抗CEACAM5纳米抗体

文档序号:26139593发布日期:2021-08-03 14:23阅读:85来源:国知局
抗CEACAM5纳米抗体
本发明涉及生物
技术领域
,具体地,本发明涉及纳米抗体及其制备方法和应用,该纳米抗体可应用于ceacam5蛋白检测试剂及治疗性抗体的研发。
背景技术
:癌胚抗原(cea)是一种从结肠癌和胎儿肠组织中发现的蛋白,临床上较早用于肿瘤检测的标志物,在正常人的体细胞中cea的生成量较少,而在恶性肿瘤患者的多种器官中都会有表达,能够用于肿瘤的诊断及鉴别,但是该肿瘤标准物的诊断缺少特异性。cea很高主要出现在胰腺癌、大肠癌、乳腺癌、胃癌以及小细胞肺癌等多种肿瘤中,cea在肿瘤患者血清中诊断的灵敏度与肿瘤有无淋巴结、肿瘤的大小以及肿瘤是否发生其他部位的转移有着密切的关系。1993年hamers-casterman等在nature上报道了在骆驼血清中大量存在的一种天然缺失轻链的抗体,即重链抗体。单域重链抗体是指仅由重链抗体可变区组成的基因工程抗体,又称为vhh抗体或者纳米抗体(nb)。与普通抗体相比,骆驼重链抗体除了缺少轻链之外,其重链可变区与铰链区之间没有ch1区。恒定区ch1是与轻链锚定的部位,在纳米抗体的基因组中存在,但在mrna形成中被剪掉,纳米抗体靠仅有的3个cdrs就具备抗原的特异性和高亲和力,而普通抗体则需要6个cdrs,是目前已知的可结合目标抗原的最小单位。和普通抗体相比,纳米抗体分子量小,结构简单,易于进行基因改造,体积小,抗原特异性好,组织穿透力强,稳定性高,在疾病的诊断及治疗方面有广阔的应用前景。基于此,我们研发了全新的针对ceacam5的纳米抗体,以期进一步提高抗体的功能。技术实现要素:本发明所要解决的技术问题是提供一种针对ceacam5的纳米抗体,同时提供该纳米抗体的编码序列以及制备方法。本申请的发明人采用羊驼免疫与噬菌体展示技术相互结合,开发出了靶向ceacam5的高亲和纳米抗体。一方面,本发明提出了一种纳米抗体。根据本发明的实施例,所述纳米抗体的氨基酸序列为seqidno:1。根据本发明实施例的纳米抗体是特异性靶向ceacam5蛋白的抗体,能够结合天然构象的ceacam5蛋白,并且所述纳米抗体具有如下较普通抗体的独特性质:(1)高水溶性、高耐性、高稳定性,高抗原结合性、低免疫原性以及较强的组织穿透力。根据本发明的实施例,所述纳米抗体的氨基酸序列为seqidno:1所示,其框架区为seqidno:2所示的fr1,seqidno:4所示的fr2,seqidno:6所示的fr3,seqidno:8所示的fr4;其互补决定区为seqidno:3所示的cdr1,seqidno:5所示的cdr2,seqidno:7所示的cdr3。根据本发明实施例的纳米抗体是特异性靶向ceacam5蛋白的抗体,能够结合天然构象的ceacam5蛋白,并且所述纳米抗体具有高水溶性、高耐性、高稳定性,高抗原结合性、低免疫原性以及较强的组织穿透力。又一方面,本发明提出了一种核酸。根据本发明的实施例,所述核酸为:编码前面所述纳米抗体的核酸或其互补序列。根据本发明实施例的核酸特异性编码前面所述的纳米抗体,所述纳米抗体能够特异性靶向ceacam5,结合天然构象的ceacam5,具有高水溶性、高耐性、高稳定性,高抗原结合性、低免疫原性以及较强的组织穿透力。根据本发明的实施例,所述核酸具有seqidno:9所示核苷酸序列。根据本发明实施例的上述核酸所编码的蛋白具有与ceacam5显著的高亲和活性,且该蛋白具有典型的纳米抗体的结构,即由框架区(fr1,fr2,fr3和fr4)和互补决定区(cdr1,cdr2和cdr3)构成。需要说明的是,对于本发明权利要求书和说明书中所提及的核酸,本领域技术人员应当理解,实际包括互补双链的任意一条,或者两条。为了方便,在本权利要求书和说明书中,虽然多数情况下只给出了一条链,但实际上也公开了与之互补的另一条链。另外,本申请中的基因序列包括dna形式或rna形式,公开其中一种,意味着另一种也被公开。再一方面,本发明提供了一种表达载体,其包含上述核酸。又一方面,本发明提供了一种宿主细胞,其包含上述表达载体。有益效果:与传统抗体制备技术相比,本发明将羊驼免疫与噬菌体展示技术相互结合,充分利用了噬菌体展示技术的优势——(1)较大的库容量,筛选操作简单,通量高;(2)高效率的淘选使得成功挑选微量存在但亲和力高的噬菌体成为可能,并能通过感染细菌而得到富集;(3)可以直接得到抗体基因,便于进一步构建各种基因工程抗体,还可用于一些难于制备的抗体,如弱免疫原、毒性抗原等,以及人源化抗体。所获得纳米抗体,较传统抗体,具有明显的高水溶性、高耐性、高稳定性,高抗原结合性、低免疫原性以及较强的组织穿透力的优势。本发明的优点如下:本发明将重组ceacam5蛋白免疫羊驼,随后利用该羊驼外周血淋巴细胞建立了针对于ceacam5的纳米抗体基因库,试验中将ceacam5偶联在酶标板上,以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选免疫性的纳米抗体基因库(羊驼重链抗体噬菌体展示基因库),从而获得了针对ceacam5特异性的纳米抗体基因,将此基因转至大肠杆菌中,从而建立了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。附图说明图1显示实施例的免疫后羊驼血清中ceacam5抗体elisa检测结果图。图2显示实施例的sds-page电泳检测ceacam5纳米抗体的表达结果图。图3显示实施例的纯化的ceacam5纳米抗体亲和力的elisa检测结果图。具体实施方式下面通过具体实施例进一步描述本发明,但本发明不仅限于所述实施例。实施例1构建针对ceacam5蛋白的纳米抗体文库将重组ceacam5蛋白与弗氏佐剂混合后免疫羊驼,共免疫4次。4次免疫结束后,提取50ml羊驼外周血淋巴细胞并提取总rna;然后通过nest-pcr技术克隆抗体的vhh区,并将克隆产物通过同源重组的方法插入噬菌体,以获得噬菌体展示库。实施例2亲和淘选以及淘选后的文库扩增(1)亲和淘选1)将重组ceacam5蛋白用ph值为9.6的碳酸盐缓冲液稀释至终浓度为5μg/ml,按100µl/孔加入酶标孔中,每个靶分子包被8孔,4℃包被过夜;2)弃包被液,pbs洗涤3次,每孔加入300µl3%bsa-pbs封闭液,37℃封闭1h;3)pbs洗涤3次,加入100µl噬菌体文库,37℃孵育1h;5)吸出未结合的噬菌体,用pbst洗涤6次,pbs洗涤2次;6)加入100µlgly-hcl洗脱液,37℃孵育8min,洗脱特异性结合的噬菌体;将该洗脱液转移至1.5ml无菌离心管中,迅速用10μltris-hcl中和缓冲液中和;7)取10µl进行梯度稀释,测定滴度,计算淘选回收率,其余洗脱物混合后进行扩增和纯化,用于下一轮亲和淘选,改变淘选条件,淘选条件如表1:表1亲和淘选条件轮次抗原包被浓度(µg/ml)封闭液文库投入量(cfu)结合时间(h)pbst浓度pbst洗涤次数15bsa-pbs2×101110.1%6(2)淘选后文库的扩增1)将淘选洗脱物与处于对数生长前期的e.colitg1培养物5ml混匀,37℃,静置30min,220r/min振荡培养30min;1000g离心15min,去上清,用500μl2×yt重悬涂布于200mm2×yt-ga平板;2)用10ml2×yt液体培养基刮菌,取500μl悬液加入50ml2×yt液体培养基中,37℃振摇30min;按cell:phage=1:20的比例加入m13k07辅助噬菌体,37℃静置30min,220r/min振荡培养30min;将培养物分装于离心管中,25℃,5000r/min,10min,细胞沉淀以50ml2×yt-ak液体培养基重悬,30℃,230r/min振荡培养过夜;3)将过夜培养物4℃,10000r/min离心20min,将上清转移至新离心管,加入1/5体积的peg-nacl,混匀后置于4℃2h以上;4)4℃,10000r/min,20min,去除上清,将沉淀重悬于1mlpbs中,加入1/5体积的peg/nacl,混匀后置于4℃1h以上;5)4℃,12000r/min,2min,去除上清,将沉淀悬浮于200µlpbs中,即为扩增产物,测定滴度,用于下一轮淘选或者分析。实施例3特异性噬菌体克隆的鉴定及分析(1)噬菌粒的救援1)从第一轮淘选洗脱物滴度的平板上,用灭菌牙签各随机挑取96个单克隆接种于1ml2×yt-a中,37℃,220r/min振荡培养8h。2)取200µl上述培养物,按cell:phage=1:20的比例加入m13k07噬菌体,37℃,静置15min,220r/min振荡培养45min。3)补加800µl体积的2×yt-ak,30℃,振荡培养过夜。4)第二天12000rpm离心2min,取上清,用于单克隆elisa鉴定。(2)阳性噬菌体克隆的鉴定1)将重组ceacam5蛋白用ph值为9.6的碳酸盐缓冲液稀释至终浓度为2μg/ml,按100µl/孔加入酶标孔中,4℃包被过夜;2)弃包被液,pbst洗涤3次,每孔加入300µl5%脱脂牛奶,37℃封闭1h;3)pbst洗涤3次,每孔加入50μl噬菌体培养菌液上清和50μl5%脱脂牛奶,37℃,孵育1h;4)pbst洗涤5次,加入辣根过氧化物酶标记的抗m13抗体(用5%脱脂奶粉按1:10000稀释),100μl/孔,37℃作用1h;5)pbst洗板6次。加入tmb显色液显色,100μl/孔,37℃,7min,加入终止液终止反应,50μl/孔,于450nm下测光密度;(3)阳性噬菌体克隆的序列分析将阳性克隆进行测序分析。实施例4在原核表达系统中表达纯化ceacam5纳米抗体1)将前面测序分析获得不同克隆株的vhh片段克隆到bl21(de3)原核表达载体中;2)涂布lb平板(50ug/ml卡那霉素);3)挑选单个菌落接种在15ml含有卡那霉素的lb培养液中,37℃摇床培养过夜;4)接种1ml的过夜菌种至300mllb培养基中,37℃摇床培养,培养到od值达到0.6-1时,加入iptg,16℃摇床培养16-20h;5)离心收菌,将菌体破碎以获得抗体粗提液;6)经镍柱离子亲和层析纯化抗体蛋白,采用咪唑梯度洗脱法,低浓度咪唑洗脱液(30mmol)用于洗去杂带,高浓度咪唑洗脱液(200mmol,500mmol)最终可制备纯度达90%以上的蛋白;通过上述方法,本发明得到ceacam5纳米抗体a94。a94氨基酸序列(seqidno:1)evqvvesggglvqpggslrlsctasgrsfssytygmgwfrqapgeerefvagistsggtaayatsvkgrftisrdnakntvylqmnslkpedtgvyycaatsmtwygnnraseyaywgqgtqvtvssfr1:evqvvesggglvqpggslrlsctas(seqidno:2)cdr1:grsfssytyg(seqidno:3)fr2:mgwfrqapgeerefvag(seqidno:4)cdr2:istsggta(seqidno:5)fr3:ayatsvkgrftisrdnakntvylqmnslkpedtgvyyc(seqidno:6)cdr3:aatsmtwygnnraseyay(seqidno:7)fr4:wgqgtqvtvss(seqidno:8)整体核苷酸序列:gaggtgcaggtggtggagtcagggggaggattggtgcagcctgggggctctctgagactctcctgtacagcctctggacgcagcttcagctcctatacctatggcatgggctggttccgccaggctccaggtgaggagcgtgagtttgtagcaggtattagcacgagtggtggtaccgctgcctatgcaacctccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaacacggtgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacacgggcgtttattactgtgcagctacgagtatgacctggtacgggaacaaccgtgcatctgagtatgcctactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctcagcgcaccacagcgaagaccccagc(seqidno:9)序列表<110>中山大学附属第五医院<120>抗ceacam5纳米抗体<160>9<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>127<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>1gluvalglnvalvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly151015serleuargleusercysthralaserglyargserphesersertyr202530thrtyrglymetglytrppheargglnalaproglyglugluargglu354045phevalalaglyileserthrserglyglythralaalatyralathr505560servallysglyargphethrileserargaspasnalalysasnthr65707580valtyrleuglnmetasnserleulysprogluaspthrglyvaltyr859095tyrcysalaalathrsermetthrtrptyrglyasnasnargalaser100105110glutyralatyrtrpglyglnglythrglnvalthrvalserser115120125<210>2<211>25<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>2gluvalglnvalvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly151015serleuargleusercysthralaser2025<210>3<211>10<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>3glyargserphesersertyrthrtyrgly1510<210>4<211>17<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>4metglytrppheargglnalaproglyglugluarggluphevalala151015gly<210>5<211>8<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>5ileserthrserglyglythrala15<210>6<211>38<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>6alatyralathrservallysglyargphethrileserargaspasn151015alalysasnthrvaltyrleuglnmetasnserleulysprogluasp202530thrglyvaltyrtyrcys35<210>7<211>18<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>7alaalathrsermetthrtrptyrglyasnasnargalaserglutyr151015alatyr<210>8<211>11<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>8trpglyglnglythrglnvalthrvalserser1510<210>9<211>405<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9gaggtgcaggtggtggagtcagggggaggattggtgcagcctgggggctctctgagactc60tcctgtacagcctctggacgcagcttcagctcctatacctatggcatgggctggttccgc120caggctccaggtgaggagcgtgagtttgtagcaggtattagcacgagtggtggtaccgct180gcctatgcaacctccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaacacg240gtgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacacgggcgtttattactgtgcagct300acgagtatgacctggtacgggaacaaccgtgcatctgagtatgcctactggggccagggg360acccaggtcaccgtctcctcagcgcaccacagcgaagaccccagc405当前第1页12
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