一种硫负离子荧光探针材料及其制备方法和应用

本发明属于新材料领域，具体涉及一种硫负离子荧光探针材料及其制备方法和应用。

背景技术：

硫负离子是生物系统中常见的副产物，其是通过厌氧细菌微生物还原硫酸盐并在肉类蛋白质中形成含硫氨基酸而产生的。硫负离子广泛用于工业过程中，其作用包括转化为硫和硫酸、染料和化妆品的制备、木浆的生产等。然而，硫负离子具有较强的毒性，即使在低浓度下也被认为是有毒的常见阴离子之一。若在水中浓度过高，可能会引起粘膜刺激，昏迷和呼吸麻痹。因此，有必要通过有效的手段，来检测水性介质和生物系统中的硫负离子。

传统的用于检测硫负离子的方法，包括滴定法、荧光法、分光光度法等。与传统的方法相比，荧光探针具有灵敏度高、操作方便、响应速度快等优势。在近期的相关技术中，已经报道了许多基于支架的硫负离子的荧光探针，包括香豆素、异腈、氟硼吡咯、季吡啶盐、半胱氨酸、苯并吡喃二甲腈、萘乙酰胺等。

然而，由于硫负离子的强水合特性，会削弱传感器与目标阴离子之间的相互作用。上述物质所形成的硫负离子的荧光探针，应用于期望获得高选择性、高灵敏度的荧光传感器中，仍然存在较大难度和挑战；此外，为了获得最佳的检测效果，非常需要在水性介质中用于硫负离子的快速响应的特性，而上述物质作为硫负离子的荧光探针时，在这一特性上也有欠缺。

因此，亟需找到一种新材料，其应用于硫负离子荧光探针材料上形成硫负离子的荧光探针，能够具有高选择性、高灵敏度以及快速响应的特点。

技术实现要素：

本发明公开了一种硫负离子荧光探针材料，具有高选择性、高灵敏度以及快速响应的特点。本发明还公开了上述硫负离子荧光探针材料的制备方法以及在生物成像中的应用。

本发明的一个目的在于提供一种硫负离子荧光探针材料，其通过以下技术手段得以实现：

一种硫负离子荧光探针材料，所述硫负离子荧光探针材料具有以下结构通式：

其中，r1和r2独立地选自c1-c22的烷基，

所述烷基选自直链烷基或支链烷基。

该硫负离子荧光探针材料的分子结构设计中，席夫碱可以对硫负离子形成特异性识别，其机理为亲电加成；酚羟基可以为硫负离子荧光探针材料提供良好的水溶性；噻唑、乙烯氰基通过分子间电荷转移效应形成红色荧光。

其对s^2-具有特异识别性，在纯水溶液状态下具有良好的荧光效果和特异选择性。应用于活细胞和斑马鱼幼虫中的硫化物阴离子检测，可以通过肉眼观察到明显的荧光识别现象。

进一步地，所述r1和所述r2均为甲基。

本发明的另一个目的在于提供上述硫负离子荧光探针材料的制备方法，其通过以下技术手段得以实现：

上述硫负离子荧光探针材料的制备方法，其包括如下步骤：

s1.将单体a和对羟基苯甲醛溶于醇中，加入哌啶和酸，回流反应，然后将混合物倒入水中，过滤后取滤渣并提纯，得到化合物1；

s2.将所述化合物1溶于三氟乙酸中，然后加入六亚甲基四胺，回流反应，然后将混合物倒入水中，过滤后取滤渣并提纯，得到化合物2；

s3.将化合物2和苯并[d]噻唑-2-胺溶于醇中，回流反应，然后将混合物提纯，得到产物；

其中，所述单体a具有以下结构通式：

进一步地，所述酸选自有机羧酸。

进一步地，所述醇选自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇的一种或多种。

进一步地，步骤s1中，所述回流反应的时间为4-12h。

进一步地，步骤s2中，所述回流反应的时间为1-3h。

进一步地，步骤s3中，所述回流反应的时间为4-12h。

本发明的另一个目的在于提供上述硫负离子荧光探针材料在生物成像中的应用。

本发明的发生特异性反应位点为席夫碱，硫负离子具有双重亲核加成特性，即碳氮双键能与硫负离子发生特异性加成反应，相对于其他负离子和小分子，可以实现高的选择性。其有益效果在于：

1.本发明所得的硫负离子荧光探针材料具有良好的水溶性，因此可以在较宽的近红外区域实现发光，从而应用于生物成像中；

2.本发明所得的硫负离子荧光探针材料，成功地应用于活细胞和斑马鱼幼虫中的硫化物阴离子检测，可以观察到明显的荧光识别现象，具有高选择性、高灵敏度以及快速响应的特点。

附图说明

图1为实施例1的bzem的氢谱图。

图2为实施例1的bzem的各个水溶液q和水溶液p混合后所得的混合溶液的发射光谱图。

图3为实施例1的bzem的各个水溶液k和水溶液w，在675nm处的荧光响应对比图。

图4为实施例1的bzem的水溶液加入到一系列浓度的na2s溶液中后，在675nm处的荧光响应图。

图5中，图a-c为实施例1的bzem对不同s^2-离子当量的核磁氢谱滴定光谱。

图6中，图a-c为测试例中，将a549细胞与bzem(10μm)孵育30分钟的荧光成像图；图d-f为图a-c的样品分别与bzem(10μm)和s^2-(25μm)孵育30min后的a549细胞的荧光成像图。

图7中，图a-c为测试例中，用bzem(10μm)处理1h的斑马鱼幼虫的荧光成像，图d-f为分别在图a-c的基础上，再用s^2-(100μm)处理1h的斑马鱼幼虫的荧光成像。

其中，图a、图d为明场成像，图b、图e为红色通道(590-650nm)，图c、图f为两图叠加的图像。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明的技术方案，列举如下实施例。实施例中所出现的原料、反应和后处理手段，除非特别声明，均为市面上常见原料，以及本领域技术人员所熟知的技术手段。

本发明的单体a选自2-(3,5,5-三甲基环己-2-烯基)丙二腈。

实施例1

一种硫负离子荧光探针材料bzem，其具有以下结构：

上述硫负离子荧光探针材料bzem的制备路线如下式所示：

硫负离子荧光探针材料bzem的制备方法如下所示。

s1.在设有冷凝装置的三口瓶中，将5mmol的2-(3,5,5-三甲基环己-2-烯基)丙二腈和5mmol的对羟基苯甲醛溶于15ml的乙醇中，加入5滴哌啶和5滴醋酸，回流反应4h，然后将所得的混合物冷却，倒入冰水中，过滤后收集滤渣，然后将滤渣用柱色谱(固定相：200-300目的硅胶，流动相：石油醚：乙酸乙酯＝1:2，v/v)提纯，得到化合物1，产率为65％。

¹hnmr(400mhz，cdcl3)δ7.42(d，j＝8.0hz，2h)，7.24(s，1h)，7.01(d，j＝15.7hz，1h)，6.86(d，j＝8.0hz，2h)，6.81(d，j＝15.2hz，1h)，2.59(s，2h)，2.46(s，2h)，1.08(s，6h)。

ei-ms：m/z实测值：290.13

s2.将2.5mmol的化合物1溶于10ml的三氟乙酸中，然后加入2.4mmol的六亚甲基四胺，回流反应2h，然后将所得的混合物冷却，倒入冰水中，过滤后收集滤渣，然后将滤渣用柱色谱(固定相：200-300目的硅胶，流动相：石油醚：乙酸乙酯＝1:1，v/v)提纯，得到化合物2，产率为56％。

¹hnmr(400mhz，dmso-d6)δ11.18(s，1h)，10.29(s，1h)，7.96(s，1h)，7.88(d，j＝7.9hz，1h)，7.29(s，2h)，7.04(d，j＝8.4hz，1h)，6.85(s，1h)，2.58(s，2h)，2.51(s，2h)，1.01(s，6h)。

ei-ms：m/z实测值：317.13。

s3.将2mmol的化合物2和2.2mmol的苯并[d]噻唑-2-胺溶于20ml的甲醇中，回流反应8h，然后将混合物用柱色谱(固定相：200-300目的硅胶，流动相：石油醚：乙酸乙酯＝1:2，v/v)提纯，得到产物bzem，产率为63％。

¹hnmr(400mhz，dmso-d6)δ11.77(s，1h)，9.43(s，1h)，8.27(s，1h)，8.08(d，j＝6hz，1h)，7.96(d，j＝6hz，1h)，7.88(d，j＝9hz，1h)，7.53(m，1h)，7.44(m，1h),7.32(s，1h)，7.07(d，j＝6hz，1h),6.86(s，1h),2.60(s，2h),2.54(s，2h),1.02(s，6h)。图1示出了产物对应的核磁图。

ei-ms：m/z实测值：450.15。

测试例

为了测试实施例1中的产物bzem作为硫负离子荧光探针材料的性能，作出以下一系列测试。

本测试例中所用的发射光谱的仪器为荧光分光光度计(型号为：shimadzurf-60002)；其测试条件为：纯水溶液(10mmpbs，ph＝7.4)的体系，固定激发波长为λex＝460nm，电压u＝700v,狭缝宽度slits＝10.0nm。

首先，对产物bzem进行作为硫负离子荧光探针材料的灵敏度分析。

测试步骤为：将bzem用dmso作为溶剂，配制成1mm的母液，然后用去离子水，配置为浓度为20μm的水溶液q；另外分别单独配置若干组阴离子的水溶液p(0.1m/l)，其中水溶液p中的溶质分别为na2s、naf、na2so4、nacl、nabr、nascn、nano3、nai、na2so3、naclo4、na2s2o3、nano2。将4μl的水溶液p分别滴加到水溶液q中并混合后，对混合溶液进行发射光谱的测试。所得结果如图2所示。

从图2中可以看出，水溶液q与含na2s的水溶液p混合后的混合溶液，在675nm处对s^2-具有显著的荧光响应，而对其它竞争性阴离子的水溶液p仅有轻微的荧光响应。另外，当阴离子为so4^2-、scn^-、so3^2-和s2o3^2-时，对含上述溶质的混合溶液进行测试时，没有引起bzem任何的的荧光响应。这说明了本发明所公开的bzem作为硫负离子荧光探针材料，具有优异的硫负离子选择性，其适用于多种含有竞争性阴离子的废水中。

然后，将含有不同上述溶质的水溶液，以及空白样(blank)，均作为水溶液k，分别与等量的na2s共混，配置成若干组去离子水溶液w。其中，在水溶液w中，na2s的浓度为20μm。对所有的水溶液k(图3中的探针+负离子)和水溶液w(图3中的探针+负离子+na2s)进行荧光测试，测试在675nm处的荧光响应，并作对照图，所得结果如图3所示。

从图3可以看出，所有的水溶液k中，在675nm处的荧光响应都很低，而加入na2s共混所得的水溶液w，则在675nm处体现出强烈的荧光响应。这表明探针bzem对s^2-的显著的选择性。

然后，通过荧光滴定实验来测试bzem对s^2-的传感能力。测试方法为：配置20μmbzem的水溶液，然后向其溶液中加入na2s溶液，浓度从0-200μm范围内线性变化。测试溶液在675nm处的荧光强度并作图，得到图4，所得的部分结果如表1所示。

表1na2s溶液浓度和加入bzem后在675nm处荧光强度的数值

可以看出，在675nm处，荧光强度呈逐步增加。这说明探针bzem对s^2-的优异的敏感度。

为了分析bzem对s^2-的识别机制，我们还作出在dmso-d6中进行了¹hnmr滴定实验。测试过程为：比较核磁测探针bzem与s^2-离子滴定前后的位移变化。所得结果如图5中a-c所示。其中，图a是5eq的s^2-离子与探针滴定后氢谱，图b是2eq的s^2-离子与探针滴定后氢谱，c图是不含s^2-离子的探针氢谱。图5中的a-c验证了bzem特异性识别机理为席夫碱与硫负离子的加成反应，加入过量的s^2-离子位移没有新的变化，说明加成反应是按1:1进行的。

然后，我们还测试了探针bzem在a549细胞中成像的应用。测试方法为：取对数生长期的细胞a549细胞制备成单细胞悬液。计数板计数后，以5×10³个/孔接种于96孔的培养板中，使每孔体积为200μl。将200μl的a549细胞与浓度为10μm探针bzem的去离子水溶液，在37℃下一起孵育30min，然后对a549细胞进行荧光测试，发现在细胞内区域产生的荧光非常低，所得结果如图6中的a-c所示，图a-c是存在a549细胞与探针bzem情况下的荧光图，图a是明场通道，图b是红色通道，图c是两图叠加，图a、b、c的荧光效果都几乎无法识别；然后在探针bzem与a549细胞孵育30min的培养孔中，加入100μm的na2s溶液，继续孵育30min，发现在细胞内区域产生的荧光得到显著地增强，所得结果如图6中的d-f所示：红色通道的图e和两图叠加的图f均有明细的红色荧光。以上结果表明，具有低细胞毒性的bzem可用于生物系统s^2-检测。

最后，我们还测试了bzem在斑马鱼中进行了荧光成像的实验。具体测试步骤为：在斑马鱼培养液中加入10μm的bzem溶液，孵育1小时后用pbs缓冲液洗涤3次斑马鱼外表，并加入100μm的na2s溶液继续培育1h，用pbs缓冲液洗涤斑马鱼3次后，进行荧光成像。所得结果如图7中的a-f所示。可以看出，图a-c是只有探针情况下，斑马鱼分别在明场通道、红色通道，以及两图叠加的情况，几乎没有荧光；而在加入s^2-离子后，斑马鱼幼虫的消化系统中明显显示出红色荧光(图e、f)。这些结果清楚地表明，探针bzem是有机体可渗透的，并且对于检测活体内的s^2-非常敏感。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。