一种在间充质干细胞中稳定表达可分泌人胰岛素的方法

本发明属于组织再生工程领域，具体涉及一种在间充质干细胞中稳定表达可分泌人胰岛素的方法。

背景技术：

组织再生工程以及干细胞和细胞治疗是当代生物医学领域发展起来一门新型学科，为许多重大疾病包括癌症，心脏病，糖尿病，神经退化等疾病的治疗带来希望。利用胚胎干细胞或者间充质干细胞分化成具有分泌胰岛素(insulin)功能的胰岛细胞或者类胰岛细胞是组织再生工程和细胞治疗的一个重要研究方向，也为细胞治疗糖尿病带来希望。虽然关于这方面工作开展了几十年，但是进展比较缓慢，原因是通过干细胞分化途径获得胰岛细胞，结果很不稳定，实验重复性差。另一方面，利用干细胞获得胰岛细胞，难以获得高产量，成本昂贵。

间充质干细胞包括骨髓间充质，脐带间充质，其它器官的间充质干细胞，分布在身体各个部位，利用患者间充质干细胞进行细胞治疗具有免疫排斥低的优点。因此间充质干细胞是细胞治疗的较理想的生物材料。利用间充质干细胞直接表达胰岛素(insulin)以及分泌胰岛素(insulin)是细胞治疗糖尿病途径之一。由于胰岛素(insulin)一般只在胰岛beta-细胞中表达，自然状态下，在其它细胞中一般不表达，强迫表达难度大，特别是在间充质干细胞中表达难度极高，即使表达也不稳定。虽然文献报道表明，在间充质干细胞中可以成功表达胰岛素(1，2)，但是，本实验室初期按照所报道的方法表达人胰岛素，并未获得成功。因此，非常有必要开发一种全新的方法在间充质干细胞中稳定表达人胰岛素，而且表达的胰岛素是可以分泌到胞外的，这是细胞治疗糖尿病的所必需的，也是极为关键的步骤。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题为：针对人胰岛素(insulin)在间充质干细胞难表达，不分泌，重复性差，不稳定的问题，本发明提供一种可重复的在间充质干细胞中稳定表达并分泌的胰岛素的方法。

本发明的技术方案为：一种在间充质干细胞中稳定表达可分泌人胰岛素的方法，包括如下步骤：

(1)构建mcherry-2a-insulin-his融合基因慢病毒表达载体，

(2)将构建的mcherry-2a-insulin-his融合基因慢病毒表达载体在人间充质干细胞中进行表达，即可得到分泌到胞外的人胰岛素。

进一步地，构建mcherry-2a-insulin-his融合基因慢病毒表达载体的方法为：以慢病毒表达载体plv[exp]-neo-tre3g>hins[nm_001185097.1]/ek/10xhis为模板，以2a-insulinf和his-insulinr为引物进行pcr扩增，将扩增产物与慢病毒表达载体plv-ef1α-mcherry-puro双酶切后连接，获得表达mcherry-2a-insulin-his融合基因的慢病毒载体plv-ef1α-mcherry-2a-insulin-his-puro，所述2a-insulinf的核苷酸序列如seqidno.1所示，his-insulinr的核苷酸序列如seqidno.2所示。

进一步地，所述pcr扩增的反应体系为：

1μlplv[exp]-neo-tre3g>hins[nm_001185097.1]/ek/10xhis载体，浓度1ng/μl

1μl2a-insulinf引物，浓度25μm

1μlhis-insulinr引物，浓度25μm

25μl2xpcrmastermix

22μlddh2o

反应体系共50μl；

所述pcr扩增的扩增程序为：

第一步：95℃3min

第二步：95℃1min；55℃20sec；72℃1min，共35个循环

第三步:72℃10min。

进一步地，将构建的mcherry-2a-insulin-his融合基因慢病毒表达载体在人间充质干细胞中进行表达的方法为：

(a)将慢病毒载体plv-ef1α-mcherry-2a-insulin-his-puro和病毒包装辅助载体ph1和ph2共转染293t细胞；

(b)培养转染后的293t细胞，收集含病毒的培养基，离心收集含病毒上清液；

(c)培养人间充质干细胞，将步骤(b)得到的上清液加入到人间充质干细胞中进行感染，继续培养可得到分泌到胞外的人胰岛素。

进一步地，将上清液加入到人间充质干细胞中进行感染的同时，需要添加polybrene并控制polybrene终浓度为10μg/ml。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明方法利用自切割多肽2a基因将mcherry红色荧光基因与人胰岛素基因连接成融合基因克隆在慢病毒表达载体上，当转染细胞后，筛选获得稳定表达细胞系，细胞表达融合多肽并在自切割多肽2a的作用下，人胰岛素与mcherry红色荧光蛋白分离，人胰岛素可分泌至胞外。这一发明方法解决了当前在间充质干细胞中表达人胰岛素的困境，具有重大现实意义和潜在的医学应用价值。此外，由于分泌信号肽位于胰岛素n-端，因此，在胰岛素c-端加上his标签，既不影响胰岛蛋白分泌，又方便利用琼脂糖镍柱纯化胰岛素；比如，在细胞体外可利用琼脂糖镍柱富集分泌的胰岛素，可起到一举两得的效果。

附图说明

图1.plv-mcherry-2a-insulin-his质粒构建示意图。①.基因扩增方法(pcr)合成2a-insulin-his融合基因，②.慢病表达载体plv-mcherry-puro的制备，③2a-insulin-his融合基因克隆在mcherry下游形成mcherry-2a-insulin-his融合基因；

图2.利用人间充质干细胞表达胰岛素(insulin)的方法示意图；

①plv-mcherry-2a-insulin-his表达载体转染人间充质干细胞，②人间充质干细胞表达mcherry-2a-insulin-his融合蛋白，③用puromycins筛选稳定表达细胞系，④mcherry-2a-insulin-his融合蛋白自切割成mcherry,2a和带his标签的胰岛素蛋白(insulin-his)，⑤带his标签的胰岛素蛋白(insulin-his)分泌至胞外。

图3.表达mcherry-2a-insulin融合蛋白的人间充质干细胞稳定细胞系；

图4.人胰岛素在间充质干细胞中表达的检测，免疫印迹检测表明人胰岛素在间充质干细胞中成功表达；

图5.人胰岛素在间充质干细胞表达后能分泌至胞外的检测，elisa检测细胞裂解液和培养培养基中人胰岛素的含量。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。

本方法主要包括三个主要阶段的工作：

1.基于自切割多肽2a技术构建包含2a的mcherry-2a-insulin-his融合基因慢病毒表达载体。

2.mcherry-2a-insulin-his融合基因慢病毒表达载体转染和表达该融合基因的间充质稳定细胞系的筛选。

3.表达该融合基因的间充质干细胞稳定细胞系的鉴定。

下面阐述每个阶段的工作所包含的步骤

1.基于自切割多肽2a技术构建包含2a的mcherry-2a-insulin-his融合基因慢病毒表达载体。

1)搜索文献获得自切割肽2a序列如下：

ggaagcggagctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtggaggagaaccctggacct

2)利用ncbi基因文库搜索获得人胰岛素(insulin)基因序列如下：

atggccctgtggatgcgcctcctgcccctgctggcgctgctggccctctggggacctgacccagccgcagcctttgtgaaccaacacctgtgcggctcacacctggtggaagctctctacctagtgtgcggggaacgaggcttcttctacacacccaagacccgccgggaggcagaggacctgcaggtggggcaggtggagctgggcgggggccctggtgcaggcagcctgcagcccttggccctggaggggtccctgcagaagcgtggcattgtggaacaatgctgtaccagcatctgctccctctaccagctggagaactactgcaac

3)根据plv-ef1α-mcherry-puro慢病毒表达载体(图1)多克隆位点和mcherry(一种红色荧光蛋白)dna序列设计一对克隆mcherry-2a-insulin-his的引物。引物序列如下：

2a-insulinf：

cgcggaattcggaagcggagctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtggaggagaaccctggacctatggccctgtggatgcgcctc

his-insulinr：

gcgcggatccctagtggtggtgatgagtgtg

4)利用克隆了insulin基因的慢病毒表达载体plv[exp]-neo-tre3g>hins[nm_001185097.1]/ek/10xhis(购自vectorbuilderinc)为模板和上述3)中的引物完成聚合酶链式反应(pcr)，反应体系如下：

1μlplv[exp]-neo-tre3g>hins[nm_001185097.1]/ek/10xhis载体(浓度1ng/μl)

1μl2a-insulinf引物(25μm)

1μlhis-insulinr引物(25μm)

25μl2xpcrmastermix

22μlddh2o(去离子蒸馏水)

反应体系共50μl；

在pcr仪器中按照以下热循环完成pcr反应

第一步：95℃3min

第二步：95℃1min；55℃20sec；72℃1min，共35个循环

第三步:72℃10min。

5)因反向引物his-insulinr包含his标签，上述第4)步骤中通过pcr获得mcherry-2a-insulin-his融合基因，将pcr产物用dna纯化试剂盒纯化。

6)将慢病毒表达载体plv-ef1α-mcherry-puro(购自inovogen公司)和pcr产物用ecori和bamhi完成酶切和纯化。

7)按照分子克隆的标准方法将pcr产物克隆于慢病毒表达载体(plv-ef1α-mcherry-puro)mcherry下游。获得表达mcherry-2a-insulin-his融合基因的慢病毒载体plv-ef1α-mcherry-2a-insulin-his-puro(图1)。

2.mcherry-2a-insulin-his融合基因慢病毒表达载体转染和表达该融合基因的间充质稳定细胞系的筛选。

1)大量提取表达mcherry-2a-insulin-his融合基因的慢病毒载体plv-ef1α-mcherry-2a-insulin-his-puro.

2)将慢病毒载体plv-ef1α-mcherry-2a-insulin-his--puro和病毒包装辅助载体ph1和ph2(购自inovogen公司)共转染293t细胞。

3)培养转染后的293t细胞，48小时后，收集含病毒的培养基，移至离心机以8000rpm离心5min，用0.45μm规格的滤器过滤上清。

4)同时培养人间充质干细胞(购自赛业公司)于12-孔板中，12小时后更换培养基，将过滤后的含病毒的培养液1ml加入12-孔板中，同时加polybrene，终浓度为10μg/ml。

5)培养间充质干细胞48小时使病毒侵染间充质干细胞。

6)用嘌呤霉筛选具有抗性的的细胞，同时利用普通荧光显微镜观察是间充质干细胞为红色，若绝大多数细胞为红色荧光，说明mcherry-2a-insulin-his融合蛋白成功表达(图2)。

3.表达该融合蛋白的间充质干细胞稳定细胞系的功能鉴定

1)利用荧光显微镜鉴定表达该融合蛋白的间充质干细胞稳定细胞系：细胞通过10次以上次传代，将间充质干细胞置于荧光显微镜下成像。间充质干细胞仍表现出红色荧光，说明间充质干细胞能持续表达mcherry-2a-insulin融合蛋白(图3)。

2)westernblot鉴定间充质干细胞表达的该融合蛋白是否已发生自切割：将红色荧光间充质干细胞收集，用细胞裂解液裂解,煮沸10min后，样品用于westernblot分析，检测抗体为his标签抗体(注明：在克隆基因的过程中，我们将his标签加到insulin基因末尾，见图1和图2)、insulin抗体，gapdh抗体。如图4所示，不论是his抗体还是insulin抗体都能检测到胰岛素(insulin)的表达，而且分子量大小与独立的insulin分子相同,约14kd。说明融合蛋白在2a的作用下发生了自切割(图2)。但是未转染慢病毒载体的对照间充质干细胞，检测不到任何insulin信号。

3)elisa方法鉴定间充质干细胞表达的insulin是否已能够分泌至胞外：由于胰岛素(insulin)必需分泌到胞外才有临床医学价值。我们发明的目的是制备可以向胞外分泌insulin的间充质干细胞。由于insulin分泌在胞外，浓度被稀释，westernblot不易检测到，所以我采用elisa方法(又称酶联免疫方法)检测insulin。收集间充质干细胞和胞外的培养液样品，利用insulinelisa试剂盒(碧云天公司出品)完成酶链反应。利用酶标仪测定胞液和培养液中的insulin含量。结果如图5所示，胞内胞外均可检测到insulin的信号，说明间充质干细胞表达的insulin可以分泌至胞外。而对照细胞没有检测到明显信号。这一结果说明利用我们发明的方法可以制备可分泌insulin的人间充质干细胞，具有潜在的应用价值，我们的发明也为干细胞治疗糖尿病的生物或临床研究的提供技术支持，推动该领域快步向前发展。

序列表

<110>武汉科技大学

<120>一种在间充质干细胞中稳定表达可分泌人胰岛素的方法

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>97

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

cgcggaattcggaagcggagctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtgga60

ggagaaccctggacctatggccctgtggatgcgcctc97

<210>2

<211>31

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gcgcggatccctagtggtggtgatgagtgtg31