一种防污染检测管和基于其的CRISPR分子诊断检测方法

本发明属于核酸分子诊断技术领域，涉及一种防污染检测管和基于其的crispr分子诊断检测方法。

背景技术：

快速、准确、灵敏、定量检测特定核酸序列在人类传染病的诊断、粮食安全、病原体的测定、全球生物安全以及在环境分析中跟踪生物污染以及环境质量监测等领域发挥着越来越重要的作用。新型冠状病毒的流行更是给人们的生命安全带来了巨大的威胁。新型冠状病毒迅速爆发的原因缺少有效的检测手段；目前世界统一认准的标准检测方法是pcr(聚合酶链反应)检测，但是这种方法存在一定的缺陷，检测周期长，完成一次核酸检测大约需要两到三个小时；另外，pcr检测还需要专门的技术人员，大型的仪器设备，这些条件都限制了该方法的应用。除了传统标准pcr检测之外，还有rpa(重组酶聚合酶扩增)技术，lamp(环介导的等温扩增)技术，rca(滚环扩增)技术，cpa(交叉引物扩增)技术以及psr(聚合酶螺旋反应)技术等主流的核酸扩增检测技术，但是这些方法也都存在一定的优势和缺陷，比如rpa技术，其响应速度快，指数级放大但是rpa灵敏度较低，不能够满足临床检测要求；再比如lamp技术，具有较高的灵敏度以及特异性，但是其引物设计复杂。因此，缺乏一种简单且有效的核酸检测方法，缩短检测时间，提高检测灵敏度，抑制病毒的传播速度。

crispr全称为“规律成簇的间隔短回文重复序列”(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)是一种广泛存在于古细菌和细菌的适应性免疫系统。crispr系统最早是在20世纪90年代初在大肠杆菌的基因组中发现。2013年，基因定点编辑技术crispr/cas9被研究人员发现，并将其成功应用，自此crispr技术开始成为最受欢迎的基因编辑工具。2017年，基因编辑领域国际顶尖学者哈佛大学博德研究所张锋教授团队将crispr技术应用到核酸检测领域，在其和加州大学伯克利分校的jenniferdoudna团队共同努力下，该技术已被用于检测多种病原生物的核酸分子(如寨卡病毒、登革热病毒、结核分枝杆菌等)。此后，以cas12、cas13、cas14等crispr酶为基础的各种核酸检测平台也应运而生。crispr技术相比较传统的核酸检测方法不仅在检测的成本、效率、便携性、特异性、简便性等方面都显示出了巨大的优势，同时该项技术还具有较好的生物相容性，能够跟其他技术结合，从而更加简便高灵敏的进行核酸检测，该项技术也被誉为下一代的新型核酸检测技术。但是crispr技术还存在一些问题，为了提高检测灵敏度，在进行crispr核酸检测反应前通常需要先对核酸扩增，扩增后再加入crispr反应体系实现靶标核酸的检测。即需要进行扩增后开盖、试剂的转移、闭盖等操作，极易造成实验室气溶胶污染，这样不仅导致后续结果出现较高的假阳性问题而且也极易造成实验室以及相关器材的交叉污染，同时还需要花费大量的时间去完成一系列操作，造成人力物力的浪费。因此急需寻找到一种方便可行的装置或者方法去解决crispr技术所面临的核酸扩增到核酸检测这一步过程中开盖、样本核酸的转移和闭盖等引起的实验室气溶胶污染等问题。

2017年基因编辑领域国际顶尖学者哈佛大学博德研究所张锋教授团队[gootenberg,j.s.etal.nucleicaciddetectionwithcrispr-cas13a/c2c2[j].science356,438-442(2017)]将用于核酸扩增的rpa试剂以及核酸检测的crispr试剂相混合，使两个反应在同一个试管中同时进行，实现一边扩增一边检测。这样就将核酸扩增以及核酸检测合成为一步，避免了因开盖、样本核酸的转移等操作，而造成的气溶胶污染，提高了核酸检测的效率，但这种边扩增边检测的方法降低了检测灵敏度。2019年huihuiliu、yongmingwang[huihuiliu,yongmingwang.etal.cas12avdet:acrispr/cas12a-basedplatformforrapidandvisualnucleicaciddetection[j].americanchemicalsociety91,12156-12161(2019).]等人提出了一种基于crispr/cas12a的方法，称为“cas12avdet”，用于快速核酸检测，避免因开盖操作所造成的气溶胶污染，减少实验操作，提高检测效率。该方法是通过在单个反应系统中将重组酶聚合酶扩增(rpa)与crispr试剂整合在一个试管中，但是将crispr试剂添加到经过独特设计的管内壁上，在rpa反应完成后，经离心将crispr试剂添加到rpa反应溶液中，实现核酸检测。这样可以在30min内完成检测，同时避免因开盖、样本核酸的转移等操作造成的气溶胶污染等问题，但这种方法在实际使用过程中难以操作，存在crispr试剂和rpa溶液提前混合的问题，降低灵敏度。mengyaozhang、chengzhiliu等人[mengyaozhang,chengzhiliu.etal.selectiveendpointvisualizeddetectionofvibrioparahaemolyticuswithcrispr/cas12aassistedpcrusingthermalcyclerforon-siteapplication[j].sciencedirect214,1873-3573(2020).]借助于crispr和pcr技术开发了一个检测副溶血弧菌的检测平台。该方法将crispr试剂预先添加到试管盖内，然后在微型热循环仪上将pcr试剂盖关闭，进行pcr反应，通过液滴间的吸附力，crispr试剂将会吸附在试管盖上，进而将两种试剂分开。在这个过程中，为避免酶的失活，热循环仪的上盖将会打开，使整个反应一部分在热循环仪上，一部分暴露在空气中。在扩增完成后，在通过离心将吸附在试管盖上的crispr试剂甩到试管底部，与pcr试剂相混合，并用dutp代替pcr系统中的dttp进行核酸检测，这样就避免了开盖、样本核酸的转移等操作，这种方法和将crispr试剂添加在试管壁类似，也存在会导致crispr试剂和rpa溶液提前混合和误操作，降低灵敏度。

此外，上述现有使用的crispr分子诊断检测方法中，仍需要先在试管外对待检测核酸样本进行裂解，然后再加入到检测试管中进行后续的诊断检测，也就是说现有方法无法实现样本进结果出的一步操作，降低了核酸检测的检测效率。因此，现有的技术仍然无法在不导致假阳性、不降低灵敏度的情况下，实现样本进、结果出的一管化、简单无污染操作。

技术实现要素：

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种防污染检测管和基于其的crispr分子诊断检测方法。本发明的目的在于解决以crispr技术为基础的核酸检测过程中因为开盖、样本核酸的转移、闭盖等操作，造成假阳性或灵敏度降低，且无法实现一管化得到检测结果的问题；本发明提供的防污染检测管能够保证以crispr技术为基础的核酸检测在不降低灵敏度、不导致较高假阳性的前提下，使检测系统具有较高的鲁棒性，减少实验操作，防止污染，提高核酸检测的效率。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明公开了一种防污染检测管，包括扩增内管，扩增内管外部套设有检测外管，扩增内管内部设有裂解内管，扩增内管顶部设有管帽；其中，裂解内管包括底部设置的裂解内管密封薄膜，扩增内管包括底部设置的扩增内管密封薄膜；管帽包括管帽本体，管帽柱体上设有按压回弹部，管帽本体内部设有管针，管针与按压回弹部固定连接。

优选地，管帽柱体上设有用于卡固限位的外檐结构，按压回弹部设置于管帽柱体上部；扩增内管包括固定连接的第一空心圆柱体上部和第一类锥形下部，第一类锥形下部的收口侧设有开口，扩增内管密封薄膜设于所述开口进行密封；检测外管包括固定连接的第二空心圆柱上体和底部封闭的第二类锥形下体；裂解内管包括第三空心圆柱体，裂解内管密封薄膜设于第三空心圆柱体底部进行密封。

优选地，按压回弹部为聚烯烃弹力套筒，管针尾部与聚烯烃弹力套筒底部内侧面固定连接。

优选地，裂解内管、扩增内管、检测外管和管帽之间依次通过过盈配合连接。

优选地，裂解内管、扩增内管、检测外管和管帽之间依次通过螺纹配合连接。

优选地，裂解内管密封薄膜和扩增内管密封薄膜均为聚烯烃薄膜。

进一步优选地，裂解内管密封薄膜的薄膜厚度为50～100μm，扩增内管密封薄膜的薄膜厚度为50～100μm。

本发明公开了基于上述防污染检测管的一种crispr分子诊断检测方法，包括以下步骤：

1)将crispr试剂冻干置于检测外管后，将扩增内管固定于检测外管中上部；将核酸扩增试剂干粉置于扩增内管后，将裂解内管固定于扩增内管中部；将核酸裂解试剂置于裂解内管后，盖上管帽；得到待检测试剂管；

2)打开管帽，将待检测的样本核酸加入步骤1)所得待检测试剂管的裂解内管中；盖上管帽，在恒温环境中进行待检测的样本核酸的核酸裂解反应的程序；

3)核酸裂解反应结束后，按压管帽、使管针刺穿裂解内管密封薄膜，经一阶段离心，进行核酸扩增反应的程序；

4)核酸扩增反应结束后，按压管帽、使管针刺穿扩增内管密封薄膜，经二阶段离心，核酸检测反应的程序；

5)最后通过uv灯照射得到crispr分子诊断的检测结果。

优选地，步骤2)中，核酸裂解反应的恒温环境为37℃～40℃，时间为10～20min；步骤3)中，核酸扩增反应的温度为37℃～40℃，时间为10～20min；步骤4)中，核酸检测反应的温度为37℃～40℃，时间为15～20min；步骤3)中，一阶段离心的转速为600～6000rpm，一阶段离心的时间为5～20s；步骤4)中，二阶段离心的转速为600～6000rpm，二阶段离心的时间为5～20s；步骤3)中和步骤4)中，管帽(1)的按压时间为2～7s。

进一步优选地，步骤2)中，酸裂解反应的恒温环境为39℃，时间为10min；步骤3)中，核酸扩增反应的温度为39℃，时间为20min；步骤4)中，核酸检测反应的温度为39℃，时间为18min；步骤3)中，一阶段离心的转速为3000rpm，一阶段离心的时间为10s；步骤4)中，二阶段离心的转速为3000rpm，二阶段离心的时间为10s；步骤3)中和步骤4)中，管帽(1)的按压时间为5s。

优选地，将步骤1)所得待检测试剂管直接保存，用于crispr分子诊断的直接检测取用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明公开了一种防污染检测管，通过由内向外依次套设的裂解内管、扩增内管和检测外管，能够将crispr分子诊断中所需的三个检测阶段分为三部分检测空间，通过将管帽设计为带有按压回弹部和管针的结构，并将管帽安装于扩增内管顶部，使用时通过按动按压回弹部带动管针上下往复的位置改变，进而实现裂解内管密封薄膜和扩增内管密封薄膜的刺穿，能够满足上述三个检测阶段的分阶段进行。因此，本发明所述防污染检测管其结构设计合理，形成了独立分隔且全封闭的检测管结构，避免了因为开盖、样本核酸的转移、闭盖等操作，引起的实验室气溶胶污染等问题，同时实现了样本进、结果出的一管操作，简化了核酸检测过程中的操作步骤，增强了核酸检测的适用性。

进一步地，通过分别采用带有空心柱体结构和类锥形结构组成的各个扩增内管和检测外管，利用几何结构的配合、能够使其在内置装配过程中，留有满足测试试剂的填充空间，保证检测的顺利进行。

进一步地，通过将聚烯烃弹力套筒作为按压回弹部，能够将核酸裂解、核酸扩增和crispr检测这三个过程在一管中实现无缝连接，简化了实验操作步骤，避免了因为开盖、样本核酸的转移、闭盖等操作，引起的实验室气溶胶污染等问题。

进一步地，通过采用过盈配合连接或螺纹配合连接，能够实现管与管之间的密切配合，且保证离心处理中的体系密封性，有效的防止核酸检测过程中出现实验室气溶胶污染。

进一步地，通过采用聚烯烃薄膜作为裂解内管密封薄膜和扩增内管密封薄膜，能够将核酸裂解、核酸扩增和crispr检测这三个过程分隔，同时密封薄膜又能够被管针刺破，实现了核酸裂解、核酸扩增和crispr检测三个过程的有效衔接。

进一步地，裂解内管密封薄膜的薄膜厚度更优选为70μm，扩增内管密封薄膜的薄膜厚度更优选为90μm，不仅能够保证相应的密封薄膜能够承载相应体积的试剂，而且还能够容易的被管针刺破，将三个过程有序的进行衔接。

本发明还公开了基于上述防污染检测管的一种crispr分子诊断检测方法，采用本发明所述的防污染检测管进行crispr分子诊断时，缩减了开盖、各阶段样本核酸的转移、闭盖等操作，且通过简单按压、离心步骤即可实现样本进结果出，简化了操作步骤，提高了核酸检测的效率；同时避免了因开盖、样本核酸的转移等操作引起的实验室气溶胶污染等问题，解决了crispr检测技术甚至整个分子诊断技术中一个重要的难题。同时，能够用于crispr分子诊断的直接检测取用，提高核酸检测的普适性和检测效率。

进一步地，通过调整试验参数在应用该防污染检测管进行核酸检测时，都能够得到理想的实验结果，提高检测效率。

进一步地，通过将步骤1)所得待检测试剂管直接保存，存储在冰箱等不失活环境中，基于本发明所述防污染检测管，能够实现crispr分子诊断检测试剂的预存储，待需要进行核酸检测时，只需要将待检测核酸样本加入到该试管(实现试剂预存储)即可，进而能够实现居家核酸检测。

附图说明

图1是本发明所述防污染检测管的结构示意图；

图2是本发明的管帽结构示意图；

图3是本发明的管针结构示意图；

图4是本发明的管帽跟管针通过胶粘连接在一起的示意图；

图5是本发明的扩增内管及其扩增内管密封薄膜的示意图；

图6是本发明的裂解内管及其裂解内管密封薄膜的示意图；

图7是本发明的检测外管的示意图；

图8是本发明所述防污染检测管的试剂添加装配示意图；其中，(a)为检测外管加入冻干crispr试剂的示意图；(b)为扩增内管跟检测外管配合的示意图；(c)为扩增内管加入核酸扩增试剂的示意图；(d)为裂解内管跟扩增内管配合的示意图；(e)为裂解内管加入核酸裂解液的示意图；(f)为所述防污染检测管的整体装配示意图；

图9是本发明所述防污染检测管进行crispr分子诊断的过程示意图；其中，(a)为按压管帽刺破裂解内管密封薄膜的示意图；(b)为扩增内管混合的示意图；(c)为按压管帽刺破扩增内管密封薄膜的示意图；(d)为检测外管混合的示意图；

其中：1-管帽，2-管针，3-扩增内管，4-裂解内管，5-检测外管，6-裂解内管密封薄膜，7-扩增内管密封薄膜。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

下面结合附图对本发明做进一步详细描述：

参见图1可知，本发明提供了一种防污染检测管，所述防污染检测管自上而下依次包括管帽1、管针2、扩增内管3、扩增内管密封薄膜7、裂解内管4、裂解内管密封薄膜6、和检测外管5。

在本发明中，所述防污染检测管包括管帽1，其结构参见图2；包括管针2，其结构参见图3。所述管帽1包括管帽柱体和按压回弹部，管帽柱体上设有外檐结构，外檐结构用于整体装配时将管帽1卡固限位在防污染检测管上，管帽1中部设有用于穿过管针2的孔，管针2穿过该孔、且管针2的尾部与按压回弹部连接。

其中，管帽1和管针2的配合工作原理如下：

管帽1的作用是在外力按压的作用下，能够带动管针2向下依次刺破裂解内管密封薄膜6和扩增内管密封薄膜7，外力消失之后，因其按压回弹部自身带有的弹性，能够恢复之前的状态，带动管针2远离裂解内管密封薄膜6和扩增内管密封薄膜7，完成裂解的核酸样本以及完成扩增的核酸样本将能够沿着密封薄膜(裂解内管密封薄膜6和扩增内管密封薄膜7)的破损处分别进入到扩增内管3和检测外管5，参与到下一步的反应，同时管帽1对扩增内管3起到一个良好的密封作用，保证待检测的样本核酸不会挥发到所述防污染检测管外，避免产生气溶胶污染。

其中，所述管帽1的材质优选为聚烯烃材料；所述管帽1优选的采用注塑工艺制造。所述管针2的材质优选为光敏树脂合材料；所述管针2优选的采用增材制造技术制造。

具体地，在本发明的某一具体实施方式中，管帽1中的按压回弹部为聚烯烃弹力套筒。管针2尾部从聚烯烃弹力套筒内部与聚烯烃弹力套筒底部通过强力胶进行粘合。管帽1跟管针2的连接示意图见图4。

在本发明中，所述防污染检测管还包括扩增内管3，扩增内管3包括自上而下依次连接的第一空心圆柱体上部和第一类锥形下部，第一类锥形下部的收口侧设有开口，且第一类锥形下部的收口侧开口通过扩增内管密封薄膜7进行密封，其结构参见图5。在本发明中，所述防污染检测管还包括检测外管5，所述检测外管5包括自上而下依次接通的第二空心圆柱上体和底部封闭的第二类锥形下体；所述第二类锥形下体的最大内径小于等于第二空心圆柱上体的内径。其结构参见图7。在本发明中，所述检测外管5用来存储crispr试剂，在核酸扩增反应完成之后，所述检测外管5作为crispr核酸检测反应发生的容器。在本发明中，所述扩增内管3的底部提前使用扩增内管密封薄膜7进行密封，扩增内管3的作用是作为核酸扩增反应发生的容器以及核酸扩增试剂的储存器，同时也是作为检测外管5的一种管盖，对检测外管5进行密封，保证扩增完成后的核酸样本不会从检测外管5中挥发到所述防污染检测管外，避免产生气溶胶污染。在本发明中，所述扩增内管3与检测外管5的通过过盈配合进行连接；所述扩增内管3被卡在检测外管5内部，且扩增内管3的高度要高于检测外管5的第二空心圆柱上体的高度，保证实现整个防污染检测管的良好密封，且实现将裂解内管4嵌套在扩增内管3的内部，实现样本进、结果出的一管化使用操作方法。检测外管5对扩增内管3起到一个固定支撑作用。

其中，所述扩增内管3的材质优选为聚甲基丙烯酸甲酯材料；所述扩增内管3优选的采用注塑工艺制造。

其中，所述检测外管5的材质优选为聚丙烯材料；所述检测外管5优选的采用注塑工艺制造。

在本发明中，所述防污染检测管还包括裂解内管4，其结构参见图6，可知所述裂解内管4包括第三空心圆柱体，第三空心圆柱体的底部使用裂解内管密封薄膜6进行密封，裂解内管4的作用是作为核酸裂解反应发生的容器以及核酸裂解试剂的储存器。在本发明中，所述裂解内管4的外径与扩增内管3的内径匹配并产生过盈配合；所述裂解内管4被卡在扩增内管3的内部，且裂解内管4的高度要低于扩增内管3的第一空心圆柱体上部的高度，有助于实现整个防污染检测管的密封(这是因为当裂解内管4的高度高于扩增内管3，那么在密封扩增内管3的基础上还需要实现裂解内管4的密封，这样对整体的密封性会产生不利影响，增加实验室气溶胶污染的可能性)扩增内管3对裂解内管4起到固定支撑作用。

其中，所述裂解内管4的材质优选为聚甲基丙烯酸甲酯材料；所述裂解内管优选的采用注塑工艺制造。

在本发明中，所述裂解内管密封薄膜6和扩增内管密封薄膜7，在没有强大外力干扰的条件下，能够承载一定体积的液体，该体积远远超过实验所需要的体积，该裂解内管密封薄膜6和扩增内管密封薄膜7能够被管针2刺破。

具体地，在本发明的具体实施方式中，所述裂解内管密封薄膜6和扩增内管密封薄膜7的材质优选为聚烯烃材料；所述密封薄膜优选的采用压延法工艺制造。其中，扩增内管密封薄膜7的厚度厚于裂解内管密封薄膜6的厚度，扩增内管密封薄膜7要承受扩增试剂与裂解试剂的体积，而裂解内管密封薄膜6只需要承受裂解试剂的体积，因此根据承受的液体体积不同，扩增内管密封薄膜7的厚度要厚于裂解内管密封薄膜6的厚度。其中，裂解内管密封薄膜6的薄膜厚度为50～100μm，扩增内管密封薄膜7的薄膜厚度为50～100μm。

本发明还提供了利用所述的防污染检测管进行crispr分子诊断的检测方法，包括以下步骤：将crispr试剂冻干加入到所述检测外管5后，将所述扩增内管3固定于所述检测外管5中；将核酸扩增试剂加入到所述扩增内管3后，将所述裂解内管4固定于所述扩增内管3中；将核酸裂解试剂加入到所述裂解内管4后，将所述扩增内管3盖上带有管针2的管盖1，放在零下20摄氏度的冰箱中进行保存；待需要进行crispr分子诊断时，只需要打开管帽1并将待检测的样本加入到所述裂解内管4中，然后盖上所述管帽1，将整个所述防污染检测管放入到所需恒温环境中，进行待检测的样本核酸的核酸裂解反应；该核酸裂解反应完成之后，用手按压管帽1使管针2刺穿裂解内管密封薄膜6，进行一阶段离心，进行核酸扩增反应的程序；待核酸扩增反应结束之后，在用手按压管帽1使管针2刺穿扩增内管密封薄膜7，进行二阶段离心，在进行核酸检测反应的程序；最后通过uv灯照射得到crispr分子诊断的检测结果。

其中，所述一阶段离心和二阶段离心转速均优选为600～6000rpm，更优选为3000rpm，所述一阶段离心和二阶段离心的时间优选为5～20s，更优选为10s；所述两阶段离心的作用，一是将残留在裂解内管4中的完成裂解的核酸样本全部转移到扩增内管3，并将样本核酸与核酸检测试剂混合均匀，二是将残留在扩增内管中的液体尽量全部转移到检测外管，并将扩增的核酸样本与crispr试剂混合均匀。

具体地，在本发明的具体实施方式中，将crispr试剂加入到所述检测外管5后，将所述扩增内管3固定于所述检测外管5中。本发明对所述crispr试剂的具体组成和浓度没有特殊限定，采用本领域常规的crispr试剂即可；在本发明中，所述crispr试剂的体积优选为20微升进行冻干保存；所述crispr试剂优选的加到所述检测外管5底部；所述检测外管加入crispr试剂的示意图如图8(a)所示；在所述检测外管5中固定扩增内管3后的示意图如图8(b)所示。在本发明中，将核酸扩增试剂干粉加入到所述扩增内管3后，将所述裂解内管4固定于所述扩增内管3中。本发明对所述核酸扩增试剂的具体组成和浓度没有特殊限定，采用本领域常规的核酸扩增试剂即可。在本发明中，所述核酸扩增试剂的体积优选为20微升。在本发明中，所述核酸扩增试剂优选的加到所述扩增内管4底部。在本发明中，所述扩增内管4中加入核酸扩增试剂的示意图如图8(c)所示；在所述扩增内管3中固定裂解内管4后的示意图如图8(d)所示。在本发明中，将核酸裂解试剂加入到所述裂解内管4中，盖上所述的扩增内管的管帽1。在本发明中，所述核酸裂解试剂的体积优选为20微升。在本发明中，将所述核酸裂解试剂加到裂解内管4的底部。在本发明中，所述裂解内管4中加入核酸裂解试剂的示意图如图8(e)所示。在本发明中，盖上所述扩增内管的管帽后的示意图如图8(f)所示。

因此，本发明所述防污染检测管可以在零下20摄氏度的冰箱中保存，待使用该防污染检测管进行核酸检测crispr分子诊断时，只需要将该防污染检测管取出，加入待检测的样本核酸，通过简单地按压，离心即可实现crispr分子诊断检测。

具体地，在本发明中的具体实施方式中，将待检测的样本核酸加入到所述扩增内管3中，盖上所述扩增内管3的管帽1。本发明对所述待检测的样本核酸的种类没有特殊限定，任意种类待检测的样本均可。所述待检测的样本核酸的体积为5微升。

具体地，在本发明的具体实施方式中，在盖上所述扩增内管3的管帽1后，首先进行核酸裂解反应，在核酸裂解反应结束后，用力按压管帽1，管帽1带动管针2刺破裂解内管4的裂解内管密封薄膜6，然后取消作用在管帽1上的力，经一阶段离心，进行核酸扩增反应的程序。在本发明中，所述核酸裂解反应的程序优选为36℃～40℃，10～20min，更优选为39℃，10min；所述管帽1按压的时间为2～7s，更优选为5s；所述一阶段离心的转速优选为600～6000rpm，更优选为3000rpm；所述一阶段离心的时间优选为5～20s，更优选为10s。核酸扩增反应结束之后，再次用力按压管帽1，管帽1将带动管针2刺破扩增内管3的扩增内管密封薄膜7，然后取消作用在管帽1上的力，经二阶段离心，进行核酸检测反应的程序。在本发明中，在本发明中，所述核酸扩增反应的程序优选为36℃～40℃，10～20min，更优选为39℃，20min；所述管帽1按压的时间为2～7s，更优选为5s；所述二阶段离心的转速优选为600～6000rpm，更优选为3000rpm；所述二阶段离心的时间优选为5～20s，更优选为10s。所述核酸检测反应的程序为36℃～40℃，15～20min，更优选为39℃，18min。本发明在所述核酸检测反应结束后，即可使用uv灯观察实验结果，实现基于防污染检测管的crispr分子诊断检测方法。

通过本发明所述的防污染检测管和基于其的crispr分子诊断检测方法，能够实现待检测的样本核酸进到结果出的无缝衔接，减少人工操作，节省时间，提高了核酸检测的效率，同时也避免了在核酸扩增到核酸检测这一过程中因为开盖、样本核酸的转移以及闭盖等操作引起的实验室气溶胶污染。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

本实施例提供的防污染检测管的各个部分的材料以及制备方法。

1.管帽1的材质选用优质的聚烯烃材料，将优质的聚烯烃材料投入注塑机，通过注塑机加热熔融，用螺杆加压挤入模具型腔，经过冷却成型的加工而成。

2.管针2的材质选用优质的光敏树脂合材料，将使用增材制造技术加工而成。

3.检测外管5的材质选用优质的聚丙烯材料，将优质的聚丙烯材料投入注塑机，通过注塑机加热熔融，用螺杆加压挤入模具型腔，经过冷却成型的加工而成。

4.扩增内管3的材质选用优质的pmma材料，将优质的pmma材料投入注塑机，通过注塑机加热熔融，用螺杆加压挤入模具型腔，经过冷却成型的加工而成。

5.裂解内管4的材质选用优质的pmma材料，将优质的pmma材料投入注塑机，通过注塑机加热熔融，用螺杆加压挤入模具型腔，经过冷却成型的加工而成。

6.扩增内管密封薄膜7和裂解内管密封薄膜6的材质选用优质的聚烯烃材料，通过压延法工艺制造成型。

7.扩增内管3、裂解内管4使用密封薄膜密封的示意图如图5和图6所示。

8.管针2通过强力胶跟管帽1粘合的示意图如图4所示。

实施例2

本实施例提供的防污染检测管的结构以及每一个步骤的示意图如图8和图9所示，操作步骤如下：首先在检测外管5中加入配置好冻干的crispr试剂，然后在检测外管5中加入扩增内管3。扩增内管3就会被卡在检测外管5的内部，其将会被固定。扩增内管3中加入配置好的rpa核酸扩增试剂，然后在扩增内管3中加入裂解内管4，裂解内管4就会被卡在扩增内管3的内部，其将会被固定。裂解内管4中加入配置好的核酸裂解试剂，然后盖上管盖1，其可以立即使用，也可以放在零下20摄氏度的冰箱中进行密封保存。待需要进行crispr分子诊断核酸检测时，即可取出防污染检测管，加入待检测的样本核酸，然后盖上管帽1随后再将反应管放入到39℃的恒温离心机装置中孵育10min，孵育完成之后。用力按压管帽1，在管帽1的作用下，管针2会向下运动，刺破裂解内管密封薄膜6，按压5s，然后取消用力，由于管帽1本身具有弹性，其将带动管针2远离裂解内管密封薄膜6，然后裂解完成之后的核酸样本就能够转移到扩增内管3中，随后在启动离心机，对整个反应管进行3000rpm，10s的离心处理，在离心力的作用下，经裂解的样本核酸就会经裂解内管密封薄膜6的破损处流入到扩增内管5的内部。进入到扩增试管3的样本核酸将会对核酸扩增试剂起到活化作用，然后利用电机来回正反转，使样本核酸与rpa核酸扩增试剂混合均匀。随后再将防污染检测管继续在39℃的恒温离心机装置中孵育20min，孵育完成之后。用力按压管帽1，在管帽1的作用下，管针2会向下运动，刺破扩增试管密封薄膜7，按压5s，然后取消用力，由于管帽1本身具有弹性，其将带动管针2远离扩增试管密封薄膜7，然后扩增完成之后的核酸样本就能够转移到检测外管5中，随后在启动离心机，对整个反应管进行3000rpm，10s的离心处理，在离心力的作用下，经扩增的样本核酸就会经扩增试管密封薄膜7的破损处流入到检测外管5的内部，与crispr试剂相混合。最后在恒温39℃下孵育18min，在uv灯照射下即可观察实验结果。

现以hbv为例，描述本实施例中crispr防污染耗材的现场工作流程。

1.如图8(a)所示，在检测外管5的底部加入配置好的冻干crispr反应试剂。

2.如图8(b)所示，将扩增内管3嵌入到检测外管5中，扩增内管3即被固定。

3.如图8(c)所示，在扩增内管3的底部加入配置好的rpa核酸扩增反应试剂。

4.如图8(d)所示，将裂解内管4嵌入到扩增内管3中，裂解内管4即被固定。

5.如图8(f)所示，在裂解内管4的底部加入配置好的核酸裂解液。

6.将待扩增的样本核酸加入到裂解内管4的底部。

7.如图8(e)所述，盖上管帽1，震荡摇匀，离心，然后在将整个扩增试管放入到一个恒温装置中孵育10min，实现样本核酸的裂解。

8.如图9(a)所述，用力按下管帽1，管帽1被压缩，带动管针2向下运动，继而裂解内管密封薄膜6被刺破。

9.如图9(b)所述，松开管帽1，管帽1将会恢复到之前的状态，带动管针2向上运动，远离裂解内管密封薄膜6，恢复到之前的状态。

10.如图9(b)所述，经过裂解的样本核酸将会沿着裂解内管密封薄膜6的破损处流到扩增内管3中。

11.将样本核酸与核酸扩增试剂混合均匀，然后在39℃的恒温环境中孵育20min，实现样本核酸的扩增。

12.如图9(c)所述，用力按下管帽1，管帽1被压缩，带动管针2向下运动，继而密封薄膜7被刺破。

13.如图9(d)所述，松开管帽1，管帽1将会恢复到之前的状态，带动管针2向上运动，远离扩增内管密封薄膜7，恢复到之前的状态。

14.如图9(d)所述，经过裂解的样本核酸将会沿着扩增内管密封薄膜7的破损处流到检测外管中，扩增的核酸溶液也将会对crispr试剂起到一个良好的活化作用。

15.震荡摇匀，使样本核酸与crispr试剂混合均匀，然后在39℃的恒温环境中孵育18min，然后即可观察荧光，方便，快捷的实现样本核酸的检测。

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。