一种可标记鱼类生殖干细胞的多克隆抗体的制备方法

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种可标记鱼类生殖干细胞的多克隆抗体的制备方法。

背景技术：

鱼类生殖干细胞的鉴定和评估是以生殖细胞操作为基础的鱼类育种工作的基础。为了能方便地鉴定鱼类成体性腺中的生殖干细胞以及有效评估生殖干细胞自我更新和维持状态，需要对鱼类性腺中的生殖干细胞进行鉴定和评估。目前对鱼类生殖干细胞的鉴定方法仅局限在形态学鉴定及基因检测上，尚未有采用抗体进行检测的相关报道。

技术实现要素：

基于此，本发明的目的在于提供一种可标记鱼类生殖干细胞的多克隆抗体的制备方法，制备得到的多克隆抗体可以用于鱼类性腺中生殖干细胞的鉴定，具体的制备方法包括以下步骤：收集纯化斑马鱼nanos2蛋白质，用纯化后的nanos2蛋白质免疫动物得到含有多克隆抗体的血清，纯化血清即得。

其中，斑马鱼nanos2蛋白质的编码区序列如seqidno:1所示。

作为本发明的一种实施方式，斑马鱼nanos2蛋白质的收集纯化包括以下步骤：将斑马鱼nanos2的蛋白质编码区克隆到表达载体中，将重组表达载体转化到大肠杆菌中进行表达，纯化表达产物即得。

作为本发明的一种实施方式，所述表达载体为pet-28a表达载体。

作为本发明的一种实施方式，重组表达载体的制备包括以下步骤：人工合成大肠杆菌密码子优化后的含有酶切位点的斑马鱼nanos2蛋白质编码序列；酶切上述合成序列和pet-28a表达载体；用连接酶将酶切后的合成序列和pet-28a连接即得。

作为本发明的一种实施方式，斑马鱼nanos2蛋白质的表达包括以下步骤：选取转化成功单克隆培养至菌体od600为0.6～0.8，加入iptg诱导表达，培养3～5h后离心，收集菌体并破碎，上清沉淀分别制样并sds-page分析。

作为本发明的一种实施方式，斑马鱼nanos2蛋白质的纯化采用ni柱亲和层析纯化。

作为本发明的一种实施方式，斑马鱼nanos2蛋白质纯化时所用的平衡液为tris-triton-nacl缓冲液，ph8.0；清洗缓冲液为含有20mm咪唑的tris-triton-nacl缓冲液，ph8.0；洗脱缓冲液为含有500mm咪唑的tris-triton-nacl缓冲液。

作为本发明的一种实施方式，多克隆抗体血清的制备包括以下步骤：选择新西兰白兔，预养并标记；抽取抗原，首次免疫抗原浓度为1mg/ml，兔子为0.5ml/只，二-四次免疫抗原浓度减半，剂量不变；抽取佐剂，佐剂和抗原按1:1体积比抽取，首次免疫采用完全佐剂，二-四次免疫采用不完全佐剂，抽取时，佐剂要充分混合均匀后再抽入注射器，进行完全乳化；皮下注射免疫兔子，首次免疫后第14天进行二次免疫，二次免疫到三次免疫间隔时间为7天，兔子第三次免疫后第7天耳中动脉采小样血清检测，检测合格，7天后补加一次免疫，免疫完7天后采集全血。

本发明的目的之二还在于保护上述方法制备得到的多克隆抗体。

本发明的目的之三还在于保护上述多克隆抗体在鱼类生殖干细胞鉴定和评估研究中的应用。

本发明采用斑马鱼nanos蛋白质作为免疫原免疫动物制备得到，制备得到的抗体通过特异性识别生殖干细胞特异性分子标记蛋白质nanos2，能够用于免疫组织化学及免疫荧光检测，特异性标记和检测斑马鱼精巢和卵巢中的生殖干细胞，填补了利用抗体特异性检测鱼类性腺细胞中生殖干细胞应用的空白。因nanos蛋白质一级和二级结构具有跨鱼类各种属的保守型，因此该抗体还能够识别其他鱼类的蛋白质nanos2。

附图说明

图1为实施例1中大肠杆菌经过诱导和不经过诱导后上清和沉淀中的总蛋白质表达量的比较，其中条带1为marker、条带2为#1克隆未诱导条件下总蛋白质、条带3为#1克隆诱导条件下总蛋白质、条带4为#2克隆未诱导条件下总蛋白质、条带5为#2克隆诱导条件下总蛋白质；

图2为实施例1中大肠杆菌经过诱导并超声破碎后nanos2分别在上清和沉淀中的表达量比较，其中条带1为marker、条带2为#1克隆上清中的蛋白质、条带3为#1克隆沉淀中的蛋白质；

图3为实施例1中nanos2蛋白质洗脱前后的表达量的比较，其中条带1为marke、条带2为ct(穿透液)对照、条带3为洗涤液、条带4为洗脱液1、条带5为洗脱液2、条带6为洗脱液3；

图4为实施例3中抗体标记斑马鱼成鱼精巢中的生殖干细胞的免疫荧光结果；

图5为实施例3中抗体标记斑马鱼成鱼卵巢中的生殖干细胞的免疫荧光结果；

图6为实施例3中抗体标记黄河鲤精巢中的生殖干细胞的免疫荧光结果；

图7为实施例3中抗体标记鲫鱼精巢中的生殖干细胞的免疫荧光结果。

具体实施方式

以下结合具体实施方式对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语均属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

实施例1nanos2全长蛋白质序列的制备

发明人经过分析研究发现，斑马鱼nanos2全长蛋白质序列和其他常见鱼类的至少73种的nanos2全长蛋白质序列具有较高同源性，通过抗原表位的预测，发现其抗原表位在全长蛋白质从n端至c端均有分布，因此，发明人采用全长蛋白质序列作为免疫原。上述免疫原的详细制备步骤如下：

(1)表达载体的构建：将nanos2蛋白质编码区cdna序列经大肠杆菌密码子优化后，采用人工合成的方法进行dna序列的合成(见seqidno:1所示)，同时在序列两端带bamh1/xhol1酶切位点，利用酶切连接的方法克隆进入pet-28a表达载体。

(2)质粒转化：将构建得到的pet-28a-nanos2质粒转化bl21(de3)感受态细胞，涂平板后37℃倒置培养过夜。

(3)表达鉴定及可溶性分析：

a、选取单克隆于lb培养液中37℃培养至菌体od600为0.6～0.8，分别加入iptg至终浓度为0mm、0.2mm、0.5mm、1mm，分别在37℃和15℃，200rpm培养4h和16h后离心，收菌制样，sds-page分析。

b、取上一步各条件下的菌液离心收集菌体，破碎，上清沉淀分别制样，sds-page分析。

c、确定出表达最优克隆菌株37℃扩大培养1l至od600为0.6～0.8，分别加入iptg至终浓度为0mm和0.2mm，37℃诱导4h后收集菌体，重悬菌体并超声破碎。

d、离心，沉淀经溶解后，离心，上清进行ni柱亲和层析纯化。其中亲和层析纯化中所用的平衡缓冲液为：tris-triton-nacl缓冲液，ph8.0；清洗缓冲液为含有20mm咪唑的tris-triton-nacl缓冲液，ph8.0；洗脱缓冲液为含有500mm咪唑的tris-triton-nacl缓冲液，制样sds-page分析，结果参见图1。

实施例2多克隆抗体的制备和纯化

新西兰大耳兔的免疫

动物选择：兔子采用新西兰白兔，体重2.5kg左右青壮年。动物选择毛色要光泽，活动自如的健康动物。挑选好动物，先预养2周左右，目的是淘汰有些不合格的动物，使后期的实验能顺利进行。

实验前准备：兔子做好标记。

抗原准备：(1)将抗原从-20度冰箱中拿出，常温溶解，避免反复冻融，并将注射器做好标记，写上项目号和动物号。(2)抽取抗原(抗原完全混匀)，首免抗原浓度为1mg/ml，兔子为0.5ml/只，二免-四免抗原浓度减半，剂量不变。(3)抽取佐剂，佐剂和抗原为1:1体积比抽取，首免采用完全佐剂，二-四免采用不完全佐剂，抽取时，佐剂要充分混合均匀后再抽入注射器。(4)二个注射器用针筒连接管对接后进行完全乳化，乳化标准为：乳化好的免疫原滴入37度水中不分散为合格。

免疫：兔子采用多点皮下注射，每点为0.2ml。免疫时间为首免后第14天进行二免，二免到三免间隔时间为7天，兔子三免后第7天耳中动脉采小样血清检测，检测合格，7天后加免，加免完7天后可采集全血。

血清的效价检测

包板：用包被缓冲液(coatingbuffer:na2co3和nahco3缓冲液)将已知抗原稀释至1μg/ml，在每个聚苯乙烯板的反应孔中加50μl，4℃过夜，次日，弃去孔内溶液，用1xtbst洗涤缓冲液以每孔180μl洗1次。

封闭：每孔加60μl的1％bsa(tbst配制)进行封闭，置37℃孵育1小时，之后弃封闭液。

加样：加一定稀释的待检样品(把待检样品按照一定的比例进行稀释)，50μl于上述已封闭的反应孔。同时设置好阳性对照孔(阳性血清)与阴性对照孔(bsa)，置37℃孵育1小时，之后弃封闭液，用1xtbst洗涤缓冲液以每孔180μl洗2次。

加酶标抗体：将新鲜稀释的二抗-hrp(1:5k，用1％bsa进行稀释)，以50μl/孔加入酶标板孔中，置37℃孵育45min，之后弃封闭液，用1xtbst洗涤缓冲液以每孔180μl洗3次。

加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的tmb底物溶液100μl，置37℃反应5min。

终止反应：于各反应孔中加入2m硫酸90μl。

读板：将酶标板置于预热过的酶标仪中(450nm)进行读数，保存数据，进行分析。

血清的检测结果：

多克隆抗体的分离纯化

a、亲和层析柱依次用20ml纯水和1×pbs(ph7.4)，流速70ml/h充分清洗。

b、取待纯化的血清10ml于50ml离心管中，用孔径0.45μm，直径25mm微孔滤膜抽滤，将抽滤过的血清样品以40ml/h流速上样，重复一次。

c、用20ml1×pbs(ph7.4)以70ml/h的流速清洗柱子，10min后连接蛋白检测仪，清洗过程中调节仪器透光率(t档)示数为100。

d、调节蛋白检测仪吸光率(1a档)示数为0，此时打开电脑桌面的hd-a电脑采集器，并将满屏量程调到5，用甘氨酸溶液(ph2.7，0.2m)以40ml/h的速度洗脱抗体，此时按下绿色的洗脱记录按钮开始洗脱，当仪器的示数开始升高时开始收集抗体。

e、在抗体收集过程中以1m的碳酸氢钠及时调节抗体的ph值至7左右，并记录洗脱峰的最高峰值。

f、抗体收集完后，调节ph值至7左右，并记录洗脱的抗体体积，之后用纯净水冲洗连接收集器的橡胶管。

g、依次用20ml1×pbs和纯水以70ml/h的速度清洗亲和层析柱，之后加入20％乙醇，封口，4℃冰箱保存。

实施例3多克隆抗体的功能验证及应用

采用实施例2中制备得到的多克隆抗体通过免疫荧光的方法标记斑马鱼成鱼精巢、卵巢以及黄河鲤精巢、鲫鱼精巢中的生殖干细胞，结果如图4-7所示，nanos2阳性信号(绿色)特异性高量表达在斑马鱼成鱼精巢(图4)、斑马鱼幼鱼卵巢(图5)以及黄河鲤精巢(图6)、鲫鱼精巢(图7)中的少部分细胞中。激光共聚焦显微镜下观察发现：nanos2阳性细胞的细胞核较大，核内染色质颜色较浅，细胞核中具有2-3个空洞(此为核仁结构)，符合生殖干细胞形态特征，由此推断nanos2能够特异性标记鱼类性腺中的生殖干细胞。

免疫荧光步骤如下：

在pbs中，解剖取出完整的斑马鱼新鲜精卵巢，用oct：h2o＝1:1的包埋剂快速洗一次(5秒)，再放入oct：h2o＝1:1的包埋剂中液氮速冻(速冻方法：在液氮中放入锡纸包裹的浮漂，包含组织和包埋剂的包埋盒放在浮漂上)。

切片前准备：将切片机室温度调至-20度，将包埋块在切片室内放置平衡15min。

切片：用oct将样品粘到样品座上，切片8-10微米。

在切片收集到粘附载玻片上后，用疏水笔标记将切片框住，干燥30分钟；室温下，用4％pfa-pbs固定切片15分钟；室温下，用pbst(0.1％triton)冲洗2次，每次1分钟。

用1％bsa-1％dmso-pbs(ph7.3)缓冲液中浸泡3次，每次10分钟，用1％bsa-1％dmso-0.1％tritonx100-pbs缓冲液洗涤样品浸泡样品3次，每次10分钟。

用1％bsa-1％dmso-0.1％tritonx100-pbs缓冲液1:200稀释抗体，于4℃孵育样品12个小时。

在1％bsa-1％dmso-0.1％tritonx100-pbs缓冲液中洗涤3次，每次10min。

用1％bsa-1％dmso-0.1％tritonx100-pbs缓冲液1:200稀释alexa568goatanti-rabbit(igg)二次抗体，在室温下孵育1小时。

用1％bsa-1％dmso-0.1％tritonx100-pbs缓冲液浸泡3次，每次5分钟。

使用50％甘油-pbs封片后再激光共聚焦显微镜下用40x物镜进行拍照。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。