革兰氏阳性细菌；c，escherichiacoli，大肠杆菌，革兰氏阴性细菌；d，staphylococcusaureus，金黄色葡萄球菌，革兰氏阳性细菌。抗菌肽对细菌的抑制能力采用涂平板法，具体操作如下：(1)在相应培养条件下对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌摇菌，培养至od600为0.2；(2)通过低速离心收集细菌，然后用tris缓冲液(50mm，ph8.0)洗涤3次，然后重悬于1mlpbs中以进行后续分析；(3)在室温下，用准备好的细菌与不同浓度(0、0.5、1、2、5、10、20和50μm)的抗菌蛋白bpl-uamp24-134共同孵育2h；(4)将50μl抗菌肽和细菌的混合液接种于lb琼脂平板上过夜培养，对平板上的菌落数进行计数，计算抑制率，结果如图5所示。深海偏顶蛤抗菌蛋白bpl-uamp24-134对副溶血弧菌(vibrioparahaemolyticus)的抑菌ic50为1.998μm；痤疮丙酸杆菌(propionibacteriumacnes)的抑菌ic50为2.543μm；对大肠杆菌(escherichiacoli)的抑菌ic50为1.564μm；对金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)的抑菌ic50为5.334μm。3.抗菌蛋白bpl-uamp24-134耐温实验将抗菌蛋白bpl-uamp24-134在37℃放置四天后，对金黄色葡萄球菌做孵育杀菌实验。即取200μl未稀释菌液与200μl抗菌肽和200μlpbs(阴性对照)加入1.5ml离心管中，在37℃恒温培养箱中孵育30min。分别取100μl的孵育液均匀涂布与lb固体培养基上。在37℃恒温培养箱培养过夜，结果如图6所示；耐温实验证明深海偏顶蛤来源的抗菌蛋白bpl-uamp24-134在长时间高温处理后依然保持高效的杀菌活性。4.天然抗菌蛋白bpl-uamp24-134的动物细胞毒性分析天然抗菌蛋白bpl-uamp24-134与动物细胞hek293共孵育，具体操作如下：(1)hek293t细胞培养于含10％胎牛血清以及10％双抗的dmem培养基，培养的条件为37℃，5％co2，饱和湿度，维持单层贴壁生长；(2)细胞在无血清条件下培养过夜，用抗菌蛋白bpl-uamp24-134(20um)处理；(3)24h后，通过测定乳酸脱氢酶(ldh)的释放量来评估bpl-uamp24-134对细胞的毒性，结果如图7a所示；说明抗菌蛋白bpl-uamp24-134对细胞毒性极低。5.天然抗菌蛋白bpl-uamp24-134对小鼠的毒性分析小鼠气管灌注抗菌蛋白bpl-uamp24-134(蛋白的溶剂为pbs)，每只注射50μl。对照组小鼠注射50μlpbs，6小时后再次灌注；以二次灌注后的时间为起始时间，持续观察24h小时，记录每组小鼠，死亡数量和死亡时间。实验组设置如表1所示，分别为4组实验组，加上对照共5组，每组10只小鼠，结果如图7b所示；说明高剂量口服也不会造成小鼠死亡。表1小鼠气管灌注方案序号注射体积一只mice的体重注射浓度(mg/kg)150ul20g0mg/kg250ul20g1mg/kg350ul20g2mg/kg450ul20g5mg/kg550ul20g10mg/kg序列表<110>广东佰欧斐丝细胞科研中心有限公司<120>一种深海偏顶蛤抗菌蛋白及其应用<160>3<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>134<212>prt<213>深海偏顶蛤(bathymodiolusplatifrons)<400>1metserserphelysphethrphecysvalilealaalaleuleuthr151015ilevalalavalvalasnserglnthrasncysglyvalglyserala202530alacysaspargcysglyalaasnserthrileleuglnvalasngly354045argglyilelysvalcyscyslyssercysserglytyrtyrargala505560glytyrargaspthralaargargvalglyprotyrcyssercysthr65707580tyrasplysvalglyglyaspcystrplysglyaspilecyslysthr859095cysglyhisglytyrvalglyargileasnglyleuprovalcyscys100105110glnasncysglulysserglyleutyrleuserprothrlyscysasn115120125cysleuhisasnglypro130<210>2<211>405<212>dna<213>深海偏顶蛤(bathymodiolusplatifrons)<400>2atgagttccttcaagttcacattctgtgttattgcagcacttcttacaattgtggcagta60gtcaacagccaaacaaactgtggcgttggttcagctgcttgtgatagatgtggagccaac120agtaccattctgcaggtaaacggtcgaggtataaaggtgtgctgtaaaagctgtagcgga180tattacagagcaggttacagggacacagctcgtcgagttggaccttattgtagttgtaca240tatgacaaagtgggaggagattgctggaagggagacatatgtaaaacctgtggtcatggt300tacgtcggaagaatcaatggacttccagtatgttgccaaaactgtgaaaagagtgggctt360tacttgtctcctacaaagtgcaattgcttacacaatggaccttaa405<210>3<211>336<212>dna<213>深海偏顶蛤(bathymodiolusplatifrons)<400>3caaacaaactgtggcgttggttcagctgcttgtgatagatgtggagccaacagtaccatt60ctgcaggtaaacggtcgaggtataaaggtgtgctgtaaaagctgtagcggatattacaga120gcaggttacagggacacagctcgtcgagttggaccttattgtagttgtacatatgacaaa180gtgggaggagattgctggaagggagacatatgtaaaacctgtggtcatggttacgtcgga240agaatcaatggacttccagtatgttgccaaaactgtgaaaagagtgggctttacttgtct300cctacaaagtgcaattgcttacacaatggaccttaa336当前第1页12