一种抗BCMA的抗体及其应用的制作方法

本发明涉及一种抗bcma的抗体和包含该抗体的嵌合抗原受体，并公开了抗体的氨基酸序列、克隆或表达载体、宿主细胞、生产抗体的方法以及该抗体或嵌合抗原受体的用途。

背景技术：

多发性骨髓瘤(multiplemyeloma,mm)是以克隆性浆细胞大量增生为特征的恶性肿瘤。尽管多发性骨髓瘤的治疗方案近年来已经得到了很大的进步，但是多发性骨髓瘤仍然是一种高发病率和死亡率的疾病。因此，急需新的治疗方法对多发性骨髓瘤进行救治。

近年来，嵌合抗原受体t细胞(chimericantigenreceptor-tcell,car-t)免疫疗法在恶性血液肿瘤治疗中取得了较快的发展，是目前较为有效的恶性肿瘤治疗方式之一。嵌合抗原受体(chimericantigenreceptors,car)是一种融合蛋白，由单链抗体可变片段(single-chainfragmentvariable,scfv)、铰链区、跨膜结构域、胞内信号结构域(共刺激结构域及t细胞激活结构域)组成。car-t细胞的scfv一般来源于单克隆抗体，可以绕过主要组织相容性复合物(majorhistocompatibilitycomplex,mhc)限制来识别完整的细胞表面蛋白。

多发性骨髓瘤免疫治疗中的一种候选靶点是b细胞成熟抗原(bcellmaturationantigen,bcma)。bcma主要由浆细胞和一部分成熟b细胞表达，而在大部分b细胞以及其它组织中都不表达(b-cellmaturationantigenisapromisingtargetforadoptivet-celltherapyofmultiplemyeloma,clinicalcancerresearch,15apr2013.)。因此，bcma可以作为car-t细胞疗法治疗mm的靶抗原。目前国内外的临床试验证实car-t细胞疗法在多发性骨髓瘤治疗中已经取得了较好的治疗效果，但是目前用于临床试验的car-t细胞，大多为鼠源的单链抗体scfv，这可能会导致car-t细胞在体内产生抗car的免疫反应，导致car-t细胞在体内的扩增能力降低、car-t在体内难以持续及令人失望的临床疗效等(thenovelanti-cd19chimericantigenreceptorswithhumanizedscfv(single-chainvariablefragment)triggerleukemiacellkilling,cellularimmunology,14mar2016.；chimericantigenreceptort-celltherapiesformultiplemyeloma,blood,14dec2017.)。此外，scfv与靶抗原的亲和力强弱也是决定car-t是否能有效杀伤靶细胞的重要因素。因此，筛选出能特异有效识别bcma的scfv对构建安全有效治疗mm的car-t至关重要。

技术实现要素：

本发明公开了一种特异性结合bcma的分离的抗体，其包括：重链可变结构域(以下缩写为vh)和轻链可变结构域(以下缩写为vl)，其中

所述vh包括：包含seqidno:1(gytfx1x2ysmn)的氨基酸序列的vh-cdr1，包含seqidno:2(rintx3sgx4px5yaddfkg)的氨基酸序列的vh-cdr2和包含seqidno:3(sndyx6ysldx7)的氨基酸序列的vh-cdr3；其中x1选自s、t、r；x2选自r、s、h；x3选自g、e、r；x4选自a、t、v；x5选自i、n；x6选自n、l；x7选自h、y、f；

所述vl包括：包含seqidno:4(rasx8svx9x10x11gx12x13x14x15y)的氨基酸序列的vl-cdr1，包含seqidno:5(lasnvqt)的氨基酸序列的vl-cdr2和包含seqidno:6(x16qsrx17iprt)的氨基酸序列的vl-cdr3；其中x8选自r、e；x9选自t、s；x10选自i、v；x11选自a、l；x12选自s、n；x13选自p、h；x14选自i、l；x15选自i、v；x16选自l、f；x17选自t、s。

在一个具体实施方案中，所述抗体包括重链可变结构域vh和轻链可变结构域vl，所述重链可变结构域包括：如seqidno:1的氨基酸序列所示的vh-cdr1、如seqidno:2的氨基酸序列所示的vh-cdr2和如seqidno:3所示的氨基酸序列vh-cdr3；

所述轻链可变结构域包括：如seqidno:4的氨基酸序列所示的vl-cdr1，如seqidno:5的氨基酸序列所示的vl-cdr2和如seqidno:6的氨基酸序列所示的vl-cdr3。

本发明公开了一种特异性结合bcma的分离的抗体，其包括vh和vl，所述vh包括vh-cdr1、vh-cdr2和vh-cdr3，所述vl包括vl-cdr1、vl-cdr2和vl-cdr3；其中，所述vh-cdr1包含选自由seqidno:7、8和9组成的组中的氨基酸序列；所述vh-cdr2包含选自由seqidno:10、11、12和13组成的组中的氨基酸序列；所述vh-cdr3包含选自由seqidno:14、15和16组成的组中的氨基酸序列；所述vl-cdr1包含选自由seqidno:17、18和19组成的组中的氨基酸序列；所述vl-cdr2包含选自seqidno:20；所述vl-cdr3包含选自seqidno:21或seqidno:22的氨基酸序列。

在一个具体实施方案中，所述vh-cdr1选自由seqidno:7、8和9组成的组中的氨基酸序列；所述vh-cdr2选自由seqidno:10、11、12和13组成的组中的氨基酸序列；所述vh-cdr3选自由seqidno:14、15和16组成的组中的氨基酸序列；所述vl-cdr1选自由seqidno:17、18和19组成的组中的氨基酸序列；所述vl-cdr2选自seqidno:20的氨基酸序列；所述vl-cdr3包含seqidno:21或seqidno:22的氨基酸序列。

在一个具体实施方案中，一种特异性结合bcma的分离的抗体包括：

1)包含如seqidno:7所示的vh-cdr1、如seqidno:10所示的vh-cdr2和如seqidno:14所示的vh-cdr3的重链可变结构域；和包含如seqidno:17所示的vl-cdr1、如seqidno:20所示的vl-cdr2和如seqidno:21所示的vl-cdr3的轻链可变结构域；

2)包含如seqidno:8所示的vh-cdr1、如seqidno:11所示的vh-cdr2和如seqidno:15所示的vh-cdr3的重链可变结构域；和包含如seqidno:18所示的vl-cdr1、如seqidno:20所示的vl-cdr2和如seqidno:21所示的vl-cdr3的轻链可变结构域；

3)包含如seqidno:8所示的vh-cdr1、如seqidno:12所示的vh-cdr2和如seqidno:14所示的vh-cdr3的重链可变结构域；和包含如seqidno:17所示的vl-cdr1、如seqidno:20所示的vl-cdr2和如seqidno:21所示的vl-cdr3的轻链可变结构域；

4)包含如seqidno:7所示的vh-cdr1、如seqidno:10所示的vh-cdr2和如seqidno:14所示的vh-cdr3的重链可变结构域；和包含如seqidno:17所示的vl-cdr1、如seqidno:20所示的vl-cdr2和如seqidno:22所示的vl-cdr3的轻链可变结构域；或

5)包含如seqidno:9所示的vh-cdr1、如seqidno:13所示的vh-cdr2和如seqidno:16所示的vh-cdr3的重链可变结构域；和包含如seqidno:19所示的vl-cdr1、如seqidno:20所示的vl-cdr2和如seqidno:21所示的vl-cdr3的轻链可变结构域。

在一个具体实施方案中，上述抗体中的所述重链可变结构域包含选自由seqidno:23、24、25、26、27、28、29、30、31和32组成的组中的氨基酸序列，或包含与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列。

在一个具体实施方案中，上述抗体中的所述轻链可变结构域包含选自由seqidno:33、34、35、36、37、38、39、40、41、42和43组成的组中的氨基酸序列，或包含与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列。

在一个具体实施方案中，本发明提供了一种特异性结合bcma的抗体，包括：

1)包含如seqidno:23所示的重链可变结构域和包含如seqidno:33所示的轻链可变结构域；

2)包含如seqidno:24所示的重链可变结构域和如包含seqidno:33所示的轻链可变结构域；

3)包含如seqidno:24所示的重链可变结构域和如包含seqidno:34所示的轻链可变结构域；

4)包含如seqidno:25所示的重链可变结构域和如包含seqidno:35所示的轻链可变结构域；

5)包含如seqidno:26所示的重链可变结构域和如包含seqidno:36所示的轻链可变结构域；

6)包含如seqidno:27所示的重链可变结构域和如包含seqidno:37所示的轻链可变结构域；

7)包含如seqidno:28所示的重链可变结构域和如包含seqidno:38所示的轻链可变结构域；

8)包含如seqidno:29所示的重链可变结构域和如包含seqidno:33所示的轻链可变结构域；

9)包含如seqidno:30所示的重链可变结构域和如包含seqidno:39所示的轻链可变结构域；

10)包含如seqidno:31所示的重链可变结构域和如包含seqidno:40所示的轻链可变结构域；

11)包含如seqidno:32所示的重链可变结构域和如包含seqidno:41所示的轻链可变结构域；

12)包含如seqidno:28所示的重链可变结构域和如包含seqidno:42所示的轻链可变结构域；或

13)包含如seqidno:29所示的重链可变结构域和如包含seqidno:43所示的轻链可变结构域.

在一个具体实施方案中，本发明提供了一种特异性结合bcma的抗体包括：

包含选自由seqidno:44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55和56组成的组中的氨基酸序列，或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列。

在一个具体实施方案中，本发明所述抗体为单链抗体scfv；其重链可变结构域和轻链可变结构域由富含甘氨酸和丝氨酸的接头肽链相连，重链可变结构域和轻链可变结构域的顺序可互换。

在一个具体实施方案中，本发明所述抗体为嵌合的或人源化抗体。

另一方面，本发明进一步公开了一种靶向bcma的嵌合抗原受体，其包含：(1)本发明所述的scfv；2)铰链区；3)跨膜区；4)共刺激结构域；5)cd3ζ胞内信号转导结构域。其中所述共刺激结构域选自cd27、cd28、4-1bb、ox-40、cd30、cd40、pd-1、icos、lfa-1、cd-2、cd7、light、nkg2c、b7-h3或其任意组合；所述共刺激结构域选自4-1bb，所述4-1bb包含如seqidno.57所述的氨基酸序列；所述cd3ζ胞内信号转导结构域包含如seqidno.58所述的氨基酸序列。

在一个具体实施方案中，所述铰链区和和跨膜结构域选自igg1、igg4、cd8α、cd28、il-2受体、il-7受体、il-11受体、pd-1或cd34的铰链区和跨膜结构域。

所述示例性抗体的序列如表1和序列表所示。

表1示例性抗bcmascfv的可变区序列

所述示例性抗体的cdr序列如表2和序列表所示。

表2示例性抗体的cdr序列

又一方面，本发明公开了一种分离的核酸分子，其中其编码如前所述的抗体或嵌合抗原受体氨基酸序列的核苷酸序列。

本发明公开了一种克隆或表达载体，其含有如前所述的核酸分子。其中所述载体选自dna、rna、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体和逆转录病毒载体中的一种或多种。

本发明公开了一种宿主细胞，包括如前所述的核酸分子或如前所述的载体。其中所述宿主细胞为t淋巴细胞、b淋巴细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞、细胞毒性t细胞、肿瘤浸润t细胞或调节性t细胞。

本发明公开了一种组合物或试剂盒，其包含如前所述的抗体、如前所述的嵌合抗原受体、如前所述的核酸分子、如前所述的载体、如前所述的宿主细胞中的至少一种，以及一种以上药学可接受的赋形剂、稀释剂或载体。

又一方面，本发明公开了如前所述的抗体、如前所述的嵌合抗原受体、如前所述的核酸分子、如前所述的载体、如前所述的宿主细胞、或如前所述的组合物在制备预防或治疗用于治疗b细胞相关肿瘤疾病、自身免疫疾病、病毒或细菌引起的感染性疾病的药物中的用途。

在一个实施方案中，所述b细胞相关肿瘤疾病选自：急性白血病诸如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞性、前髓细胞性、粒-单核细胞型、单核细胞性和红白血病；慢性白血病诸如慢性髓细胞(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病；真性红细胞增多症、淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、扩散大b-细胞淋巴瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链病、骨髓增生异常综合征、多毛细胞白血病和脊髓发育不良中的至少一种。

附图说明

图1示出car分子模式图。

图2示出质粒载体模式图，制备慢病毒所使用的质粒为plenti质粒，目的基因上游启动子为ef-1α，启动子下游依次为信号肽、linker区及car结构序列。

图3示出带有特异识别bcma的scfv的car的慢病毒在t细胞中的转导效率。

图4示出ncih929细胞和k562细胞表面bcma表达的流式检测图。

图5示出含有scfv-01的car-t(01-car-t)对靶细胞的杀伤效果图，其中01-car-t表示含有scfv-01的car-t细胞，c-car-t为阳性对照，t细胞处理组为阴性对照。

图6示出含有scfv-04的car-t(04-car-t)对靶细胞的杀伤效果图。

图7示出含有scfv-05的car-t(05-car-t)对靶细胞的杀伤效果图。

图8示出含有scfv-06的car-t(06-car-t)对靶细胞的杀伤效果图。

图9示出含有scfv-07的car-t(07-car-t)对靶细胞的杀伤效果图。

图10示出含有scfv-08的car-t(08-car-t)对靶细胞的杀伤效果图。

图11示出含有scfv-09的car-t(09-car-t)对靶细胞的杀伤效果图。

图12示出含有scfv-10的car-t(10-car-t)对靶细胞的杀伤效果图。

图13示出含有scfv-11的car-t(11-car-t)对靶细胞的杀伤效果图。

图14示出含有scfv-12的car-t(12-car-t)对靶细胞的杀伤效果图。

图15示出含有scfv-13的car-t(12-car-t)对靶细胞的杀伤效果图。

图16示出含有scfv-14的car-t(13-car-t)对靶细胞的杀伤效果图。

图17示出含有scfv-15的car-t(14-car-t)对靶细胞的杀伤效果图。

图18示出本发明中的car-t对靶细胞的杀伤效果的归一化图。

图19示出含有scfv-01的car-t(01-car-t)在靶细胞刺激下的细胞因子表达图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式及实验数据对本发明作进一步的说明。除非另有限定，本文中所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解相同的含义。

本文所用的术语“抗原”是指引起免疫应答的分子，该免疫应答可涉及抗体产生，或特异性免疫活性细胞的活化。本领域技术人员均可理解任何大分子包括所有的蛋白质或肽，可用作抗原。抗原可源自重组或基因组dna。本领域技术人员均可理解任何dna其包括编码引起免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列，编码如本文使用的术语“抗原”。此外，本领域技术人员均可理解抗原不必单独地由基因的全长核苷酸序列编码。容易显而易见的是本公开包括但不限于，多于一个的基因的部分核苷酸序列的用途，并且这些核苷酸序列以不同的组合进行布置，以引起期望的免疫应答。此外，领域技术人员均可理解抗原根本不必由“基因”进行编码，抗原可被产生、合成或可源自生物学样本。这种生物学样本可包括但不限于组织样本、肿瘤样本、细胞或生物学流体。

如本文所用的，术语“抗体”指的是与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子。抗体可为源于天然来源或源于重组来源的完整的免疫球蛋白，并可为完整免疫球蛋白的免疫反应部分。抗体通常为免疫球蛋白分子的四聚物。本发明中的抗体可以以多种形式存在，包括多克隆、单克隆、单特异性的、多特异性的、非特异性的、人源化的、单链的、嵌合的、合成的、重组的、杂合的、突变的、以及嫁接的抗体；本发明中的抗体形式还包括全长抗体、抗体片段，例如fab、fab’、f(ab’)2、fv、scfv、di-scfv、tri-scfv、fd和其它保留抗原结合功能的抗体片段；还可以是二聚体结构diabody或三聚体结构triabody。通常情况下，所述片段应当包括抗原结合片段，抗原结合片段通常包括抗体轻链可变区(vl)和抗体重链可变区(vh)，然而，它不一定必须包括两者。例如，所谓的fd抗体片段仅由vh和ch1结构域组成，但仍保留了完整抗体的一些抗原结合功能。术语“抗体”作为免疫球蛋白或其片段或它们的衍生物，其包括包含抗原结合位点的任何多肽，而不论其是否是在体外或体内产生的。vh或vl区可以进一步细分成：称为互补决定区(cdr)的高变区，以及穿插分布的称为框架区(fwr)的更保守区域。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。重链中的cdr缩写为vh-cdr，例如vh-cdr1、vh-cdr2、vh-cdr3，轻链中的cdr缩写为vl-cdr，例如vl-cdr1、vl-cdr2、vl-cdr3。本发明公开的抗体和抗原结合片段的cdr由kabat编号所定义或识别。

本文使用的术语“单链可变区片段”、“单链抗体”或“scfv”是指通过重组dna技术形成的抗体，其中免疫球蛋白重链可变区和轻链可变区通过氨基酸肽段(linker)连接而成。生成单链抗体的多种方法是已知的，包括在美国专利号4,694,778；bird(1988)science242:423-442；huston等(1988)proc.natl.acad.sci.usa85:5879-5883；ward等(1989)nature334:54454；skerra等(1988)science242:1038-1041中描述的那些。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。重链中的cdr缩写为vh-cdr，例如vh-cdr1、vh-cdr2、vh-cdr3，轻链中的cdr缩写为vl-cdr，例如vl-cdr1、vl-cdr2、vl-cdr3。本发明公开的抗体和抗原结合片段的cdr由kabat编号所定义或识别。

本公开所用术语“嵌合的”是指一部分重链来源于一个物种而重链其他部分来源于其他物种的抗体或抗体多肽。在说明性示例中，嵌合抗体可包含源于人类的恒定区域和来自诸如驼科的非人动物的可变区域。在某些实施方案中，非人动物是一种哺乳动物，例如驼科、小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、豚鼠或仓鼠。

本公开所用术语“人源化的”是指抗体或抗体多肽包括来源于非人动物的cdrs、来源于人类的fwr区以及在适用的情况下来源于人类的恒定区。

本公开所用“bcma”可来源于人类，人bcma的示例性序列包括人bcma蛋白(genbankaccessionno.:bab60895.1)。

本发明所用术语“bcma”旨在包含任何形式的bcma，例如，1)天然未经处理的bcma分子、“全长”bcma链或天然产生的bcma变体，包括，例如，剪接变体或等位基因变体；2)细胞内处理后产生的任何形式的bcma；或3)通过重组方法产生的bcma亚单位的全长、片段(例如，截短形式，细胞外/跨膜结构域)或其修饰形式(如突变形式、糖基化/聚乙二醇化、his-tag/免疫荧光融合形式)。

本发明所用术语“靶向bcma”是指能够特异性结合bcma(如人bcma)，例如靶向bcma的嵌合抗原受体是指能够特异性结合bcma的嵌合抗原受体；例如靶向bcma的scfv是指能够特异性结合bcma(如人bcma)的单链抗体。

本公开所用术语“特异性结合”或“特异性地结合”是指两个分子之间的非随机结合反应，例如抗体和抗原之间的结合反应。在某些实施方案中，本公开提供的抗体多肽特异性结合人bcma，其结合亲和力(kd)≤10^-6m(例如，≤5x10^-7m、≤2x10^-7m、≤10^-7m、≤5x10^-8m、≤2x10^-8m、≤10^-8m、≤5x10^-9m、≤4x10^-9m、≤3x10^-9m、≤2x10^-9m或≤10^-9m)。本公开所用kd指解离率与结合率之比(koff/kon)，其可通过使用本领域已知的任何常规方法来测定，包括但不限于表面等离子体共振方法、微尺度热泳法、高效液相色谱-质谱法和流式细胞术(如facs)法。在某些实施方案中，可以用流式细胞仪适当测定kd值。

本文所用的术语“载体”是指运输、转导和在靶细胞表达被包含的外源目的基因(例如本发明所述的多核苷酸)的分子工具，所述工具提供合适的在靶细胞中起始转录的核苷酸序列，即启动子。载体其包括分离的核酸，并且其可以用于递送分离的核酸至细胞内部。众多载体在本领域是已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲性化合物相关联的多核苷酸、质粒和病毒。因而，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语也应当解释为包括便于将核酸转移入细胞的非质粒和非病毒化合物，例如，聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括但不限于仙台病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等。

本文使用的“表达载体”是指包括重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包括可操作地连接至待表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包括足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其它元件可以由宿主细胞供应或在体外表达系统中供应。表达载体包括所有本领域已知的并入重组多核苷酸的那些，比如质粒(例如，裸露或包含在脂质体中)和病毒(例如，仙台病毒、慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。

本文使用的“克隆载体”是指在宿主细胞中具有自主复制能力的dna分子例如质粒、粘粒或噬菌体。克隆载体通常含有一个或少量限制内切核酸酶识别位点以及标记基因，其中在所述限制内切核酸酶识别位点将外源dna序列以确定的方式插入而不会丧失载体的必需生物学功能，所述标记基因适合用于对用克隆载体转化的细胞的鉴定和选择。标记基因通常包括提供四环素抗性或氨苄青霉素抗性的基因。

宿主细胞可以是含有克隆载体或表达载体的任何原核细胞或真核细胞，包括已经进行基因工程改造以在宿主细胞的染色体或基因组中含有克隆化基因的那些原核细胞或真核细胞。合适的哺乳动物宿主细胞包括骨髓瘤细胞，例如sp2/0细胞和ns0细胞以及中国仓鼠卵巢(cho)细胞、杂交瘤细胞系及其它可用于表达抗体的哺乳动物宿主细胞。具有经修饰的免疫系统的特殊转基因动物也可用于制备抗体。

本文使用的“同一性”是指在两种核酸分子或多肽之间的序列一致性。可以通过比较为比较目的而对齐的每个序列中位置来确定同一性。当比较的序列中的位置被相同碱基占据时，那么在该位置处分子是相同的。在核酸或氨基酸序列之间相似性或同一性的程度是在由核酸序列共享的位置处相同或匹配核苷酸的数目的函数。可使用各种比对算法和/或程序来计算两个序列之间的同一性，包括可获得为gcg序列分析包(universityofwisconsin，madison，wis.)的一部分，并且可以以例如默认设置使用的fasta或blast。例如，本领域技术人员可以预期与在本文中描述的特定多肽具有至少70％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性并且优选展现出基本上相同的功能的多肽，以及编码上述多肽的多核苷酸。

本文使用的“分离的”是指从自然状态改变或移出。例如，天然存在于活动物中的核酸或肽不是“分离的”，但是部分或完全与它的自然状态的共存物质分开的相同的核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以以基本上纯化的形式存在，或可以存在于非自然环境，比如，宿主细胞中。

除非另外规定，本文使用的“编码”某蛋白的核酸分子或某蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列包括彼此的简并形式(degeneracy)并且编码相同的氨基酸序列的所有的核苷酸序列。该核苷酸序列还可以包括一个或多个内含子。

本文使用的术语“变体”意指通过在母体分子的氨基酸序列中替代至少一个残基或者在n端或c端添加至少一个氨基酸残基所获得的多肽变体。

如本文所用，术语“受试者”包括任何人或非人动物。术语“非人类动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、大鼠、小鼠、两栖动物、爬行动物等。除非另有说明，否则术语“患者”或“受试者”可互换使用。在本发明中，优选的受试者是人类。

如本文所用，术语“治疗”是指向受试者施用有效量的具有根据本文所述的方法离体改变的靶基因的多核苷酸序列的细胞，以使得所述受试者具有所述疾病的至少一种症状的减少或所述疾病的改善，例如，有益的或所需的临床结果。出于本公开的目的，有益的或所需的临床结果包括但不限于一种或多种症状的减轻、疾病程度的减小、疾病状态的稳定(即不恶化)、疾病进展的延迟或减慢、疾病状态的改善或缓和，以及缓解(无论是部分缓解还是全部缓解)，无论是可检测的或是不可检测的。治疗可指与未接受治疗情况下的预期存活期相比，延长存活期。因此，本领域的技术人员意识到治疗可改善疾病状况，但可能不是疾病的完全治愈。如本文所用，术语“治疗”包括预防。或者，治疗在疾病的进展减少或停止的情况下是“有效的”。“治疗”还可意指与在未接受治疗情况下的预期存活期相比，延长存活期。需要治疗的病人包括已经被诊断具有与多核苷酸序列的表达相关的病症，以及由于遗传易感性或其他因素可能发展这种病症。

如本文所用的术语“自身免疫疾病”被定义为由自身免疫应答产生的紊乱。自体免疫疾病是对自身抗原的不适当和过度应答的结果。自身免疫疾病的例子包括但不限于阿狄森氏疾病、斑秃、强直性脊柱炎、自身免疫肝炎、自身免疫腮腺炎、克罗恩氏疾病、糖尿病(1型)、营养不良性大疱性表皮松解症、附睾炎、肾小球性肾炎、格雷夫斯氏疾病、吉兰-巴雷综合征、桥本氏疾病、溶血性贫血、系统性红斑狼疮、多发性硬化症、重症肌无力、寻常型天疱疮、牛皮癣、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、斯耶格伦氏综合征、脊椎关节病变、甲状腺炎、血管炎、白癜风、粘液性水肿、恶性贫血、溃疡性结肠炎等等。

在本文中陈述数值极限或范围的情况下，包括端点。此外，具体包括在数值极限或范围内的所有值和子范围。

实施例

实施例1.scfv基因合成

在本发明的具体实施方案中，编码如表2所示的scfv的核酸可以通过基因工程的方法进行合成。本发明的编码scfv的核酸片段在北京博迈德基因技术有限公司合成。scfv片段包含重链可变区(vh)、轻链可变区(vl)及接头区，接头区在vh和vl之间将两个结构域连接在一起形成一个特异性识别bcma的抗原结合位点。单链抗体一般是由一条核苷酸链编码的一条氨基酸链序列，所述scfv可通过本领域已知的氨基酸缺失、插入、取代、增加及其它修饰方式进行进一步修饰。此外，根据某种氨基酸序列在其核酸序列中引入上述修饰方法也是本领域技术人员已知的，所以，对scfv进行修饰优选在核酸水平上进行。

实施例2.car分子的构建和慢病毒包装

如图1所示，实施例1中的单链抗体scfv和铰链区、跨膜结构域、cd28或4-1bb共刺激结构域及cd3ζ结构域共同形成car结构。其中铰链区和跨膜区选自cd8α。

1)靶向bcma的scfv基因通过基因合成的方法合成(北京博迈德基因技术有限公司)。2)以已有的car质粒为模板，利用pcr克隆出car分子中含有cd8α铰链区、cd8α跨膜区、4-1bb(对应于np_001552.2)的胞内区、以及cd3ζ(对应于np_000725.1)胞内区的核酸片段。3)以步骤1)获得的基因和步骤2)获得的核酸片段为模板，通过pcr克隆出靶向bcmacar的完整核酸片段。4)通过限制性酶切和连接的方法，将步骤3)获得的完整核酸片段插入慢病毒载体plenti6.3/v5(thermofisher，waltham，ma，usa)，获得载带靶向bcmacar基因的慢病毒转移质粒(图2)。5)将慢病毒包装质粒plp/vsvg,plp1/mdk,plp2/rsk(thermofisher，waltham，ma，usa)与步骤4)获得的转移质粒，用lipofectamine3000(thermofisher，waltham，ma，usa)转染至hek293t细胞，48小时后收集培养基，300g离心去除细胞碎片后，用超速离心机25000rpm离心3小时。将沉淀用1ml生理盐水溶解，即为所需的慢病毒载体。

实施例3.car-t细胞制备

使用cd3/cd28dynabeads(thermofisher)从健康志愿者的外周血单个核细胞(妙通(上海)生物科技有限公司，中国)中分离t细胞。将分离纯化后的t细胞(此时的t细胞与cd3/cd28dynabeads连在一起)以1.0×10⁶个细胞/ml接种培养至x-vivo15培养基(lonza，switzerland)中，并加入il-2(山东金泰生物工程有限公司，中国)(500iu/ml)培养48小时后，用上述慢病毒载体感染t细胞。病毒感染细胞24小时后，细胞离心换液，并加入含il-2(500iu/ml)的新鲜x-vivo15继续培养。细胞培养8天后，收集培养体系中的所有细胞，并用磁力架去除培养体系中的dynabeads，t细胞离心并计数。

实施例4.慢病毒转导效率检测

从制备好的car-t细胞中取1.0×10⁶个细胞，用200μldpbs重悬细胞，1000g离心后去上清。将细胞沉淀用100μldpbs重悬，加入3μl抗体，室温孵育20分钟，用200μldpbs重悬细胞，1000g离心后去上清。再用100μldpbs重悬细胞，用流式细胞仪(novocyte2060r，aceabiosciences，sandiego，ca，usa)检测各组细胞中car含量。如图3显示，在慢病毒感染moi＝0.5时，各car基因的转导效率均在35-65％之间。

实施例5.靶细胞表面bcma表达的检测

本实施例以检测人骨髓瘤细胞系ncih929和人白血病细胞系k562表面bcma的表达为例。

ncih929和k562细胞均购自atcc。将ncih929细胞和k562细胞培养至旺盛增殖期，各取1.0×10⁶个细胞，分别用200μldpbs重悬细胞，1000g离心后去上清。将细胞沉淀用100μldpbs重悬，加入5μl荧光标记的bcma抗体(miltenyibiotec，usa)，室温孵育20分钟，用200μldpbs重悬细胞，1000g离心后去上清。再用100μldpbs重悬细胞，用流式细胞仪(novocyte2060r，aceabiosciences，sandiego，ca，usa)检测两种细胞中bcma表达的比例。如图4显示，ncih929细胞表面的bcma表达水平高，而k562细胞几乎不表达bcma。

实施例6.bcmacar-t杀伤靶细胞的效率

本实施例以检测包含特异识别bcma的scfv、cd8α铰链区、cd8α跨膜结构域、4-1bb共刺激结构域及cd3ζ结构域的car-t对表达bcma阳性的靶细胞的杀伤效率为例。

利用1ml生理盐水重悬2×10⁶ncih929靶细胞(atcc)或bcma表达阴性的k562细胞，加入5μlcalcein-am(浓度1μg/μl，thermofisher，usa)，轻轻混匀，然后放入37℃水浴中孵育5min，以标记靶细胞，使用10ml生理盐水洗涤两次，去除多余染料，细胞用1ml生理盐水重悬计数。向48孔细胞培养板(corningincorporated，corning，ny，usa)每孔中加入1×10⁵个上述标记的ncih929或k562细胞，按e:t＝5:1加入各种car-t细胞，置于37℃、5％co2细胞培养箱中孵育6h，取培养上清进行检测。用荧光酶标仪(varioscanlux，thermofisher)检测细胞上清的荧光值(激发波长:495nm，发射波长:515nm)。

图5至图17显示，具有靶向bcma的scfv、共刺激信号域和cd3ξ信号域设计的car-t均能通过识别bcma靶蛋白有效杀伤ncih929细胞，且比蓝鸟生物的靶向bcma的car-t(c-car-t，序列参考专利wo2016/014789a2中的seqno.15)对ncih929细胞的杀伤效率更高，但无法有效杀伤bcma表达阴性的k562细胞，说明这些car-t能通过scfv特异识别bcma，并激活car-t，引起car-t杀伤肿瘤细胞。

图18显示，与c-car-t相比，大部分car-t细胞(02/03/05-car-t除外)对ncih929细胞的杀伤效率更高，说明这些car-t细胞对肿瘤细胞有更强的反应性。

实施例7.bcmacar-t在靶细胞刺激下的细胞因子表达

本实施例以检测包含特异识别bcma的scfv-01、cd8α铰链区、cd8α跨膜结构域、4-1bb共刺激结构域及cd3ζ结构域的car-t在bcma阳性靶细胞(ncih929)和bcma阴性细胞(k562)刺激后细胞因子干扰素γ(ifn-γ)的表达为例。

将t细胞和car-t细胞分别与ncih929细胞或k562细胞于37℃、5％co2培养箱中共同孵育6小时(效应细胞与靶细胞的比例分别为10:1、5:1、1:1)，收集上清液，利用cba人th1/th2/th17细胞因子试剂盒(bdbiosciences)检测细胞因子表达。

图19显示，与t细胞相比，bcmacar-t细胞与bcma阳性靶细胞(ncih929)共同孵育后，ifn-γ诱导效应显著增强，同时，随着效应细胞与ncih929细胞比例的增大，细胞因子释放效应随之增强。但是，bcmacar-t细胞与bcma阴性细胞k562共同孵育后，ifn-γ诱导效应与t细胞组相比无显著差异。以上实验结果表明，本发明的car-t细胞可以特异性地识别bcma靶抗原并诱导其产生细胞毒性相关的细胞因子表达。

序列表

<110>北京艺妙神州医药科技有限公司

北京艺妙医疗科技有限公司

<120>一种抗bcma的抗体及其应用

<130>aj7552pi2002-div3

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