一种提高蛹虫草虫草素含量的液体发酵培养基

文档序号:26013560发布日期:2021-07-23 21:34阅读:154来源:国知局
本发明涉及蛹虫草养殖领域,尤其涉及一种提高蛹虫草虫草素含量的液体发酵培养基。
背景技术
:蛹虫草(cordycepsmilitaris)又名北冬虫夏草,为子囊菌门,肉座目,麦角菌科、虫草属真菌,由子座(子实体)和菌核组成的复合体。蛹虫草的功效与冬虫夏草相似,且虫草素的含量高于冬虫夏草,可作为冬虫夏草良好的替代品。蛹虫草富含多种活性化合物,其中包括1)核苷类,如虫草素、腺苷、腺嘌呤和次黄嘌呤等;2)虫草多糖;3)虫草甾醇和糖醇类物质,如虫草酸(又名d-甘露醇)、麦角甾醇和胆固醇等;4)酶类,如超氧化物歧化酶(sod)纤维蛋白溶解酶和溶栓酶等等,现广泛应用于医药行业。其中,虫草素是蛹虫草重要的活性成分之一,具有很多生物活性,如抗癌抗肿瘤、抗菌、抗炎、抗氧化、免疫调节等;在1950年,德国科学家cunningham从蛹虫草中首次分离出来。虫草素主要有三种生产方法,一种是传统的从蛹虫草、冬虫夏草等虫草类中提取,该方法受地域、气候影响比较大,且产量不高;二是通过化学全合成获得,此方法合成过程复杂、成本高且释放有机试剂,对人体健康和生活环境有害;第三种方法是采用基因工程技术通过微生物发酵获得,该方法产量高,生产稳定,生产成本低,且工艺绿色环保。技术实现要素:本发明的目的是提供一种高产虫草素的蛹虫草液体发酵培养基,以解决现有技术中蛹虫草中虫草素含量较低的问题。本发明的培养基提高了蛹虫草的生产效率,且生产设备简单,生产设备易于控制,生产周期短,生产成本低;该培养基培养的蛹虫草菌株的胞内虫草素含量为70.39mg/l,胞外虫草素含量为1080.20mg/l。为解决上述技术问题,本发明采用如下技术方案本发明提供一种提高蛹虫草中虫草素含量的液体发酵培养基,所述的提高蛹虫草中虫草素含量的液体发酵培养基包括以下终浓度的各组分:可溶性淀粉20-40g/l,蛋白胨10-30g/l,kh2po40.5-1.5g/l,mgso4·7h2o0.5-1.5g/l,l-甘氨酸1.0-5.0g/l,溶剂为蒸馏水,ph自然。优选地,所述的提高蛹虫草中虫草素含量的液体发酵培养基包括以下终浓度的各组分:可溶性淀粉25g/l,蛋白胨20g/l,kh2po41g/l,mgso4·7h2o1g/l,l-甘氨酸3g/l,溶剂为蒸馏水,ph自然。进一步优选地,所述提高蛹虫草中虫草素含量的液体发酵培养基还包括所述蛹虫草具有抗性的抗生素。优选所述抗生素的浓度为100μg/ml。本发明还提供一种上述提高蛹虫草中虫草素含量的液体发酵培养基在蛹虫草发酵中的应用,所述应用为:以5%的体积接种量将蛹虫草种子液接种至所述的提高蛹虫草中虫草素含量的液体发酵培养基中,18-25℃恒温,150-190rpm条件下培养9d,获得蛹虫草发酵液。所得蛹虫草发酵液中虫草素含量较其他培养基明显提高。优选地,所述提高蛹虫草中虫草素含量的液体发酵培养基包括所述蛹虫草具有抗性的抗生素。特别优选所述的提高蛹虫草中虫草素含量的液体发酵培养基含100μg/ml头孢菌素,所述蛹虫草种子液中蛹虫草具有头孢菌素抗性。进一步,所述蛹虫草种子液按以下方法制备:(1)母种制备:在无菌条件下将蛹虫草接种至pda培养基上,18-25℃恒温避光培养5-7d,获得原始母种;所述蛹虫草为cordycepsmilitarisaf2021025,具有头孢菌素抗性;保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏日期:2021年01月04日,地址:中国,武汉,武汉大学,430072;(2)种子液制备:取步骤(1)获得的原始母种在无菌条件下接种至含200μg/ml头孢菌素的种子液培养基中,18-25℃恒温,150-190rpm条件下培养3-5d,获得所述蛹虫草种子液。优选所述的提高蛹虫草中虫草素含量的液体发酵培养基含100μg/ml头孢菌素。优选地,步骤(1)中所述的pda培养基由以下终浓度的各组分组成:马铃薯200g/l,葡萄糖20g/l,琼脂粉15-20g/l。优选地,步骤(2)中所述的种子液培养基由以下终浓度的各组分组成:葡萄糖20-25g/l,蛋白胨10-20g/l,kh2po40-1.5g/l,k2hpo40-1.5g/l,mgso4·7h2o0-1.5g/l,l-甘氨酸1.0g/l,溶剂为蒸馏水,ph自然。进一步,所述的pda培养基的制备方法为:选取新鲜的马铃薯洗干净后切块备用,加蒸馏水加热煮10-15min,过滤得马铃薯汁;然后加入组方量葡萄糖、琼脂粉,完全溶解后,用蒸馏水定容,制成所述pda培养基。所述蛹虫草发酵液用hplc法检测胞内、外虫草素的含量;其中色谱条件:c18色谱柱(250mm×4.6mm),紫外检测波长260nm,流动相甲醇(25ml):水(75ml),流速1.0ml/min,进样量5μl。与现有技术相比,本发明的有益效果在于:采用上述的技术方案后,本发明提供的培养基培育蛹虫草菌株,使得虫草素的生产效率提高了,且生产设备简单,生产条件易于控制,生产周期短,生产成本低,对提高虫草素产量的进一步研究和开发利用具有重要意义。具体实施方式根据实施例所示,对本发明进行进一步说明:实施例11.分别进行pda培养基、种子液培养基和液体发酵培养基的制备,pda培养基的制备方法为:选取新鲜的马铃薯200g洗干净后切块备用,用700ml蒸馏水加热煮10-15min,对其过滤得马铃薯汁,然后加入葡萄糖20g,琼脂粉15g完全溶解后,用蒸馏水定容至1l,制成pda培养基;种子液培养基的制备方法为:将葡萄糖20g,蛋白胨10g,kh2po40.5g,k2hpo40.5g,mgso4·7h2o0.5g,l-甘氨酸1g用500ml蒸馏水完全溶解后,加蒸馏水定容至1l,ph自然,制成种子液培养基。液体发酵培养基的制备方法为:碳源25g,蛋白胨10g,kh2po40.5g,mgso4·7h2o0.5g,用500ml蒸馏水完全溶解后,加蒸馏水定容至1l,ph自然,制成液体发酵培养基。为筛选最优的碳源,分别用可溶性淀粉、玉米糊精、蔗糖、麦芽糖、果糖、白砂糖、乳糖及葡萄糖作为碳源、碳源浓度及液体发酵培养基其他成分和浓度不变,依次配制好这些液体发酵培养基。2.蛹虫草培养基制备完成后备用,然后进行母种的制备。将斜面上的蛹虫草菌种(cordycepsmilitarisaf2021025;保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏日期:2021年01月04日,地址:中国,武汉,武汉大学,430072),在无菌条进下接种至pda培养基上,25℃恒温避光培养7d,获得原始母种;然后将制备的原始母种在无菌条件下接种至50ml含200μg/ml头孢菌素的种子液培养基中,25℃恒温,150rpm条件下培养5d,获得蛹虫草的种子液;最后取2.5ml的种子液在无菌条件下分别接种至50ml含不同碳源的液体发酵培养基(含100μg/ml头孢菌素)中,25℃恒温,150rpm条件下培养9d,获得蛹虫草的发酵液。3.虫草素标准品溶液的制备:精密称取虫草素标准品2.5mg,用去离子水溶解,定容至25ml,配成浓度为0.10mg/ml的虫草标准品储备液,4℃储存备用。取标准品储备液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0ml,分别用去离子水稀释定容至10ml,0.45μm微孔滤膜过滤,最终虫草素标准品溶液的系列浓度为0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg/ml。采用高效液相色谱法对虫草素标准品溶液进行分析:①高效液相色谱条件:c18色谱柱(250mm×4.6mm),紫外检测波长260nm,流动相甲醇(25ml):水(75ml),流速1.0ml/min,进样量5μl。②测定方法:分别精密吸取不同浓度的虫草素标准品溶液(0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg/ml)各5μl,依次注入液相色谱仪,记录色谱图及峰面积,实验重复3次,结果取平均值,见表1。结果显示:虫草素在0.02-0.10mg/ml浓度范围内具有良好的线性关系,回归方程为y(mv·min)=27692919.69x-135695.5252(r2=0.999728197),x的单位是mg/ml。表1不同浓度的虫草素标准品的峰面积4.将上述的蛹虫草发酵液常温10000r/min离心10min,收集蛹虫草的菌丝体和发酵上清液。菌丝体用蒸馏水重复洗涤三次后60℃干燥至恒重,研磨过6号筛得粉末,菌丝粉末称量,称量结果见表2。5.准确称取菌丝粉末50mg,加入40ml去离子水,80℃加热提取3h。5000r/min离心取上清液,减压蒸馏后定容至1ml,得到的提取液经0.45μm滤膜过滤后供检测。另外,发酵上清液取1ml过0.45μm微孔滤膜供检测。采用hplc法对提取液及发酵上清液先进行预实验分析,高效液相色谱条件同虫草素标准品溶液的分析,记录色谱图及峰面积,发现提取液及发酵上清液的谱图上出现峰面积不在线性关系的峰面积范围内和平头峰,则对提取液及发酵上清液进行稀释,具体稀释步骤为:过0.45μm微孔滤膜的100μl提取液加入300μl无菌去离子水稀释混匀,记为提取液的稀释液;过0.45μm微孔滤膜的100μl发酵上清液加入1ml无菌去离子水稀释混匀,记为发酵上清液的稀释液。6.采用hplc法对提取液的稀释液和发酵上清液的稀释液进行分析,高效液相色谱条件同虫草素标准品溶液的分析,分别精密吸取提取液的稀释液和发酵上清液的稀释液各5μl,依次注入液相色谱仪,记录色谱图和峰面积,实验重复3次,结果取平均值,见表3和表4。表2菌丝体的称量表3峰面积和虫草素浓度表4峰面积和虫草素浓度因此,考虑到发酵液中虫草素含量即胞外虫草素含量和胞内虫草素含量,筛选出该株蛹虫草液体发酵培养的最佳碳源是可溶性淀粉。实施例21.分别进行pda培养基、种子液培养基和液体发酵培养基的制备。pda培养基、种子液培养基的制备方法同实施案例1,液体发酵培养基的制备如下:可溶性淀粉25g,氮源10g,kh2po40.5g,mgso4·7h2o0.5g,用500ml蒸馏水完全溶解后,加蒸馏水定容至1l,ph自然,制成液体发酵培养基。另外,为筛选出最优的氮源,选用酵母提取物、牛肉浸膏、硫酸铵、硝酸钠、大豆粉和尿素及蛋白胨作为氮源、氮源浓度及液体发酵培养基其他成分和浓度不变,依次配制好这些液体发酵培养基。2.蛹虫草培养基制备完成后备用,母种及种子液的制备同实施案例1。取2.5ml的种子液在无菌条件下分别接种至50ml含不同氮源的液体发酵培养基(含100μg/ml头孢菌素)中,25℃恒温,150rpm条件下培养9d,获得蛹虫草的发酵液。3.虫草素标准品溶液的制备及采用hplc法对虫草素标准品溶液进行分析时高效液相色谱条件和测定方法同实施案例1。4.将上述2的蛹虫草发酵液常温10000r/min离心10min,收集蛹虫草的菌丝体和发酵上清液。菌丝体用蒸馏水重复洗涤三次后60℃干燥至恒重,研磨过6号筛得粉末,菌丝粉末称量,结果如表5。5.提取液的稀释液和发酵上清液的稀释液的制备方法同实施案例1,采用hplc法对提取液的稀释液和发酵上清液的稀释液进行分析,高效液相色谱条件同实施案例1,分别精密吸取提取液的稀释液和发酵上清液的稀释液各5μl,依次注入液相色谱仪,记录色谱图和峰面积,实验重复3次,结果取平均值,见表6和表7。表5菌丝体的称量氮源菌丝体(g)蛋白胨0.62酵母提取物0.58牛肉浸膏0.74硫酸铵0.39硝酸钠0.32大豆粉0.49尿素0.29表6峰面积和虫草素浓度表7峰面积和虫草素浓度因此,考虑到发酵液中虫草素含量即胞外虫草素含量和胞内虫草素含量,筛选出该株蛹虫草液体发酵培养的最佳氮源是蛋白胨。实施例31.为筛选出蛹虫草生产虫草素的最优液体发酵培养基,对培养基成分进行正交筛选。将上述筛选出的可溶性淀粉、蛋白胨分别作为一个因素,再把无机盐(kh2po4和mgso4·7h2o)和添加剂l-glycine分别作为一个因素;且每个因素选定三个水平,利用l9(34)设计正交实验,如表8。表8实验因素及水平表2.按表10中的9组实验的培养基配方制备好液体发酵培养基,pda培养基、种子液培养基的制备方法同实施案例1。蛹虫草培养基制备完成后备用,母种及种子液的制备同实施案例1。分别取2.5ml的种子液在无菌条件下分别接种至9组50ml的液体发酵培养基(含100μg/ml头孢菌素)中,25℃恒温,150rpm条件下培养9d,获得蛹虫草的发酵液。3.虫草素标准品溶液的制备及采用hplc法对虫草素标准品溶液进行分析时高效液相色谱条件和测定方法同实施案例1。4.由上述实施案例1和2可知虫草素主要集中在蛹虫草的发酵上清液中,因此以发酵液中的胞外虫草素含量为指标,筛选高产虫草素的发酵培养基结果如表10和表11(发酵上清液的制备、处理方法和检测方法同实施案例1,峰面积及虫草素浓度结果见表9)。表9峰面积及虫草素浓度表10液体发酵培养基正交实验直观分析表表11液体发酵培养基正交实验方差分析表从正交实验的直观分析表中可发现c因素的极差值r最大,其次是d>b>a,说明了无机盐(kh2po4+mgso4·7h2o)是对胞外虫草素含量影响最大的因素,其次是l-glycine、蛋白胨及可溶性淀粉;从方差分析结果也可知无机盐(kh2po4+mgso4·7h2o)因素对胞外虫草素含量影响最大,其次是l-glycine、蛋白胨,最后是可溶性淀粉,与直观分析表结果一致,表明因素的最佳组合是a1b3c3d3即可溶性淀粉25g/l,蛋白胨20g/l,kh2po4+mgso4·7h2o1.0g/l,l-glycine3.0g/l。因此,确定了最佳液体发酵培养基的配方为可溶性淀粉25g/l,蛋白胨20g/l,kh2po41.0g/l,mgso4·7h2o1.0g/l,l-glycine3.0g/l,溶剂为去离子水,ph自然。以上所述的具体实施案例仅是本发明的优选实施方式,应当指出的是,对于本
技术领域
的技术人员来说,在不违背本发明原理的前提下,还可以进行适当的修改和改进,这些均在本发明的保护范围内。当前第1页12
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