两相溶剂萃取法纯化牛至草迷迭香酸抗氧化剂工艺

本发明涉及植物有效成分制备纯化领域，具体的说是涉及两相溶剂萃取法纯化牛至草迷迭香酸抗氧化剂工艺。

背景技术：
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牛至(origanumvulgarel.)，又名止痢草、土香薷、小叶薄荷，为唇形科多年生草本植物，是天然的药食同源植物，其全草均能入药，可用于食品调料，增加食物的香味或去除肉类的膻味。牛至被认为是一种强力的天然抗生素，研究表明它甚至能够对抗一种目前任何抗生素都无效的超级金黄色葡萄球菌。牛至的抗氧化作用优于其他许多药草，美国农业部评比它的抗氧化能力是蓝莓的4倍、橘子的12倍、苹果的42倍。牛至的化学成分研究主要有挥发油类、有机酸、黄酮、三萜、甾醇等化学成分的报道(牛至精油、迷迭香酸和熊果酸)等作为新型植物抗生素，研究发现茶树精油和牛至精油对须癣毛癣菌有较好的抑制效果，且牛至精油较茶树精油效果更好。成都新朝阳作物科学有限公司2019年申请的发明专利“含牛至和迷迭香提取物的农药组合物及其制备方法和应用”(申请公布号cn109497100a)是植物源农药技术领域，提供一种含牛至和迷迭香提取物的农药组合物。宜春学院2019年申请的发明专利“一种复合植物提取物、制备方法及应用”，也是复合植物提取物。湖南绿蔓生物科技股份有限公司2020年申请的发明专利“一种牛至的综合提取方法”(申请公布号cn111187437a)，该专利能够得到精油和迷迭香酸及熊果酸，但是熊果酸是脂溶性成分，在60％酒精度下是无法提取出。杨凌农科大无公害农药研究服务中心2018年发明专利“一种牛至精油制剂、制备方法及其应用”(申请公布号cn108719345a)，杨凌农科大无公害农药研究服务中心2018年发明专利“一种牛至精油制剂、制备方法及其应用”(申请公布号cn108739876a)，是利用牛至精油制备制剂。福建中农牧生物药业有限公司2014年发明专利“一种天然高含量牛至香酚提取方法”(申请公布号cn103655688a)为涉及一种天然高含量牛至香酚提取方法。该专利并没有提及高含量为多少。本专利首次采用两相溶剂萃取法纯化牛至草迷迭香酸抗氧化剂，可为企业综合开发和利用牛至资源提供参考。

技术实现要素：

本发明的目的是提供两相溶剂萃取法纯化牛至草迷迭香酸抗氧化剂工艺，本发明针对水提取时溶液中含有较多的多糖、色素、大分子蛋白杂质，使得产品色深、易于受潮问题进行设计，采用水蒸馏得到精油后，然后加入乙醇使其浓度为15-30％，减少杂质。通过絮凝膜过滤脱色得到迷迭香酸纯化液，进一步采用两相分配法进一步纯化迷迭香酸。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种两相溶剂萃取法纯化牛至草迷迭香酸抗氧化剂工艺，其特征在于，步骤如下：

(1)牛至草精油制备：取干燥的牛至草以1:5的料液质量体积比加入水溶液，水蒸气蒸馏法提取出牛至精油，约为0.2-0.3％；

(2)牛至草迷迭香酸粗提液制备：在(1)中加入酒精使其酒精浓度为15-30％，回流提取，套提一次，合并提取液；

(3)絮凝膜过滤脱色：步骤(2)所得迷迭香酸水溶液加入高分子絮凝剂溶解，过800nm管式膜，过截留分子量1000卷式膜过滤，透过液通过截留分子量150卷式膜得浓缩液；

(4)两相溶剂萃取制备较高纯迷迭香酸：步骤(3)所得浓缩液，清液按1:1.5的比例加入正丁醇萃取一次，浓缩得浓缩物；

(5)两相溶剂萃取制备更高高浓度迷迭香酸：步骤(4)所得迷迭香酸粗品用有机溶剂萃取法进行第二次萃取纯化，清液按1:1.5的比例加入乙酸甲酯萃取一次，浓缩得浓缩物，干燥得产品。

优选的，所述絮凝膜过滤脱色步骤如下：步骤(2)所得迷迭香酸水溶液加入双氰胺甲醛-双氰胺甲醛铵盐絮凝剂溶解，离心去除沉淀，过800nm管式膜，透过液通过截留分子量1000da卷式膜过滤，透过液通过截留分子量150卷式膜过滤，得浓缩液，干品含量约为15％。

优选的，所述两相溶剂萃取制备较高纯迷迭香酸：步骤(3)所得浓缩液，调酸ph＝2-3，离心去除不溶物，改水相为水不溶性杂质。清液按1:1.5的比例加入正丁醇萃取一次，浓缩得浓缩物，去除水溶液，为水溶性杂质，正丁醇相减压浓缩得含量约为35％迷迭香酸。

优选的，所述两相溶剂萃取制备更高高浓度迷迭香酸制备：步骤(4)所得35％迷迭香酸粗品用有机溶剂萃取法进行第二次萃取纯化，调酸ph＝2-3，离心去除不溶物，清液按1:1.5的比例加入乙酸甲酯萃取一次，浓缩得浓缩物，干燥得70％左右产品。

优选的，双氰胺甲醛-双氰胺甲醛铵盐絮凝剂制备方法：在装有搅拌器、温度计、冷凝管的500ml四口烧瓶或者三口烧瓶中加入37％甲醛100ml。搅拌下加入50-52克双氰胺，温度会自然上升至38℃左右。在40℃加入氯化铝10克，反应30min左右时溶液变清澈。加入改性剂氯化铵30～33克。控制温度于40℃左右(反应过程中会升温)，搅拌至溶液透明后(约1h)加入100ml水升温至65-70℃，反应2-2.5小时，观察粘度。冷却前再加入100ml水，搅拌30min。

作为首次采用两相溶剂萃取法纯化牛至草迷迭香酸抗氧化剂工艺，相关工艺参数需要根据牛至草迷迭香酸理化特性进行创造性的试验选择，实验结果见下：

1.正丁醇萃取水相和含醇水相效果

水相为15％乙醇和纯水溶解90％样品后(0.2mg/ml)加入等体积的正丁醇进行萃取，测定上下相中迷迭香酸的含量，结果如下表所示：

表1迷迭香酸在上相下相分配比例

由试验数据可知：以15％乙醇和水为溶解标准品后用正丁醇萃取，萃取15％乙醇相，迷迭香酸70％仍然在乙醇水溶液中。萃取ph中性水相，迷迭香酸近70％分配在有机相。故选用水溶解迷迭香酸样品。

2、正丁醇萃取不同ph水相

分别以不同ph的水相溶解迷迭香酸90％样品，用等体积正丁醇萃取，分相后，上下相分别经高效液相色谱法检测，峰面积比值如下：

表2正丁醇萃取不同ph水相迷迭香酸的分配情况

由试验数据可知：迷迭香酸在上下相的分配比在ph0.1-3时，98％在有机相，选择ph2-3时富集迷迭香酸可高效提取迷迭香酸，同时去除酸性条件下不溶于上相的杂质。

3、两相溶剂萃取剂选择

全部用酸水溶解，料液比1:8，离心去除不溶物，分别用乙醚、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯、三氯甲烷、正丁醇、石油醚、正己烷萃取按照1:1的体积比进行萃取，共萃取两次，检测两次萃取后上相和最后的下相迷迭香酸的含量。其结果如下表3所示：

表3不同溶剂萃取效果

实验结果显示：用正丁醇萃取时，上相的迷迭香酸总和最高，其次是乙酸甲酯、乙酸乙酯和乙醚。萃取次数二次即可。

4、双氰胺甲醛-双氰胺甲醛铵盐絮凝剂的制备

双氰胺甲醛-双氰胺甲醛铵盐絮凝剂：在装有搅拌器、温度计、冷凝管的500ml四口烧瓶或者三口烧瓶中加入37％甲醛100ml。搅拌下加入50-52克双氰胺，温度会自然上升至38℃左右。在40℃加入氯化铝10克，反应30min左右时溶液变清澈。加入改性剂氯化铵30～33克。控制温度于40℃左右(反应过程中会升温)，搅拌至溶液透明后(约1h)加入100ml水升温至65-70℃，反应2-2.5小时，观察粘度。冷却前再加入100ml水，搅拌30min。

本发明与现有技术相比，具有如下优点：

本发明提供两相溶剂萃取法纯化牛至草迷迭香酸抗氧化剂工艺，采用水蒸气蒸馏法得到牛至精油，调整乙醇浓度减少糖、蛋白等杂质，提取滤膜过滤制备出较高含量迷迭香酸(15％)。较为详细地对两相萃取剂、萃取ph等参数进行了优化，通过两相萃取纯化制备出70％迷迭香酸。

附图说明

图1为本发明牛至迷迭香酸提取工艺流程示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

如图1所示的两相溶剂萃取法纯化牛至草迷迭香酸抗氧化剂工艺，按下述方法制备：

1)牛至草精油制备：取干燥的牛至草以1:5的料液质量体积比加入水溶液，采用水上蒸馏法提取出牛至精油。

2)迷迭香酸粗提液制备：去除精油的料液加入酒精使浓度为15-30％，回流提取，套提一次，合并提取液。

3)絮凝膜过滤脱色：步骤2)所得迷迭香酸水溶液加入高分子絮凝，离心去除沉淀，过800nm管式膜，透过液通过截留分子量1000卷式膜过滤，透过液通过截留分子量150卷式膜过滤，得浓缩液。含量约为15％(干品)。

4)两相溶剂萃取制备较高浓度迷迭香酸：步骤3)所得浓缩液，用盐酸调酸ph＝2-3，离心去除不溶物，清液按1:1.5的比例加入正丁醇萃取一次，浓缩得浓缩物，含量约为35％。

5)两相溶剂萃取制备更高高浓度迷迭香酸：步骤4)所得35％迷迭香酸粗品按料液比1:6溶解(调酸ph＝2-3)，用有机溶剂萃取法进行第二次萃取纯化，，离心去除不溶物，清液按1:1.5的比例加入乙酸甲酯萃取一次，浓缩得浓缩物，干燥得70％左右产品。

实施例2

该两相溶剂萃取法纯化牛至草迷迭香酸抗氧化剂工艺，按下述方法制备：

1)牛至草精油制备：取干燥的牛至草1000克加入到自制10升提取罐，以1:6的料液质量体积比加入水溶液，采用水蒸气蒸馏法提取出牛至精油(约0.2-0.3％)。

2)迷迭香酸粗提液制备：去除精油的料液加入酒精使浓度为20-30％，回流提取，套提一次，合并提取液，四层纱布过滤。

3)絮凝膜过滤脱色：步骤2)所得迷迭香酸水溶液加入0.5-1％双氰胺甲醛-双氰胺甲醛铵盐絮凝剂高分子絮凝剂，离心去除沉淀，过200nm管式膜，透过液通过截留分子量1500卷式膜过滤，透过液通过截留分子量150卷式膜过滤，得浓缩液。含量约为15％(干品)。

4)两相溶剂萃取制备较高浓度迷迭香酸：步骤3)所得浓缩液，用硫酸调酸ph＝2-3，离心去除不溶物，清液按1:1.5的比例加入正丁醇萃取一次，浓缩得浓缩物，含量约为35％。

5)两相溶剂萃取制备更高高浓度迷迭香酸：步骤4)所得35％迷迭香酸粗品按料液比1:6溶解(硫酸调酸ph＝2-3)，清液按1:1.5的比例加入乙酸甲酯萃取一次，浓缩得浓缩物，干燥得70％左右产品。