一种利用家蚕丝腺大规模生产荧光蛋白的方法

本发明应用于生物技术领域，具体涉及一种利用家蚕丝腺大规模生产荧光蛋白的方法。

背景技术：

随着21世纪生物工程以及基因工程的迅速发展，人们对医用、药用、食用、美容、保健等各种用途的功能性蛋白需求量日益增大，依靠天然来源的蛋白质提取和生产已无法满足快速增长的市场需求。建立和完善各种高效的原核和真核表达系统，并利用菌株、细胞和昆虫等作为宿主生物反应器，是实现低成本、规模化生产具有生物学活性的重组外源蛋白的有效和可持续方法，并成为当今世界研究的热点。利用中国仓鼠卵巢细胞作为生物反应器生产外源蛋白是目前最为标准的表达模式，但其运营成本和对环境的要求极为苛刻，严重限制了其大规模推广应用。为了建立低成本、规模化、安全可持续的高效生产外源蛋白的生物工厂，自2000年以来，科研人员开始尝试利用转基因生物，如哺乳动物、鸟类、昆虫以及植物的器官作为生物反应器来生产重组外源蛋白。

家蚕以泌丝著称，是最早被人类所完全驯化利用的经济动物(昆虫)之一。绢丝腺是合成、分泌蚕丝蛋白的唯一器官，为整个蚕丝业的生物学基础。经过数千年的人工驯化，家蚕的绢丝腺具备了超强的蛋白质合成与分泌能力，一头体重5g左右家蚕能合成分泌约0.5g蚕丝蛋白，为目前已知昆虫之最。蚕丝蛋白主要由丝素蛋白(fibroin)和覆被在其外层的丝胶蛋白(sericin)构成：丝素蛋白是蚕丝的主体，约占75％，由蚕的后部丝腺合成，包括fib-h链、fib-l链和p25三种主要组分，均不溶于水；其余为丝胶蛋白，约占25％，由蚕的中部丝腺合成，包括丝胶1(sericin1)、丝胶2(sericin2)和丝胶3(sericin3)三种主要组分，其中又以丝胶1蛋白含量最高，均可溶于水。随着现代分子生物学和转基因技术的发展，家蚕绢丝腺的高效合成与分泌丝蛋白这一特征，以及所具备的糖基化、甲基化等对外源蛋白保持活性极其重要的蛋白质翻译后修饰加工能力，饲养成本低，可工厂化生产，对人畜安全等特点，使其成为理想的生物反应器模型，备受各国研究人员关注并竞相开发利用。

从1962年下村修等在名为aequoreavictoria的水母体内发现并分离得到最早的荧光蛋白绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,gfp)开始，人们对于荧光蛋白的进一步研究和应用都没有停止过。近年来，国内外利用piggybac转座子介导的转基因技术以及家蚕组织特异启动子元件在丝腺中尝试表达了多个外源蛋白，包括：在后部丝腺表达了丝素重链融合的egfp(zhaoetal.2010)、猫干扰素(kuriharaetal.2007)、增强型绿色荧光蛋白(kojimaetal.2007)、蜘蛛丝牵引蛋白(zhuetal.2010)，丝素轻链融合的人ⅲ型胶原蛋白的部分肽段(tomitaetal.2003)、增强型绿色荧光蛋白(tomitaetal.2003)、羟基脯氨酸胶原部分肽段(adachietal.2006)、成纤维细胞生长因子(hinoetal.2006)、部分胶原蛋白肽段(yanagisawaetal.2007)，以及p25融合的红色荧光蛋白(royeretal.2005)等。但上述研究成果的产业化推进颇为困难，主要原因在于：这类丝素重链表达系统由于调控元件较为单一，并且外源蛋白需要与内源丝蛋白进行融合才能实现分泌表达，对外源蛋白的表达量和生物活性产生不利影响，研究人员尝试过蛋白复性策略，但是流程繁琐且收效甚微，因而极大的限制的丝素重链表达系统的应用。因此，有必要对现有的丝素重链表达系统进行改造，以提高外源蛋白的表达效率与生物活性，推动家蚕丝腺生物反应器技术体系在生物制药和功能性蚕丝遗传改良领域中的应用。

技术实现要素：

本发明针对现有技术中存在的上述问题，提供一种利用家蚕丝腺大规模生产荧光蛋白的方法，提高外源蛋白，尤其是红色荧光蛋白的表达效率与生物活性。

本发明解决其技术问题是采用以下技术方案实现的：

一种利用家蚕丝腺大规模生产荧光蛋白的方法：将构建的生产荧光蛋白的家蚕品系hfrs与家蚕品系“两广二号”lg杂交后自交得到f2代家蚕，选取蚕茧的茧色为粉红色个体作为转基因家蚕品种；将转基因家蚕品种蚕茧粉碎后于tris-hcl溶液中提取dsred1蛋白、超滤浓缩后得到dsred1浓缩液；对所述dsred1浓缩液进行碱性蛋白酶灭活得到荧光蛋白溶液。

进一步的，荧光蛋白转基因家蚕品种的培育的方法为：

将构建的生产荧光蛋白的家蚕品系hfrs与家蚕品系“两广二号”lg进行杂交得到f1代，将f1代家蚕饲养至结茧后，将f1代家蚕进行自交得到f2代，在f2代结茧后选取蚕茧的茧色为粉红色的个体作为转基因家蚕品种，命名为lg-hfrs-f2。

进一步的，所述家蚕品系“两广二号”lg为市场上常规“两广二号”家蚕。

进一步的，所述dsred1蛋白的提取过程为：将转基因家蚕品种的蚕茧加入研磨机粉碎，将粉碎后的蚕茧溶解于含有碱性蛋白酶的tris-hcl溶液中，在50℃-55℃下水浴提取；提取后进行过滤后收集滤液，然后分别用滤纸、微孔滤膜进行再次过滤得到dsred1提取液。

进一步的，所述碱性蛋白酶的加入量为所述tris-hcl溶液质量的0.3％。

进一步的，所述dsred1蛋白提取时蚕茧与溶液的浴比为10-25mg/ml。

进一步的，所述tris-hcl溶液的ph值为9.0。

进一步的，在50℃-55℃下水浴时间为大于等于2h。

进一步的，微孔滤膜过滤时选用0.45μm的微孔滤膜。

进一步的，所述碱性蛋白酶的活力为大于200000u/g。

进一步的，所述超滤浓缩选用50000mwco超滤管对dsred1提取液进行浓缩得到dsred1浓缩液。

进一步的，所述碱性蛋白酶灭活的过程为：将dsred1浓缩液分别在25℃-75℃的条件下进行水浴。

进一步的，dsred1浓缩液分别在65℃-70℃的条件下进行水浴。

进一步的，所述水浴时间为3-24h。

进一步的，将经碱性蛋白酶灭活处理后的所述荧光蛋白溶液在-20℃环境中冷冻过夜，冷冻干燥得到dsred1冻干粉。

进一步的，将经碱性蛋白酶灭活处理后的所述荧光蛋白溶液在-20℃环境中冷冻6小时-12小时。与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1)本发明建立了一种利用家蚕丝腺大规模生产荧光蛋白的方法，提高了荧光蛋白的产率，1glg-hfrs-f2的蚕茧最终可以获得8mg的dsred1蛋白，可实现dsred1蛋白的大规模工业化生产。

2)本发明dsred1蛋白的生产不需要内源丝蛋白进行融合即可实现大规模生产，制备方法简单，有利于推动家蚕丝腺生物反应器技术体系在生物制药和功能性蚕丝遗传改良领域中的应用。

附图说明

图1为本发明一种利用家蚕丝腺大规模生产荧光蛋白的方法中荧光蛋白转基因家蚕品种的培育过程。

图2为本发明一种利用家蚕丝腺大规模生产荧光蛋白的方法dsred1蛋白提取过程中的颜色变化图。

图3为本发明一种利用家蚕丝腺大规模生产荧光蛋白的方法中dsred1提取液蛋白电泳检测图。

图4为本发明一种利用家蚕丝腺大规模生产荧光蛋白的方法中dsred1浓缩液荧光强度检测图及不同状态光照示意图。

其中，a为不同温度水浴处理后dsred1浓缩液荧光强度检测图，b为不同温度水浴处理后dsred1浓缩液相对荧光强度，c为不同温度水浴处理后dsred1浓缩液在白光下的颜色变化照片，d为不同温度水浴处理后dsred1浓缩液在蓝色led灯下的颜色变化照片。

图5为本发明一种利用家蚕丝腺大规模生产荧光蛋白的方法中荧光蛋白溶液蛋白电泳检测图。

图6为本发明一种利用家蚕丝腺大规模生产荧光蛋白的方法生产过程中的颜色变化图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明技术方案作进一步详细说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

实施例1：荧光蛋白转基因家蚕品种的培育

参见附图1，将构建的生产荧光蛋白的家蚕品系hfrs与家蚕品系“两广二号”lg进行杂交得到f1代，将f1代家蚕饲养至结茧后，将f1代家蚕进行自交得到f2代，在f2代结茧后选取茧色为粉红色的个体作为转基因家蚕品种，命名为lg-hfrs-f2。本发明中选用的生产荧光蛋白的家蚕品系hfrs为按照专利号为2021103128740的发明专利中方法培育得到的家蚕品系；选用的家蚕品系“两广二号”lg为市场上常规“两广二号”家蚕。家蚕饲养温度为26℃，食物为桑叶。

生产荧光蛋白的家蚕品系hfrs的制备方法参照专利号为2021103128740的发明专利中hfrs品系培育方法培育得到的家蚕品系：

1)将pbac载体与辅助质粒pha3pig以质量比为1:1的比例一起注入g0代卵中，饲养后得到g0蛾子，然后进行交配制种得到g1代；

2)用荧光显微镜对g1代卵的眼睛或神经是否有荧光进行阳性个体筛选获得转基因家蚕，获得的转基因家蚕饲养、传代，保留pbac-hfrs载体单拷贝的阳性转基因个体为hfrs品系。

f2代家蚕结茧后蚕茧有四种颜色，分别为粉红色、橙色、黄色和白色，其中粉红色蚕茧的家蚕高产荧光蛋白，因此后续选用粉红色蚕茧的个体作为转基因家蚕品种。

实施例2：dsred1蛋白的提取

参见附图2，将实施例1中转基因家蚕品种lg-hfrs-f2的蚕茧加入研磨机粉碎，将粉碎后的蚕茧以10-25mg/ml的浴比溶解于含有0.3％碱性蛋白酶(1：200000)的20mmtris-hcl(ph9.0)溶液中，放置在50℃-55℃水浴锅中进行提取大于等于2h；提取后在18000rpm下离心10min过滤，过滤后收集滤液，然后分别用滤纸、0.45μm的微孔滤膜进行再次过滤得到dsred1提取液。

参见附图3，将得到的dsred1提取液利用蛋白电泳检测，分别可以看到dsred1蛋白单体和四聚体大小的条带，表明dsred1蛋白在lg-hfrs-f2蚕丝中以四聚体的形式存在。通过imagej软件对提取液中的纯度进行了灰度分析，dsred1在dsred1提取液中的纯度为82.18％。

实施例3：碱性蛋白酶的灭活

将实施例2得到的dsred1提取液用50000mwco超滤管(截留分子量小于等于50000mwco的超滤管均可)进行浓缩，得到dsred1浓缩液。

将含有dsred1蛋白的碱性蛋白酶浓缩液，在25℃-75℃的条件下进行水浴，水浴时间分别为3小时-24小时，进行碱性蛋白酶灭活得到荧光蛋白溶液。将丝素粉以2.5％的比例分别与水浴后的提取液进行混合溶解，用4-20％梯度丙烯酰胺凝胶进行电泳检测，看丝素蛋白是否完整或降解。

参见附图4，对得到的dsred1浓缩液分别选用25℃、65℃、70℃、80℃进行水浴处理24h后，对荧光强度进行检测，可以看出，与25℃处理组相比dsred1蛋白的荧光强度，70℃和80℃组显著降低，65℃组与25℃组没有显著差异(如图4a所示)。以25℃组处理24h后的dsred1蛋白活性为100％，通过荧光强度对比分析，80℃处理24小时组的dsred1蛋白的活性显著失活，仅为17.41％；70℃组能保留90.42％的活性；65℃组的活性为98.85％(如图4b所示)。

对碱性蛋白酶灭活后的荧光蛋白溶液进行光照观察，可见不同温度处理24h后的样品进行白光下观察发现，25℃组、65℃组和70℃组溶液为粉红色，80℃组颜色明显变浅(如图4c所示)，不同温度处理24h后的样品在蓝色led灯下观察，25℃组、65℃组和70℃组溶液透过橙色滤光片后呈亮黄色，80℃组荧光强度明显变弱(如图4d所示)。为了探究温度和时间对于碱性蛋白酶活性的影响，将丝素粉以2.5％的比例分别与水浴后的提取液进行混合溶解，用4-20％梯度丙烯酰胺凝胶进行电泳检测，看丝素蛋白是否完整或降解。参见附图5，对碱性蛋白酶灭活后的荧光蛋白溶液在25℃、65℃、70℃和80℃分别处理3h和24h处理后的样品中按2.5％的比例添加丝素粉充分溶解，以2.5％的丝素水溶液为对照，蛋白电泳检测结果分析表明65℃、70℃和80℃处理24h后电泳结果跟丝素水溶液的丝素蛋白条带结果基本一致，表明水浴温度大于或等于65℃处理24h以后碱性蛋白酶会失活。25℃处理3h组对丝素蛋白的降解最为明显，25℃处理24h大部分丝素蛋白也被降解，不能保证丝素蛋白的完整性，65℃和70℃处理3h后均有少量降解，但是70℃处理3h丝素蛋白条带的完整性要好于65℃组(如图5所示)。

实施例4：dsred1冻干粉的制备

参见附图6，将实施例3碱性蛋白酶灭活得到荧光蛋白溶液放置于-20℃环境中冷冻过夜(6小时-12小时)，冷冻干燥得到dsred1冻干粉，1glg-hfrs-f2的蚕茧最终可以获得近8mg的dsred1蛋白，dsred1冻干粉的颜色为红色。

实施例5：dsred1/fibroin冻干复合物的制备

参见附图6，将实施例3碱性蛋白酶灭活得到荧光蛋白溶液与丝素蛋白溶液混合后放置于-20℃环境中冷冻12小时，然后在-80℃下冷冻24小时，冷冻干燥得到dsred1/fibroin冻干复合物，dsred1/fibroin冻干复合物的颜色为粉红色。

丝素蛋白溶液的制备方法为：

将两广二号蚕茧置于0.2％na2co3溶液中经沸水浴脱胶后，用去离子水洗涤干净并干燥。然后将5g脱胶后的蚕丝用100ml9.3mlibr溶液置于65℃烘箱进行溶解，溶解后的丝素溶液用截留分子量为10kda的透析袋置于去离子水中透析，每隔3-6小时更换一次去离子水，需更换4-6次。将透析后的丝素溶液经离心后取上清获得丝素溶液。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例。对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术构思前提下所作任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。