用于鉴别鹿角或鹿皮配方颗粒的特征肽段及其检测方法

本发明涉及一种鹿源特征肽段及其检测方法，具体涉及区分鹿角与鹿皮，以及鹿角配方颗粒、鹿角胶配方颗粒、以鹿角或鹿角胶为原料的药品、保健品、食品的质量控制。

技术背景

胶类药材包括阿胶、鹿皮胶、鹿角胶、黄明胶等，80％以上的成分为不同类别的胶原蛋白，包括i型胶原α1链(col1a1)、i型胶原α2链(col1a2)、ii型胶原α1链(col2a1)、iii型胶原α1链(col3a1)等，其中以col1a2来源的肽段为主。col1a2作为高保守蛋白质，广泛存在于不同动物种体内，是构成胶类药材的重要蛋白类成分之一。

鹿角与鹿皮均来源于梅花鹿或马鹿，以鹿角或鹿皮熬制的胶块均为名贵胶类中药材。鹿角为马鹿或梅花鹿已骨化的角，价格远高于鹿皮，市场上存在以鹿皮胶掺入鹿角胶以次充好的现象。如何将鹿皮胶与鹿角胶进行区分，着实是胶类药材鉴定研究的难题，给鹿角胶与鹿皮胶鉴别，以及鹿角胶掺入鹿皮胶的伪品鉴别都带来了挑战。

鹿角胶配方颗粒、鹿角配方颗粒，以鹿角胶为原料的药品、保健品、食品均经过复杂加工过程，如有鹿皮胶掺伪情况，仅从外观上难以辨别，且鹿角与鹿皮的蛋白质组成相同，现有的种属专属肽无法区分鹿角胶与鹿皮胶。

技术实现要素：
：

发明目的：本发明通过大量是实验筛选，研究确定4条鹿源肽段相对含量的比值，从而用来区分鹿角与鹿皮。该方法专属性强、灵敏度高、操作简单，可用于鹿角及其相关产品的质量控制。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于鉴别鹿角或鹿皮配方颗粒的特征肽段，所述的特征肽为：

肽1:

gly-phe-hyp-gly-leu-pro-gly-pro-ser-gly-glu-hyp-gly-lys

肽2：

gly-pro-hyp-gly-ala-gly-gly-pro-hyp-gly-pro-arg

肽3：

gly-glu-met-gly-pro-ala-gly-ile-hyp-gly-ala-pro-gly-leu-leu-gly-ala-arg

肽4：

gly-ser-ala-gly-pro-hyp-gly-ala-thr-gly-phe-hyp-gly-ala-ala-gly-arg

一种用于鉴别鹿角或鹿皮配方颗粒的特征肽段的检测方法，包括以下步骤：

(1)将上述肽1～肽4的4个鹿源特征肽配成混合对照品溶液；

(2)将待检测鹿角提取物与鹿皮提取物样品，用胰蛋白酶进行酶切后，将酶解液和步骤(1)肽1～肽4混合对照品溶液注入液质联用仪，以鹿源特征肽对照，采用esi正离子模式，多反应监测模式，选择的离子对包括：肽1：m/z665.2(双电荷)→841.4、肽2：m/z525.1(双电荷)→894.4进行检测、肽3：m/z819.4(双电荷)→924.6、肽4：m/z730.4(双电荷)→544.3进行检测；其中肽4为参比，以肽1峰面积a肽1与肽4峰面积a肽4的比值或肽2峰面积a肽2与肽4峰面积a肽4的比值或肽3峰面积a肽3与肽4峰面积a肽4的比值确定样品来源为鹿角或是鹿皮。

作为优选方案，所述的用于鉴别鹿角或鹿皮配方颗粒的特征肽段的检测方法，所述的酶切方法为：取待检测样品10mg，加入5ml磷酸盐缓冲液，超声使样品完全溶解，12000rpm离心20min，取上清液150μl，置于2ml离心管中，以1ml50mmpbs稀释，加入适量胰蛋白酶，摇匀，充分酶解，加入10％三氟乙酸溶液60μl终止反应，12000rpm离心20min，即得鹿角或鹿皮酶解液，置于-20℃保存，备用。

作为优选方案，所述的用于鉴别鹿角或鹿皮配方颗粒的特征肽段的检测方法，加入胰蛋白酶的质量浓度为0.1％～10％。

作为优选方案，所述的用于鉴别鹿角或鹿皮配方颗粒的特征肽段的检测方法，酶解方式包括：37℃恒温酶解、微波辅助酶解、超声辅助酶解、酶固定化酶解。

作为优选方案，所述的用于鉴别鹿角或鹿皮配方颗粒的特征肽段的检测方法，液质联用仪检测的液相条件为：色谱柱为1.7μmwatersc18柱，规格为2.1μm×100mm，上样量为2μl，流速0.3ml/min，0～3.5min，10～30％a线性梯度洗脱，3.5～4min，30～10％a线性梯度洗脱，4～6min，10％a洗脱；采用三重四极杆质谱，质谱条件为：m/z612.2(双电荷)→747.4、m/z871.4(三电荷)→726.4、m/z808.9(双电荷)→892.4、m/z596.8(双电荷)→518.7。

液质联用仪检测的质谱条件为：电喷雾正离子模式esi+，质谱参数为：离子源温度500℃；电离电压5500v；脱溶剂温度500℃；离子源气体1，60psi；离子源气体2，60psi；

设置特征肽对应的离子对条件如下：

肽1：m/z665.2(双电荷)→841.4，dp＝135.45,ce＝30.86；

肽2：m/z525.1(双电荷)→894.4，dp＝133.61,ce＝32.47；

肽3：m/z819.4(双电荷)→924.6，dp＝138.84,ce＝33.24；

肽4：m/z730.4(双电荷)→544.3，dp＝141.97,ce＝33.19。

作为优选方案，所述的用于鉴别鹿角或鹿皮配方颗粒的特征肽段的检测方法，

鹿角a肽1/a肽4平均值为3.62±0.34，a肽2/a肽4平均值为2.14±0.46，a肽3/a肽4平均值为3.19±0.65；

鹿皮胶a肽1/a肽4平均值为0.30±0.07，a肽2/a肽4平均值为0.09±0.01，a肽3/a肽4平均值为0.15±0.03。

作为优选方案，所述的鹿角或鹿皮配方颗粒包括鹿角配方颗粒、鹿角胶配方颗粒、以鹿角或鹿角胶为原料的药品、保健品及食品等。

作为优选方案，所述的用于鉴别鹿角或鹿皮配方颗粒的特征肽段的检测方法，包括鹿角配方颗粒、鹿角胶配方颗粒、以鹿角或鹿角胶为原料的药品、保健品及食品等。

有益效果：本发明相比现有技术具有以下优点：

本发明通过大量是实验筛选，研究确定肽1～肽3共3条鹿源肽段与肽4的相对含量的比值，来区分鹿角与鹿皮。该方法专属性强、灵敏度高、操作简单，可用于鹿角与鹿角胶的质量控制。从而可以克服现有技术中，鹿角胶与鹿皮胶从外观上难以区分，专属性肽段也难以区分的不足，取得了非常好的技术进步。

附图说明

图1为肽1的质谱图。

图2为肽2的质谱图。

图3为肽3的质谱图。

图4为肽4的质谱图。

具体实施例

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但这些实施例不应解释为限制本发明。

实施例1

一种用于鉴别鹿角或鹿皮配方颗粒的特征肽段，所述的特征肽序列有4个，如序列表1：

肽1:

gly-phe-hyp-gly-leu-pro-gly-pro-ser-gly-glu-hyp-gly-lys

肽2：

gly-pro-hyp-gly-ala-gly-gly-pro-hyp-gly-pro-arg

肽3：

gly-glu-met-gly-pro-ala-gly-ile-hyp-gly-ala-pro-gly-leu-leu-gly-ala-arg

肽4：

gly-ser-ala-gly-pro-hyp-gly-ala-thr-gly-phe-hyp-gly-ala-ala-gly-arg。

实施例2鹿角配方颗粒a肽1/a肽4、a肽2/a肽4、a肽3/a肽4的测定

取5个批次鹿角配方颗粒样品，每批次各取20mg，加入5ml磷酸盐缓冲液，超声使样品完全溶解，12000rpm离心20min，取上清液150μl，置于2ml离心管中，以1ml50mmpbs稀释，加入1％胰蛋白酶(w/v)，摇匀，37℃恒温酶解12h，酶解后加入10％tfa溶液60μl终止反应，12000rpm离心20min，即得鹿角配方颗粒酶解液，置于-20℃保存，备用。

将上述5批次的鹿角配方颗粒酶解液注入液质联用仪，进样量为1μg，液质联用仪检测的液相条件为：色谱柱为1.7μmc18反相色谱柱(2.1μm×100mm)，流速0.3ml/min，流动相a(乙腈)，流动相b(0.1％甲酸)，0～3.5min，10～30％a线性梯度洗脱，3.5～4min，30～10％a线性梯度洗脱，4～6min，10％a洗脱。液质联用仪检测的质谱条件为：电喷雾正离子模式(esi+)，质谱参数为：离子源温度500℃；电离电压5500v；脱溶剂温度500℃；离子源气体1，60psi；离子源气体2，60psi。设置特征肽对应的离子对条件如下：

肽1：m/z665.2(双电荷)→841.4，dp＝135.45,ce＝30.86；

肽2：m/z525.1(双电荷)→894.4，dp＝133.61,ce＝32.47；

肽3：m/z819.4(双电荷)→924.6，dp＝138.84,ce＝33.24；

肽4：m/z730.4(双电荷)→544.3，dp＝141.97,ce＝33.19。

5个批次鹿角配方颗粒a肽1/a肽4、a肽2/a肽4、a肽3/a肽4的数值见表1，a肽1/a肽4平均值为3.62±0.34，a肽2/a肽4平均值为2.14±0.46，a肽3/a肽4平均值为3.19±0.65。

实施例3鹿皮胶a肽1/a肽4、a肽2/a肽4、a肽3/a肽4的测定

取5个批次鹿皮胶样品，每批次各取20mg，加入5ml磷酸盐缓冲液，超声使样品完全溶解，12000rpm离心20min，取上清液150μl，置于2ml离心管中，以1ml50mmpbs稀释，加入1％胰蛋白酶(w/v)，摇匀，37℃恒温酶解12h，酶解后加入10％tfa溶液60μl终止反应，12000rpm离心20min，即得鹿皮胶酶解液，置于-20℃保存，备用。

将上述5批次的鹿皮胶酶解液注入液质联用仪，进样量为1μg，液质联用仪检测的液相条件为：色谱柱为1.7μmc18反相色谱柱(2.1μm×100mm)，流速0.3ml/min，流动相a(乙腈)，流动相b(0.1％甲酸)，0～3.5min，10～30％a线性梯度洗脱，3.5～4min，30～10％a线性梯度洗脱，4～6min，10％a洗脱。液质联用仪检测的质谱条件为：电喷雾正离子模式(esi+)，质谱参数为：离子源温度500℃；电离电压5500v；脱溶剂温度500℃；离子源气体1，60psi；离子源气体2，60psi。设置特征肽对应的离子对条件如下：

肽1：m/z665.2(双电荷)→841.4，dp＝135.45,ce＝30.86；

肽2：m/z525.1(双电荷)→894.4，dp＝133.61,ce＝32.47；

肽3：m/z819.4(双电荷)→924.6，dp＝138.84,ce＝33.24；

肽4：m/z730.4(双电荷)→544.3，dp＝141.97,ce＝33.19。

5个批次鹿皮胶a肽1/a肽4、a肽2/a肽4、a肽3/a肽4的数值见表2，a肽1/a肽4平均值为0.30±0.07，a肽2/a肽4平均值为0.09±0.01，a肽3/a肽4平均值为0.15±0.03。

表1鹿角配方颗粒a肽1/a肽4、a肽2/a肽4、a肽3/a肽4的结果

表2鹿皮胶a肽1/a肽4、a肽2/a肽4、a肽3/a肽4的结果

序列表

<110>江阴天江药业有限公司

南京中医药大学

<120>用于鉴别鹿角或鹿皮配方颗粒的特征肽段及其检测方法

<141>2021-04-20

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>14

<212>prt

<213>人工序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)

<400>1

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<213>人工序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)

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151015

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arg