本发明属于饮料发酵技术领域，具体涉及一种底物添加氨基酸并基于葡萄汁有孢汉逊酵母的发酵工艺。
背景技术：
葡萄酒发酵是一个复杂的生物化学过程，葡萄汁有孢汉逊酵母在发酵过程中起到了非常关键的作用，例如将糖转化为乙醇、二氧化碳及其他成千上万的次生代谢产物。大量科学研究表明，葡萄酒质量高度依赖于不同葡萄汁有孢汉逊酵母的代谢活动及发酵行为，不同葡萄汁有孢汉逊酵母对葡萄酒的化学组成、感官特性、风味特征等具有重要贡献。酿酒酵母是迄今为止在葡萄酒工业生产中应用最广的菌种，其优点在于能够保证葡萄酒发酵过程中变质的风险，且均有很好的发酵动力，但伴随而来的问题是葡萄酒风味特征单一、同质化现象严重等问题。因此，为追求葡萄酒风格特色化，香气特点更具有代表性、多样性和复杂性，酿酒师们常采用酿酒酵母与非酿酒酵母混合发酵的方法，尤其是一些具有很强适应性和代表性的本土葡萄汁有孢汉逊酵母，从而改善和提高葡萄酒风味品质。
非酿酒酵母已经成为提高葡萄酒质量的一种选择。大量研究表明，非酿酒酵母能够产生酶以及一些我们所期望的次生代谢产物，从而提高葡萄酒香气和风味特色，并且能够控制葡萄酒中一些不良菌种的生长，但缺点是发酵动力不足。将非酿酒酵母和酿酒酵母进行混合发酵既能提高葡萄酒香气多样性和复杂性，又能弥补非酿酒酵母发酵动力不足的问题，是提高葡萄酒香气品质的有效方法。
葡萄汁有孢汉逊酵母菌(hanseniasporauvarum)，其特征特性为：细胞卵圆形，两端锐尖。菌落不粘稠，可厌氧生长。目前常见的葡萄汁有孢汉逊酵母菌的主要用途包括：研究、发酵。例如：
发明专利申请201910635939.8提供了一株葡萄汉逊酵母菌株，其保藏编号为cctccno：m2019304，该菌株能够将无机硒转化为有机硒，而且有机硒含量高达2332mg/kg。
发明专利申请201911406443.x公开了一株保藏号为cgmccno.18666的葡萄汁有孢汉逊酵母(hanseniasporauvarum)菌株a14，该菌株产香叶醇的能力高，发酵48h香叶醇的浓度可达63.48μg/l。
发明专利申请202010265892.3披露了一种用于发酵型红枣酒的包括萄汁有孢汉逊酵母(hanseniasporauvarum)复合菌种，解决甲醇超标、残糖高、酸度高、风味单一等问题，并保持发酵型红枣酒产品丰富的营养价值。
而可产邻甲酚、6-甲基庚醇、1,3-戊二醇、环辛醇等香气物质的葡萄汁有孢汉逊酵母(hanseniasporauvarum)，本领域从未报道。而关于在底物中添加氨基酸并利用葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniasporauvarum发酵的工艺，本领域目前更未见任何相关报道。
技术实现要素：
基于本领域的上述需求和空白，本发明提供一种在底物中添加氨基酸并基于葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniasporauvarum的发酵工艺，相比常规的酿酒酵母发酵，在多种会影响酒饮风味的香气物质上均有十分显著的提升。
本发明的技术方案如下：
一种底物添加氨基酸并基于葡萄汁有孢汉逊酵母的发酵工艺，其特征在于，在底物中添加氨基酸，并采用葡萄汁有孢汉逊酵母进行发酵。
所述葡萄汁有孢汉逊酵母指葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniasporauvarum菌株qtx22；所述葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniasporauvarum菌株qtx22的保藏号为cctccm2021083。
所述氨基酸的添加浓度为0.6-1.4g/l；
优选地，所述氨基酸选自：亮氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、缬氨酸。
所述的一种底物添加氨基酸并基于葡萄汁有孢汉逊酵母的发酵工艺包括下述步骤：在底物中添加氨基酸、活化菌株、活化后的菌株接入待发酵的底物进行发酵；
优选地，所述活化菌株指将菌株接种于培养基中进行培养；
优选地，所述底物中添加氨基酸的浓度选自0.6g/l、1g/l、1.4g/l。
所述菌株选自：葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniasporauvarum菌株qtx22、酿酒酵母菌株f33、酿酒酵母菌株x16、酿酒酵母菌株st；
优选地，所述培养温度为24-30℃，优选28℃；培养时间为20-30h，优选24h，转速为120-250rpm，优选150rpm；
优选地，所述接种指按照体积比2-4％优选3％的接种量将初始菌株保存液接种于培养基中；
优选地，所述培养基为ypd培养基；优选地，ypd培养基包括如下质量体积比的组分：0.5-3.5％优选1％的葡萄汁有孢汉逊酵母浸粉、1.0-3.0％优选2％的蛋白胨、1.0-5.0％的优选2％葡萄糖，其余为水；
优选地，所述初始菌株保存液指菌株保存于体积比15-35％优选25％甘油/ypd培养基中；
更优选地，所述活化菌株进行1-3次，优选2次。
优选地，所述活化后的菌株指：活化后的葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniasporauvarum菌株qtx22、或，活化后的酿酒酵母菌株f33、或，活化后的酿酒酵母菌株x16、或，活化后的酿酒酵母菌株st；
优选地，所述发酵温度为18℃±2℃；
优选地，活化后的菌株在底物中的接种量为106-107cfu，优选6×106cfu；
优选地，待底物失重连续3天不再变化终止发酵；
优选地，所述底物为葡萄汁。
一种葡萄酒生产方法，其特征在于，以葡萄汁为底物，在底物中添加氨基酸后，接入葡萄汁有孢汉逊酵母进行发酵。
所述葡萄汁有孢汉逊酵母指葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniasporauvarum菌株qtx22；所述葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniasporauvarum菌株qtx22的保藏号为cctccm2021083；
优选地，所述一种葡萄酒生产方法包括：在葡萄汁中添加氨基酸、活化菌株、活化后的菌株接入代发酵的底物进行发酵；
优选地，所述葡萄汁中添加氨基酸的浓度为0.6-1.4g/l；优选0.6g/l、1g/l、1.4g/l；
优选地，所述葡萄汁中添加的氨基酸选自：亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸。
所述菌株选自：葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniasporauvarum菌株qtx22、酿酒酵母菌株f33、酿酒酵母菌株x16、酿酒酵母菌株st；
优选地，所述活化菌株指将菌株接种于培养基中进行培养；
优选地，所述培养温度为24-30℃，优选28℃；培养时间为20-30h，优选24h，转速为120-250rpm，优选150rpm；
优选地，所述接种指按照体积比3％的接种量将初始菌株保存液接种于培养基中；
优选地，所述培养基为ypd培养基；优选地，ypd培养基包括如下质量体积比的组分：0.5-3.5％优选1％的葡萄汁有孢汉逊酵母浸粉、1.0-3.0％优选2％的蛋白胨、1.0-5.0％的优选2％葡萄糖，其余为水；
优选地，所述初始菌株保存液指保存于体积比15-35％优选25％甘油/ypd培养基中的菌株；
更优选地，所述活化菌株进行1-3次，优选2次；
优选地，所述活化后的菌株指：活化后的葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniasporauvarum菌株qtx22、或，活化后的酿酒酵母菌株f33、或，活化后的酿酒酵母菌株x16、或，活化后的酿酒酵母菌株st；
优选地，所述发酵温度为18℃±2℃；
优选地，活化后的葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniasporauvarum菌株qtx22的总接入量为106-107cfu，优选6×106cfu；
优选地，待底物失重连续3天不再变化终止发酵。
所述的一种葡萄酒生产方法还包括：制备葡萄汁；
所述制备葡萄汁指：将葡萄果粒低温压榨；
优选地，将采收的葡萄果粒利用气囊压榨机进行带冰压榨；
优选地，压榨同时添加二氧化硫或k2s2o5、和，果胶酶；
优选地，二氧化硫或k2s2o5的添加量为30-100mg/l优选50mg/l；果胶酶的添加量为10-30mg/l优选20mg/l；
优选地，葡萄果粒为大小均匀的果粒；
优选地，葡萄果粒为葡萄成熟后待温度下降到连续24小时-8℃以下时采收的葡萄果粒。
一种葡萄酒，其特征在于，采用所述的葡萄酒生产方法生产得到。
本发明采用在底物中添加氨基酸后再添加葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniasporauvarum发酵，与单独使用葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniasporauvarum或商业酿酒酵母发酵，或者底物添加氨基酸后再用商业酿酒酵母发酵相比，在产生的近百种香气物质中，有很多香气物质的产量均有所提升，例如，添加亮氨酸时，7-十三醇提高了30％，环己醇提高了41％，2-壬酮提高了1.34倍，2,4-己二烯酸乙酯提高了33％；添加苏氨酸时，7-十三醇提高了1630倍，环己醇提高了268倍，3-辛醇提高了262倍，3-呋喃甲醇提高了264倍，苯甲醇提高了21％，1-戊醇提高了12％，4-戊烯-1-醇提高了108倍，乙基苯提高了7.9倍，2-羟基丁酸甲酯提高了375倍，3-糠醛提高了87倍，异丁醛提高了123倍，2-甲基丁醛提高了174倍，异辛酸提高了1.08倍，异佛尔酮提高了37.4％，2-壬酮提高了201倍，2,3-二氢-3,5二羟基-6-甲基-4(h)-吡喃-4-酮提高了76倍，3-壬酮提高了14倍，1-氟己烷提高了187倍，二乙氧基二甲基硅烷提高了34％，苯乙酸乙酯提高了54％，2,4-己二烯酸乙酯提高了1460倍，乙酸异丁酯提高了295倍，乙酸异戊酯提高了1.88倍，添加缬氨酸发酵时，7-十三醇提高了7.2倍，环己醇提高了62％，3-辛醇提高了24％，γ-丁内酯提高了34％，2-壬酮提高了94％，添加异亮氨酸时，2-甲基-1-丁醇提高了73倍，α-松油醇提高了90倍，7-十三醇提高了1609倍，环己醇提高了269倍，3-辛醇提高了275倍，3-呋喃甲醇提高了266倍，仲辛醇提高了85倍，苯酚提高了211倍，反式芳樟醇氧化物提高了2.97倍，间二甲苯提高了51倍，4-异丙基甲苯提高了146倍，4-甲基-1，3-戊二烯提高了59倍，2-羟基丁酸甲酯提高了340倍，γ-丁内酯提高了327倍，3-糠醛提高了106倍，异丁醛提高了156倍，2-甲基丁醛提高了3.52倍，(+)-柠檬烯提高了87％，1,7,7-三甲雙環[2.2.1]庚-2-烯16.7％，月桂烯提高了1.11倍，2-壬酮提高了90％，2,3-二氢-3,5二羟基-6-甲基-4(h)-吡喃-4-酮提高了56倍，3-壬酮提高了45倍，1-氟己烷提高了207倍，l(-)-乳酸乙酯提高了113倍，苯乙酸乙酯提高了103倍，丁酸乙酯提高了36％，2,4-己二烯酸乙酯提高了289倍，乙酸异丁酯提高了373倍，乙酸异戊酯提高了3.19倍；本发明的发酵工艺同时还产生了单独使用葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniasporauvarum或商业酿酒酵母发酵无法产生的香气物质，例如：添加亮氨酸时，产生了3-庚醇、邻甲酚；添加苏氨酸时，产生了6-甲基庚醇、1,3-戊二醇、3-庚醇、环辛醇、2-甲基吡嗪、3-甲基十三烷、2,4-二甲基-1,3-二氧杂环己烷；添加缬氨酸时，产生了乙酸丙酯、丙酸乙酯、3-甲基十三烷、2-甲基吡嗪、3-庚醇、1,3-戊二醇、6-甲基庚醇；添加异亮氨酸时，产生了异丁酸乙酯、2-糠酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、3-甲基十三烷、二甲醇缩甲醛、p-伞花烃、2,3-二氢苯并呋喃、邻甲酚、环辛醇、3-庚醇、6-甲基庚醇。上述这些香气物质的产生或它们的产量的提升均会给发酵所得饮品的风味、香气产生一定的影响，使混菌发酵产品呈现出相比单菌发酵产品更为独特的香味，可生产出一款独特风味、香气、口感的酒饮，充实消费品类，扩大消费选择。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的详细内容做进一步具体说明，但并不以此限制本发明的保护范围。
生物材料的来源及记载出处
实验例中使用的葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniasporauvarum菌株qtx22为申请人实验室筛选出的新菌株，保藏信息如下：
命名：hanseniasporauvarumqtx22
分类名称：葡萄汁有孢汉逊酵母
拉丁名称：hanseniasporauvarum
保藏号：cctccno:m2021083
保藏机构：中国典型培养物保藏中心
保藏日期：2021年1月15日；
保藏机构地址：中国.武汉.武汉大学
酿酒酵母f33、x16、st为商业菌株，购自法国拉氟德(laffort)公司。
使用的葡萄品种为威代尔冰葡萄，购自宁夏巴格斯醉美国际酒庄有限公司。
第1组实施例、本发明的底物添加氨基酸发酵工艺
本组实施例提供一种底物添加氨基酸并基于葡萄汁有孢汉逊酵母的发酵工艺。本组所有的实施例都具备如下共同特征：在底物中添加氨基酸，并采用葡萄汁有孢汉逊酵母进行发酵。
本领域技术人员可根据本发明的启示，任何在底物中添加氨基酸并用葡萄汁有孢汉逊酵母进行发酵、生产的行为均落入本发明的保护范围。发酵的目标产品包括但不限于：酒饮、乳制品、面制品等。
所述乳制品包括但不限于酸奶、发酵乳、乳饮料等；所述面制品包括但不限于：面包、蛋糕、包子、馒头、花卷等。
在优选的实施例中，所述葡萄汁有孢汉逊酵母指葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniasporauvarum菌株qtx22；所述葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniasporauvarum菌株qtx22的保藏号为cctccm2021083。
在一些实施例中，所述氨基酸的添加浓度为0.6-1.4g/l；
在具体的实施例中，所述氨基酸选自：亮氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、缬氨酸。
在进一步的实施例中，所述的一种底物添加氨基酸并基于葡萄汁有孢汉逊酵母的发酵工艺包括下述步骤：在底物中添加氨基酸、活化菌株、活化后的菌株接入待发酵的底物进行发酵；
优选地，所述活化菌株指将菌株接种于培养基中进行培养；
优选地，所述底物中添加氨基酸的浓度选自0.6g/l、1g/l、1.4g/l。
在优选的实施例中，所述菌株选自：葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniasporauvarum菌株qtx22、酿酒酵母菌株f33、酿酒酵母菌株x16、酿酒酵母菌株st；
本发明除了验证葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniasporauvarum菌株在添加了氨基酸的底物中的发酵效果，同时验证了3种商业酿酒酵母菌株在添加了氨基酸的底物中的发酵效果，相比未添加氨基酸进行发酵，底物中添加了氨基酸用各菌株进行发酵都能获得更高的香气物质产量，因此，本领域技术人员可根据本发明的启示，可选用其他商业菌株进行底物添加氨基酸发酵，除f33外，目前市面上还存在多种商业菌株，例如，saccharomycescerevisiaev1116、saccharomycescerevisiaevl1等，这些菌株都可用来接种于添加了氨基酸的底物中进行发酵，获得与本发明类似的技术效果是可预期的。
优选地，所述培养温度为24-30℃，优选28℃；培养时间为20-30h，优选24h，转速为120-250rpm，优选150rpm；
优选地，所述接种指按照体积比2-4％优选3％的接种量将初始菌株保存液接种于培养基中；
优选地，所述培养基为ypd培养基；优选地，ypd培养基包括如下质量体积比的组分：0.5-3.5％优选1％的葡萄汁有孢汉逊酵母浸粉、1.0-3.0％优选2％的蛋白胨、1.0-5.0％的优选2％葡萄糖，其余为水；
优选地，所述初始菌株保存液指菌株保存于体积比15-35％优选25％甘油/ypd培养基中；
更优选地，所述活化菌株进行1-3次，优选2次。
优选地，所述活化后的菌株指：活化后的葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniasporauvarum菌株qtx22、或，活化后的酿酒酵母菌株f33、或，活化后的酿酒酵母菌株x16、或，活化后的酿酒酵母菌株st；
优选地，所述发酵温度为18℃±2℃；
优选地，活化后的菌株在底物中的接种量为106-107cfu，优选6×106cfu；
优选地，待底物失重连续3天不再变化终止发酵；
优选地，所述底物为葡萄汁。
第2组实施例、本发明的葡萄酒生产方法
本组实施例提供一种葡萄酒生产方法。本组实施例都具备如下共同特征：以葡萄汁为底物，在底物中添加氨基酸后，接入葡萄汁有孢汉逊酵母进行发酵。
在优选的实施例中，所述葡萄汁有孢汉逊酵母指葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniasporauvarum菌株qtx22；所述葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniasporauvarum菌株qtx22的保藏号为cctccm2021083。
在另一些实施例里，所述的一种葡萄酒生产方法包括：在葡萄汁中添加氨基酸、活化菌株、活化后的菌株接入代发酵的底物进行发酵；
优选地，所述葡萄汁中添加氨基酸的浓度为0.6-1.4g/l；优选0.6g/l、1g/l、1.4g/l；
优选地，所述葡萄汁中添加的氨基酸选自：亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸。
在一些实施例中，所述菌株选自：葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniasporauvarum菌株qtx22、酿酒酵母菌株f33、酿酒酵母菌株x16、酿酒酵母菌株st；
优选地，所述活化菌株指将菌株接种于培养基中进行培养；
优选地，所述培养温度为24-30℃，优选28℃；培养时间为20-30h，优选24h，转速为120-250rpm，优选150rpm；
优选地，所述接种指按照体积比3％的接种量将初始菌株保存液接种于培养基中；
优选地，所述培养基为ypd培养基；优选地，ypd培养基包括如下质量体积比的组分：0.5-3.5％优选1％的葡萄汁有孢汉逊酵母浸粉、1.0-3.0％优选2％的蛋白胨、1.0-5.0％的优选2％葡萄糖，其余为水；
优选地，所述初始菌株保存液指保存于体积比15-35％优选25％甘油/ypd培养基中的菌株；
更优选地，所述活化菌株进行1-3次，优选2次；
优选地，所述活化后的菌株指：活化后的葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniasporauvarum菌株qtx22、或，活化后的酿酒酵母菌株f33、或，活化后的酿酒酵母菌株x16、或，活化后的酿酒酵母菌株st；
优选地，所述发酵温度为18℃±2℃；
优选地，活化后的葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniasporauvarum菌株qtx22的总接入量为106-107cfu，优选6×106cfu；
优选地，待底物失重连续3天不再变化终止发酵。
在进一步的实施例中，所述的一种葡萄酒生产方法还包括：制备葡萄汁；
所述制备葡萄汁指：将葡萄果粒低温压榨；
优选地，将采收的葡萄果粒利用气囊压榨机进行带冰压榨；
优选地，压榨同时添加二氧化硫或k2s2o5、和，果胶酶；
优选地，二氧化硫或k2s2o5的添加量为30-100mg/l优选50mg/l；果胶酶的添加量为10-30mg/l优选20mg/l；
优选地，葡萄果粒为大小均匀的果粒；
优选地，葡萄果粒为葡萄成熟后待温度下降到连续24小时-8℃以下时采收的葡萄果粒。第3组实施例、本发明的葡萄酒
本组实施例提供一种葡萄酒。本组所有的实施例都具备如下共同特征：采用第2组实施例任一项所述的葡萄酒生产方法生产得到。
本发明的葡萄酒产生下述单菌发酵的葡萄酒无法产生的香气物质：邻甲酚、6-甲基庚醇、1,3-戊二醇、环辛醇、2-甲基吡嗪、3-甲基十三烷、2,4-二甲基-1,3-二氧杂环己烷、乙酸丙酯、丙酸乙酯、3-庚醇、异丁酸乙酯、2-糠酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、二甲醇缩甲醛、p-伞花烃、2,3-二氢苯并呋喃。
实验例、本发明的混菌发酵工艺及发酵数据
1.菌株
本试验采用的菌株为：商业酿酒酵母s.cerevisiaex16菌株、商业酿酒酵母s.cerevisiaest菌株、商业酿酒酵母s.cerevisiaef33和本发明分离筛选的葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniasporauvarum菌株qtx22。
2.葡萄汁
威代尔冰葡萄原料种植于宁夏省银川市永宁县玉泉营，宁夏巴格斯醉美国际酒庄有限公司(e106.02°，n38.24°)。葡萄树种植于2013年，采用小棚架栽培，株行距为1.0m×2.0m，本试验于2017年采收，葡萄成熟后不采摘，待温度下降到连续24小时-8℃以下时采摘，去除小次果粒，随机选择大小一致的冰葡萄果实低温压榨。对采收后的冰葡萄通过气囊压榨机进行带冰压榨操作，同时添加二氧化硫(50mg/lk2s2o5)和20mg/l果胶酶(≥500u/mg)，抑制细菌并提高出汁率。压榨得到的葡萄汁含糖量432g/dm3，酸度4.65g/dm3(酒石酸)，ph为4.21。
3.底物添加氨基酸操作
准备若干份压榨得到的葡萄汁分别做平行处理：
(1)等待单独加菌株发酵的葡萄汁的标记及其含义如下：
ck-f33：仅接种f33菌株发酵的葡萄汁；
ck-st：仅接种st菌株发酵的葡萄汁；
ck-x16：仅接种x16菌株发酵的葡萄汁；
ck-hu：仅接种hu菌株发酵的葡萄汁；
(2)添加氨基酸的葡萄汁分别标记及其含义如下：
l-0.6-hu：以添加了0.6g/l亮氨酸的葡萄汁为底物，再接种hu菌株进行发酵；
l-0.6-f33：以添加了0.6g/l亮氨酸的葡萄汁为底物，再接种f33菌株进行发酵；
l-0.6-st：以添加了0.6g/l亮氨酸的葡萄汁为底物，再接种st菌株进行发酵；
l-0.6-x16：以添加了0.6g/l亮氨酸的葡萄汁为底物，再接种x16菌株进行发酵；
l-1-hu：以添加了1g/l亮氨酸的葡萄汁为底物，再接种hu菌株进行发酵；
l-1-f33：以添加了1g/l亮氨酸的葡萄汁为底物，再接种f33菌株进行发酵；
l-1-st：以添加了1g/l亮氨酸的葡萄汁为底物，再接种st菌株进行发酵；
l-1-x16：以添加了1g/l亮氨酸的葡萄汁为底物，再接种x16菌株进行发酵；
l-1.4-hu：以添加了1.4g/l亮氨酸的葡萄汁为底物，再接种hu菌株进行发酵；
l-1.4-f33：以添加了1.4g/l亮氨酸的葡萄汁为底物，再接种f33菌株进行发酵；
l-1.4-st：以添加了1.4g/l亮氨酸的葡萄汁为底物，再接种st菌株进行发酵；
l-1.4-x16：以添加了1.4g/l亮氨酸的葡萄汁为底物，再接种x16菌株进行发酵；
s-0.6-hu：以添加了0.6g/l苏氨酸的葡萄汁为底物，再接种hu菌株进行发酵；
s-0.6-f33：以添加了0.6g/l苏氨酸的葡萄汁为底物，再接种f33菌株进行发酵；
s-0.6-st：以添加了0.6g/l苏氨酸的葡萄汁为底物，再接种st菌株进行发酵；
s-0.6-x16：以添加了0.6g/l苏氨酸的葡萄汁为底物，再接种x16菌株进行发酵；
s-1-hu：以添加了1g/l苏氨酸的葡萄汁为底物，再接种hu菌株进行发酵；
s-1-f33：以添加了1g/l苏氨酸的葡萄汁为底物，再接种f33菌株进行发酵；
s-1-st：以添加了1g/l苏氨酸的葡萄汁为底物，再接种st菌株进行发酵；
s-1-x16：以添加了1g/l苏氨酸的葡萄汁为底物，再接种x16菌株进行发酵；
s-1.4-hu：以添加了1.4g/l苏氨酸的葡萄汁为底物，再接种hu菌株进行发酵；
s-1.4-f33：以添加了1.4g/l苏氨酸的葡萄汁为底物，再接种f33菌株进行发酵；
s-1.4-st：以添加了1.4g/l苏氨酸的葡萄汁为底物，再接种st菌株进行发酵；
s-1.4-x16：以添加了1.4g/l苏氨酸的葡萄汁为底物，再接种x16菌株进行发酵；
yl-0.6-hu：以添加了0.6g/l异亮氨酸的葡萄汁为底物，再接种hu菌株进行发酵；
yl-0.6-f33：以添加了0.6g/l异亮氨酸的葡萄汁为底物，再接种f33菌株进行发酵；
yl-0.6-st：以添加了0.6g/l异亮氨酸的葡萄汁为底物，再接种st菌株进行发酵；
yl-0.6-x16：以添加了0.6g/l异亮氨酸的葡萄汁为底物，再接种x16菌株进行发酵；
yl-1-hu：以添加了1g/l异亮氨酸的葡萄汁为底物，再接种hu菌株进行发酵；
yl-1-f33：以添加了1g/l异亮氨酸的葡萄汁为底物，再接种f33菌株进行发酵；
yl-1-st：以添加了1g/l异亮氨酸的葡萄汁为底物，再接种st菌株进行发酵；
yl-1-x16：以添加了1g/l异亮氨酸的葡萄汁为底物，再接种x16菌株进行发酵；
yl-1.4-hu：以添加了1.4g/l异亮氨酸的葡萄汁为底物，再接种hu菌株进行发酵；
yl-1.4-f33：以添加了1.4g/l异亮氨酸的葡萄汁为底物，再接种f33菌株进行发酵；
yl-1.4-st：以添加了1.4g/l异亮氨酸的葡萄汁为底物，再接种st菌株进行发酵；
yl-1.4-x16：以添加了1.4g/l异亮氨酸的葡萄汁为底物，再接种x16菌株进行发酵；
x-0.6-hu：以添加了0.6g/l缬氨酸的葡萄汁为底物，再接种hu菌株进行发酵；
x-0.6-f33：以添加了0.6g/l缬氨酸的葡萄汁为底物，再接种f33菌株进行发酵；
x-0.6-st：以添加了0.6g/l缬氨酸的葡萄汁为底物，再接种st菌株进行发酵；
x-0.6-x16：以添加了0.6g/l缬氨酸的葡萄汁为底物，再接种x16菌株进行发酵；
x-1-hu：以添加了1g/l缬氨酸的葡萄汁为底物，再接种hu菌株进行发酵；
x-1-f33：以添加了1g/l缬氨酸的葡萄汁为底物，再接种f33菌株进行发酵；
x-1-st：以添加了1g/l缬氨酸的葡萄汁为底物，再接种st菌株进行发酵；
x-1-x16：以添加了1g/l缬氨酸的葡萄汁为底物，再接种x16菌株进行发酵；
x-1.4-hu：以添加了1.4g/l缬氨酸的葡萄汁为底物，再接种hu菌株进行发酵；
x-1.4-f33：以添加了1.4g/l缬氨酸的葡萄汁为底物，再接种f33菌株进行发酵；
x-1.4-st：以添加了1.4g/l缬氨酸的葡萄汁为底物，再接种st菌株进行发酵；
x-1.4-x16：以添加了1.4g/l缬氨酸的葡萄汁为底物，再接种x16菌株进行发酵。
上述每个标记分别代表的发酵产物均为各自含义下分别进行3次平行发酵所得的发酵产物。
4.发酵操作
4种菌株：酿酒酵母s.cerevisiaex16菌株、酿酒酵母s.cerevisiaest菌株、酿酒酵母s.cerevisiaef33菌株、葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniasporauvarum菌株qtx22在使用前均保存于体积比25％甘油/ypd培养基中。ypd培养基为1％葡萄汁有孢汉逊酵母浸粉、2％蛋白胨、2％葡萄糖。按照体积比3％的接种量分别接种于装有40mlypd培养基的50ml三角瓶中和装有150mlypd培养基的250ml三角瓶中，培养温度为28℃,转速为150rpm，培养时间为24h，得到第1次活化的菌液，再按照3％的接种量分别接种于装有40mlypd培养基的50ml三角瓶中和装有150mlypd培养基的250ml三角瓶中重复上述培养，完成第2次传代活化，即得到活化后的菌液。将活化后的葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniasporauvarum菌株qtx22分别接入已收集好的添加了不同梯度浓度氨基酸的葡萄汁中，菌株的总接种量控制在106-107cfu优选6×106cfu，以酿酒酵母s.cerevisiaex16菌株、酿酒酵母s.cerevisiaest菌株、酿酒酵母s.cerevisiaef33菌株、葡萄汁有孢汉逊酵母hanseniasporauvarum菌株qtx22这4中菌株进行单菌发酵的不添加氨基酸的葡萄汁为空白对照，发酵温度为18℃±2℃，待葡萄汁失重连续三天不再变化终止发酵。所有葡萄酒样品在7500rpm下离心8分钟，取上清液于4℃保存。
5.香气物质的定量方法
采用顶空-固相微萃取法-气相质谱法(hs-spme-gc/ms)。准确量取8ml葡萄酒样品加入含有1.5gnacl顶空瓶中，同时394.08μg/l4-甲基-1-戊醇(内标物)，加盖密封。插入car/dvb/pdms萃取纤维，45℃下吸附30min后将萃取纤维在gc进样口250℃下解吸3min，进行gc-ms分析。色谱柱：inertcapwax极性色谱柱(60m×0.25mm，0.25μm)；升温程序为：40℃保持5min，以3℃/min升至120℃，再以8℃/min升至230℃，保持10min；载气(he)流速0.8ml/min，不分流。电子轰击离子源；电子能量70ev；传输线温度275℃；离子源温度230℃；激活电压1.5v；灯丝流量0.25ma；质量扫描范围m/z33～450。采用外标定量法进行化合物定量分析。
6.数据分析方法
各标记对应的3次平行发酵产物做为3个样品分别测定香气物质含量，每个样品均分别平行测定3次取平均值。使用spss22.0forwindows(spssinc.，chicago,il,us)进行单因素方差分析(anova)和duncan`s多范围检验(p<0.05)；unscrambler9.7(camoasa,norway)进行偏最小二乘法分析。
最终统计整理得到下表1-4，表中数据的单位为μg/l，含义：每升葡萄酒中该香气物质的含量。
表1、添加亮氨酸的葡萄汁发酵产物的香气物质含量
表2.添加苏氨酸的葡萄汁发酵产物的香气物质含量
表3.添加缬氨酸的葡萄汁发酵产物的香气物质含量
表4.添加异亮氨酸的葡萄汁发酵产物的香气物质含量
上表1-4中的香气阈值指人类可以嗅闻到该物质的最低浓度下限值，香气描述和阈值均以记载有该类香气物质的香气描述和阈值的相关文献报道为准，表中无香气描述和阈值的香气物质则是未检索到有关该物质的香气描述和阈值的相关记载的文献。表头中的各标记含义如本实验例第3部分记载。
发酵领域公知，影响发酵的因素众多且复杂，发酵后的产品成分会因原料批次、原料成分、发酵条件、温度、时间等因素的变化而变化，因此也会出现在某些香气成分上单菌发酵高于添加氨基酸发酵的情况，这在本领域属正常现象。