一株新型多头菌及其在防治植物病原真菌中的应用

本发明属于农业
技术领域：
，具体涉及一株多头菌(polyceephalomycessp.)njc01及其在防治植物病原真菌中的应用。
背景技术：
：大豆(soybean)是豆科大豆属植物，具有很高的食用价值，被称为“豆中之王”、“田中之肉”、“绿色的牛乳”等，是数百种天然食物中最受营养学家推崇的食物。大豆可以加工豆腐、豆浆、腐竹等豆制品，还可以提炼大豆异黄酮；豆粉则是可代替肉类的高蛋白食物；发酵豆制品如腐乳、臭豆腐、豆瓣酱、酱油、豆豉、纳豆等与我们的生活息息相关。此外，大豆还具有极高的商用价值，如被加工为汽车喷漆；大豆油与酒精混合用于制造人造橡胶、液体燃料、瓷釉、印刷油墨、聚氯乙烯、树脂等。植物的真菌病害是病害中种类最多的病害，约占70％-80％，可以出现在植物的各个部位，能导致植物局部坏死、腐烂，整株萎蔫甚至死亡。真菌还能入侵作物的果实、种子，导致作物减产甚至绝收，给农民造成极大的损失。短孢炭疽菌(colletotrichumbrevisporum)是引起大豆炭疽病的病原真菌，可以侵染大豆，危害植物的茎、叶、花、果荚以及根等，病部表面产生不规则褐色坏死病灶，严重的可使全株植物枯死、腐烂。目前市场上多使用化学药剂多菌灵来控制病原菌的生长，但化学药剂的过量使用不仅导致病原菌抗药性增加，对土壤和水体造成污染，还对人类等哺乳动物有毒害作用。被污染的水体通过食物链，在人体内累积，能引起肝病和染色体畸变。因此，寻找能够拮抗植物病原真菌的生防菌，通过生物防治方法防治植物真菌病害具有重要意义。技术实现要素：本发明的目的在于，提供一株新型多头菌(polyceephalomycessp.)njc01，其对植物病原真菌具有特定的抑制作用。所述多头菌(polyceephalomycessp.)njc01，保藏编号为cctccm2021380，保藏日期为2021年4月15日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(cctcc)，地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山。该多头菌(polyceephalomycessp.)njc01，对植物病原真菌具有抑制作用，所述植物病原真菌为短孢炭疽菌(colletotrichumbrevisporum)、菌核菌(sclerotiniasclerotiorum)、禾谷镰刀菌(fusariumgraminearum)、甘薯黑斑病菌(ceratocystisfimbriata)或梨树腐烂病菌(valsapyri)。本发明还提供了一种抑制短孢炭疽菌生长的制剂，该制剂的活性成分为多头菌(polyceephalomycessp.)njc01，所述菌株的孢子、所述菌株的培养物及其浓缩物、萃取物、干燥物组成的组中的一种以上有效成分。在从有炭疽病症状的大豆植株中分离短孢炭疽菌时，发明人发现了对短孢炭疽菌生长有拮抗作用的菌株，对其进行进一步纯化、鉴定后发现其属于多头菌属，并将其命名为njc01，并进一步对其对引起大豆炭疽病的短孢炭疽菌的抑制作用进行了研究。本发明以水为阴性对照，以10mg/ml市面上使用的杀菌剂多菌灵为阳性对照，采用106、107、108cell/ml多头菌njc01的孢子悬浮液浸泡毛豆30min后，向毛豆豆荚(试验组)表面接种短孢炭疽菌菌饼，24h后观测炭疽病的发病情况，发现阴性对照组中短孢炭疽病菌生长较严重，豆荚受侵害程度最大；多菌灵对照组中短孢炭疽菌病害仍有发生；而经多头菌njc01孢子溶液预浸泡处理后的豆荚上，短孢炭疽菌的病斑得到抑制，且随着多头菌njc01孢子浓度的升高，预防效果逐渐提高。与现有技术相比，本发明的多头菌(polyceephalomycessp.)njc01可抑制短孢炭疽菌生长，用于制备预防大豆炭疽病的制剂。本发明无需复杂分子操作，制剂中主要活性物质为多头菌njc01，且对植物没有危害。附图说明图1为实施例1，其中图a为多头菌njc01在pda固体培养基中生长的菌落形态，图b为njc01在普通光学显微镜下的菌丝及孢子形态，图c为多头菌njc01菌株5.8srrna序列，图d为多头菌njc01菌株的进化树。图2为实施例2，其中图a为多头菌njc01对短孢炭疽菌、菌核菌、禾谷镰刀菌、甘薯黑斑病菌、梨树腐烂病菌的拮抗活性图，图b为病原菌近多头菌njc01端的直径统计图。图3为实施例3中使用伊文思蓝染液和中性红染液对多头菌njc01与短孢炭疽菌共培养的短孢炭疽菌菌丝活性染色图。图4为实施例4中多头菌njc01对短孢炭疽菌的空间竞争sem镜检图。图5为实施例5，其中图a为多头菌njc01与短孢炭疽菌的葡萄糖竞争消耗关系图，图b为在不同条件下短孢炭疽菌孢子的萌发率图。图6为实施例6中多头菌njc01孢子对毛豆豆荚炭疽病的预防效果图。具体实施方式本发明公开了一种新型多头菌(polyceephalomycessp.)njc01及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。下面结合实施例，进一步阐述本发明。实施例1菌株的分离和鉴定(1)菌株的分离：将多个含有炭疽病组织浸泡在1.5％naocl4中1min进行表面消毒，用镊子将其捞出，并用无菌ddh2o洗涤，将组织块接种在含有氯霉素的马铃薯葡萄糖琼脂(pda)上，于28℃培养3天，用接种环挑取菌丝接种于新的培养基中，进行菌落纯化，纯化的菌落形态如图1(a)所示，在显微镜下观察其孢子及菌丝形态，结果如图1(b)所示。pda固体培养基配方如表1所示，按配方备料，煮沸约30min，待各组分溶解后采用湿热灭菌法于121℃灭菌15min。表1pda固体培养基配方(1l)试剂质量马铃薯200g葡萄糖20g琼脂粉15g(2)菌株的鉴定：菌饼制备：将斜面保存的抗菌菌株接种于pda固体培养基中，于28℃恒温箱避光培养3天，用直径7mm的打孔器于菌落边缘切取，制备成菌饼备用。菌株dna的提取：接种3个菌饼于50ml液体pda培养基中，培养2-3天，将培养液转移至离心管，于4℃，10000rpm，离心10min，收集菌丝，并用适量无菌水洗涤3次。将菌丝转移至预冷的研钵中，加液氮研磨至粉末状固体，融化后为蛋清状液体，按照真菌dna提取试剂盒进行dna提取，对提取的基因组进行电泳验证。用通用引物its4/its5对基因组进行pcr体外扩增，并用琼脂糖凝胶电泳进行验证。对pcr片段进行胶回收，并送公司测序，测序结果如图1(c)所示。pda液体培养基配方如表2所示，按配方备料，煮沸约30min，待各组分溶解后采用湿热灭菌法于121℃灭菌15min。表2pda液体培养基配方(1l)试剂质量马铃薯200g葡萄糖20g进行基因序列分析时，利用国家生物技术信息中心(ncbi)的基本本地队列搜索工具(blast)与genbank数据库中dna序列进行比对。在maga7软件中进行构树，结果如图1(d)所示，发现其与多头菌属菌有100％的同源性，将该菌株命名为多头菌(polyceephalomycessp.)njc01。实施例2多头菌njc01对几种植物病原真菌的拮抗活性检测多头菌njc01菌饼、短孢炭疽菌菌饼与其他病原真菌菌饼制备方法同实施例1。制备含有50μg/ml氯霉素的pda固体培养基，将多头菌njc01菌饼接种在培养皿直径1/3位置处，在培养皿直径2/3位置处分别接种短孢炭疽菌、菌核菌、禾谷镰刀菌、甘薯黑斑病菌和梨树腐烂病菌各1个菌饼，每个设3组平行。设置各单独培养的病原菌为阴性对照。于28℃培养箱中培养，三天后观察病原真菌菌株半径变化。结果如图2所示，图a为短孢炭疽菌、菌核菌、禾谷镰刀菌、甘薯黑斑病菌以及梨树腐烂病菌的阴性对照及其与多头菌njc01共培养时的拮抗现象，图b为靠近多头菌njc01的病原菌的生长状况柱形图。由图可知靠近多头菌njc01的病原真菌的半径比远离多头菌njc01的半径短，说明多头菌njc01对这几种病原真菌的生长有拮抗作用。实施例3细胞活性鉴定：检验多头菌njc01对短孢炭疽菌菌丝生长的影响多头菌njc01菌饼与短孢炭疽菌菌饼制备方法同实施例1。伊文思蓝染色：取干净的载玻片，加入一滴无菌水，取少量菌落边缘菌丝至无菌水中，将多余的水吸去后在火焰上轻轻燎几次，待水份蒸干后，加入2-3滴伊文思蓝染液，使其将样品覆盖，染色8-10min，吸去染液，用无菌水洗涤2-3次，盖上盖玻片，在显微镜底下观察。活细胞为无色，死细胞可被染为蓝色。中性红染色：取干净的载玻片，加入一滴无菌水，取少量菌落边缘菌丝至无菌水中，将多余的水吸去后在火焰上轻轻燎几次，加入2-3滴中性红染液，使其将样品覆盖，染色8-10min，吸去染液，用无菌水洗涤2-3次，盖上盖玻片，在显微镜底下观察，活细胞为红色，死细胞可被染为无色。将多头菌njc01与短孢炭疽菌共培养，方法同实施例2。设3组平行，于28℃培养箱中培养3天，使用接种环从平板中挑取靠近多头菌njc01的短孢炭疽菌菌丝的样本2个，分别使用伊文思蓝染液和中性红染液进行染色。挑取远离多头菌njc01的短孢炭疽菌菌丝的样本2个，分别使用伊文思蓝染液和中性红染液进行染色，然后在显微镜下观察。观察结果如图3所示，图3为观察到的4个样本的染色情况。根据图3可以发现，使用伊文思蓝染色菌丝为深蓝色，使用中性红染色菌丝为无色或淡红色，说明靠近多头菌njc01端的短孢炭疽菌活性很低。远离多头菌njc01端，可被伊文思蓝染为淡蓝色或无色，可被中性红染为深红色，说明短孢炭疽菌活性很高。结果表明多头菌njc01可杀死靠近自己的短孢炭疽菌。实施例4通过sem观察多头菌njc01对短孢炭疽菌的空间抑制作用多头菌njc01菌饼与短孢炭疽菌菌饼制备方法同实施例1。准备5个毛豆豆荚，使用5％的84消毒液浸泡半个小时，再用无菌水浸泡半个小时，重复两次。使用灭菌的刀片，在毛豆豆荚上切去宽为8cm，厚1mm的正方形表皮，将每个伤口接种1个多头菌njc01菌饼，然后放入托盘，用保鲜膜缠绕固定并保持湿润，在28℃的培养箱中进行培养，24h后移去多头菌njc01的菌饼，并接种短孢炭疽菌菌饼，放入托盘，用保鲜膜缠绕固定并保持湿润，在28℃的培养箱中培养24h后，移去短孢炭疽菌菌饼。sem镜检样品预处理：切取0.25cm2×2mm的接种区域，置于盖玻片上，加入pfa，使其可覆盖整个样本，然后依次用65％、75％、85％、95％、100％、100％的酒精浸泡，每次浸泡8min。用扫描电子显微镜对样本进行观察。结果如图4所示，图4为sem镜检的结果，由图a可见，多头菌njc01可形成生物膜；图b可见，短孢炭疽菌的菌丝表面产生了褶皱，由此可知多头菌njc01破坏了短孢炭疽菌的形态，从而说明多头菌njc01在空间上抑制短孢炭疽菌的生长。实施例5多头菌njc01对短孢炭疽菌的碳源营养竞争作用提前一周准备配制dns溶液：精确称取7.5g3,5-二硝基水杨酸，向其中加入500ml超纯水，继续加入14.0gnaoh，不断搅拌直至溶液清澈透明。向该溶液中逐步加入216g酒石酸钾钠(四水)、5g苯酚和6.0g偏重亚硫酸钠，稍微加热至完全溶解后，用蒸馏水定容至1000ml，贮于棕色瓶中放置一周后备用。制dns试剂的标准曲线：(1)精确称取无水葡萄糖配制葡萄糖标准液(1mg/ml)；(2)取适量分别稀释至0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml；(3)取各个浓度的糖溶液0.5ml于15ml刻度试管中，并用0.5ml超纯水做空白对照；(4)分别向各试管中准确加入0.5mldns试剂，沸水浴加热5min后，在流水中冷却后，向各试管中加8ml超纯水；(5)在540nm波长下测定吸光度；(6)利用excel做出标准曲线，r2大于0.99即可。多头菌njc01菌饼与短孢炭疽菌菌饼制备方法同实施例2。用大麦-蜂蜜-蛋白胨培养基对多头菌njc01和短孢炭疽菌进行培养2天。大麦-蜂蜜-蛋白胨培养基配方如表3所示，备料后于121℃湿热法灭菌1h。表3大麦-蜂蜜-蛋白胨培养基配方(40ml)试剂质量大麦100mg蜂蜜600mg蛋白胨200mg蒸馏水40ml于4℃，10000rpm，离心收集新鲜培养的菌丝，并用适量无菌水洗涤。菌丝体用少量无菌水重悬后，使用血球计数板在显微镜下计数，配制多头菌njc01孢子浓度为106个/ml，短孢炭疽菌孢子浓度为104个/ml。配制50mlyepd培养基，同时，准备12个50ml灭菌的离心管，在每个离心管中加入5mlyepd培养基。一组加200μl无菌水为空白对照，一组加200μl多头菌njc01孢子悬液，一组加200μl短孢炭疽菌孢子悬液，最后一组加入200μl多头菌njc01孢子悬液和200μl短孢炭疽菌孢子悬液，每组设3个平行，在28℃，200rpm摇床中培养4天。yepd培养液配方如表4所示，备料后于115℃湿热法灭菌20min。表4yepd培养液配方(50ml)试剂质量酵母提取物150mg胰蛋白胨500mg葡萄糖1g蒸馏水50ml样品测定：从各个离心管中取50μl培养液，加入950μl纯净水稀释20倍，使糖浓度为0.1-1mg/ml，取稀释后的糖液0.5ml于15ml刻度管中，加入0.5mldns试剂，沸水中煮5min，冷却后向其中加入8ml水，在540nm波长下测定吸光度。实验结果如图5所示，由图5a可知与对照组相比，多头菌njc01能显著消耗培养基中的葡萄糖，短孢炭疽菌培养基中的葡萄糖没有明显的降低，而两者混合培养时，能显著消耗葡萄糖，且混合培养的葡萄糖消耗量大于单独培养之和，表明多头菌njc01竞争性抢夺短孢炭疽菌的碳源；图5b表明，多头菌njc01可抑制短孢炭疽菌孢子的萌发。实施例6多头菌njc01的孢子对毛豆豆荚炭疽病预防效果多头菌njc01菌饼与短孢炭疽菌菌饼制备方法同实施例1。用大麦-蜂蜜-蛋白胨培养基对多头菌njc01进行培养，获取孢子。取生长状况相似的采后毛豆豆荚，均分用于实验。试验组：将毛豆豆荚浸泡在每毫升含有106、107、108个孢子的njc01孢子悬液中半个小时(每组15个)，设置水浸泡为阴性对照，设置在浓度为10mg/ml多菌灵溶液中浸泡5min为阳性对照，取出毛豆豆荚，用牙签在豆荚表皮打一个直径为2mm的小孔，用无菌镊子接种一个短孢炭疽菌菌饼至小孔处，将其转移至托盘，用保鲜膜缠绕固定并保持湿润，放入28℃培养箱中培养，24h后观察孔口感染情况。结果如图6示，随着多头菌njc01孢子悬液浓度的升高，毛豆豆荚接种短孢炭疽菌部位伤口直径更小，黑色更浅，表明多头菌njc01对短孢炭疽菌具有很好的预防效果。以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12