一种色烯磺酰腙衍生物荧光探针及其制备方法和应用

本发明属于有机合成领域，具体涉及色烯磺酰腙衍生物荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术：

次氯酸(hclo)/次氯酸盐(clo^-)在日常生活中广泛用作消毒剂。同时，clo^-也是一种重要的生物活性氧（ros），参与众多生理过程。但其浓度超过正常范围，会引发包括癌症在内的多种疾病。内质网是一类重要的细胞器，其正常生理功能在细胞受到化学毒性物质刺激时会受到损伤，即所谓的内质网应激。内质网应激过强或过久则可引起细胞凋亡。内质网是细胞内产生ros的主要场所之一。因此，内质网中clo^-的检测分析具有非常重要的研究价值，有助于理解内质网诱导的细胞凋亡过程。

荧光探针技术具有灵敏度高、操作简单、能够实时在线检测等诸多优点，被认为是检测clo^-的理想手段。近年来，针对clo^-的荧光探针取得了一定进展，其设计策略通常是以甲氧基苯酚、硫族化合物、酰肼、羟胺或c=c等为识别基团，利用clo^-的强氧化性对识别基团进行氧化而引起探针的荧光变化，实现检测的目的。但多数探针单纯依赖单一发射波长处荧光强度的变化实现检测，容易受到仪器效率和探针浓度等环境因素的影响。而比率荧光探针以两个不同发射峰强度的比值为信号参考，可有效消除上述干扰。而且，对内质网靶向定位的比率型clo^-荧光探针的报道并不多。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的问题，考虑到2h-苯并[h]色烯-3-甲醛具有优异的光学性能，而磺酰腙可以作为clo^-的识别单元，本发明以色烯磺酰腙衍生物为基础，合成了一种高灵敏度、高选择性的比率型clo^-荧光探针。该探针具有内质网靶向功能，可用于细胞内质网中clo^-浓度的检测。

本发明的主要目的在于提供一种可用于细胞内质网中针对clo^-的灵敏度高、选择性好的比率型色烯磺酰腙衍生物荧光探针；另一目的是提供该荧光探针的制备方法和应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种色烯磺酰腙衍生物荧光探针，所述色烯磺酰腙衍生物具有如下结构式：

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本发明还提供了一种色烯磺酰腙衍生物荧光探针的制备方法，具体制备方法如下：

s1：将2h-苯[h]色烯-3-甲醛与对甲苯磺酰肼溶解于乙醇中；

s2：回流搅拌12h；

s3：冷却至室温后，过滤，乙醇洗涤，干燥，得到黄色片状晶体，即为所述的色烯磺酰腙衍生物荧光探针。

更进一步地，步骤s1和s3所述乙醇为95%乙醇或无水乙醇。

更进一步地，步骤s1中加入的2h-苯[h]色烯-3-甲醛与对甲苯磺酰肼的摩尔比为1:1。

更进一步地，具体制备方法为，将2h-苯[h]色烯-3-甲醛(210mg,1mmol)与对甲苯磺酰肼(190mg,1mmol)的混合物加入到10ml的乙醇中，回流搅拌12h。冷却至室温后，过滤，乙醇洗涤，干燥，得到黄色片状晶体，即为所述的色烯磺酰腙衍生物荧光探针。

本发明还提供了上述色烯磺酰腙衍生物荧光探针的用途，即在作为clo^-荧光探针方面的应用，特别是在作为检测细胞内质网clo^-的荧光探针中的应用。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：

本发明通过缩合反应制备色烯磺酰腙衍生物荧光探针，原料易得，合成和后处理方法简单。在多种常见阴离子和活性氧中，对clo^-表现出较高的比率荧光识别性能。探针能够靶向细胞内质网，具有广泛的潜在应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例1制得的色烯磺酰腙衍生物荧光探针的¹hnmr谱图；

图2为本发明实施例1制得的色烯磺酰腙衍生物荧光探针的¹³cnmr谱图；

图3为本发明实施例1制得的色烯磺酰腙衍生物荧光探针的质谱谱图；

图4为本发明实施例1制得的色烯磺酰腙衍生物荧光探针的晶体结构图；

图5为本发明实施例1制得的色烯磺酰腙衍生物荧光探针(1×10^-5mol／l)的dmso/pbs(2/8,v/v,10mm,ph=7.0)溶液分别加入5×10^-4mol／l阴离子（hso3^-、so4^2-、ppi、hso4^-、po4^3-、h2po4^-、cn^-、clo4^-、hpo4^2-、i^-、br^-、f^-、s^2-、cl^-、oac^-、so3^2-)和活性氧（clo^-、h2o2、¹o2、·oh、no和o2⁻）的荧光光谱图（激发波长为400nm），插图表示365nm紫外灯下探针和探针+clo^-的溶液颜色变化；

图6a为本发明实施例1制得的色烯磺酰腙衍生物荧光探针(1×10^-5mol／l)的dmso/pbs(2/8,v/v,10mm,ph=7.0)溶液滴定不同浓度clo⁻的荧光光谱图（激发波长为400nm）。图6b表示525nm处和475nm处荧光强度比值随clo^-浓度的线性变化趋势图。

图7为在hela细胞中，色烯磺酰腙衍生物荧光探针与商用内质网定位染料ertrackerred共染荧光成像图；hela细胞用1×10^-5mol／l荧光探针和ertrackerred共同培育30分钟后，使用olympusfv500-ix70激光共聚焦显微镜进行荧光成像。

其中：a为蓝色通道荧光成像图；b为红色通道荧光成像图；c为蓝色通道和红色通道叠加后的图片；d为明场图；e为蓝色通道、红色通道和明场叠加后的图片；f为蓝色通道和红色通道强度分布叠加图。

图8为在hela细胞中，色烯磺酰腙衍生物荧光探针与clo⁻的荧光成像图；hela细胞用1×10^-5mol／l荧光探针培育30分钟后加入5×10^-4mol/lclo⁻，继续培育30分钟后，使用olympusfv500-ix70激光共聚焦显微镜进行荧光成像。

其中：a为上述荧光探针蓝色通道荧光成像图；b为上述荧光探针绿色通道荧光成像图；c为上述荧光探针明场图；d为上述荧光探针明场图和荧光图叠加后的图片；e为上述荧光探针+clo⁻蓝色通道荧光成像图；f为上述荧光探针+clo⁻绿色通道荧光成像图；g为上述荧光探针+clo⁻明场下的成像图；h为上述荧光探针+clo⁻明场图和荧光图叠加后的图片。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明，但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。本发明实施例采用的试剂和原料为常规市场购买得到。

实施例1

本实施例色烯磺酰腙衍生物荧光探针的反应路线如下：

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本实施例色烯磺酰腙衍生物荧光探针的制备方法如下：

将2h-苯[h]色烯-3-甲醛(210mg,1mmol)与对甲苯磺酰肼(190mg,1mmol)的混合物加入到10ml的乙醇中，回流搅拌12小时。冷却至室温后，过滤，乙醇洗涤，干燥，得到黄色片状晶体，产率86%。采用核磁共振仪对制得的色烯磺酰腙衍生物进行核磁共振分析，结果如下：

¹hnmr(400mhz,d6-dmso)δ(ppm):11.5(1h,s,nh),8.13-8.15(1h,s,ch=n),7.76-7.86(5h,m)/7.68(1h,s)/7.53-7.56(1h,s)/7.39-7.45(3h,s)forar-h,7.12-7.14(1h,s,ch),4.98(2h,s,ch2),2.39(3h,s,ch3).具体核磁共振氢图谱见图1；

¹³cnmr(400mhz,d6-dmso)δ(ppm):153.09,146.32,144.00,136.37,131.32,130.15,129.50,129.00,127.69,127.32,125.43,124.62,122.16,117.78,115.14,63.94,21.50.具体核磁共振碳图谱见图2；

质谱esi-ms:m/z=379.1079for[m+h]⁺。具体质谱谱图见图3。

单晶x射线衍射确定了探针的晶体结构，见图4。

实施例2

色烯磺酰腙衍生物对clo^-的光学性质测定

将上述实施例1制得的色烯磺酰腙衍生物作为荧光探针在dmso/pbs(2/8,v/v,10mm,ph=7.0)中配制成摩尔浓度为1×10^-5mol／l的溶液，分别在含摩尔浓度为5×10^-4mol/l的阴离子（hso3^-、so4^2-、ppi、hso4^-、po4^3-、h2po4^-、cn^-、clo4^-、hpo4^2-、i^-、br^-、f^-、s^2-、cl^-、oac^-、so3^2-)和活性氧（clo^-、h2o2、¹o2、·oh、no和o2⁻）的溶液中加入等量的上述荧光探针溶液，采用荧光光谱仪进行分析（激发波长为400nm），所得荧光光谱图见图5。通过图5可以看出，只有clo^-能够引起探针发射峰增强并红移，而其它离子无变化，表明本发明制得的色烯磺酰腙衍生物作为探针只对clo^-具有明显响应。插图表示365nm紫外灯下探针和探针+clo^-的溶液颜色变化，可以看出加入clo^-后探针溶液从蓝色变为绿色，说明探针可用于clo^-的快速鉴别。

通过图6的滴定光谱计算可以得到clo⁻检出限为1.01×10^-8mol／l，荧光强度比值f525/f475的线性检测范围为3.0×10^-6-8.0×10^-6mol／l。因此本发明制得的色烯磺酰腙衍生物可用于clo^-的荧光定量检测。

实施例3

色烯磺酰腙衍生物荧光探针在细胞内clo^-的检测实验

hela细胞用1×10^-5mol／l的上述实施例1制得的色烯磺酰腙衍生物荧光探针和商用溶酶体定位染料ertrackerred在37℃下共同培育30分钟，获得在hela细胞的荧光成像图，具体如图7所示，其中：a为蓝色通道荧光成像图；b为红色通道荧光成像图；c为蓝色通道和红色通道叠加后的图片；d为明场图；e为蓝色通道、红色通道和明场叠加后的图片；f为蓝色通道和红色通道强度分布叠加图。hela细胞中探针蓝色通道荧光和ertrackerred红色通道荧光基本吻合，重叠系数为0.88。故本发明实施例1制得的色烯磺酰腙衍生物荧光探针可以靶向细胞内质网。

hela细胞用1×10^-5mol／l的上述实施例1制得的色烯磺酰腙衍生物荧光探针在37℃下培育30分钟，加入clo⁻（5×10^-4mol／l）后再培育30分钟，获得在hela细胞的荧光成像图，具体如图8所示，其中：a为上述荧光探针蓝色通道荧光成像图；b为上述荧光探针绿色通道荧光成像图；c为上述荧光探针明场图；d为上述荧光探针明场图和荧光图叠加后的图片；e为上述荧光探针+clo⁻蓝色通道荧光成像图；f为上述荧光探针+clo⁻绿色通道荧光成像图；g为上述荧光探针+clo⁻明场下的成像图；h为上述荧光探针+clo⁻明场图和荧光图叠加后的图片。hela细胞中加入色烯磺酰腙衍生物蓝色通道强荧光，绿色通道弱荧光；而再加入clo⁻后蓝色通道荧光明显减弱，绿色通道荧光明显增强。故本发明实施例1制得的色烯磺酰腙衍生物可用于细胞内质网中clo⁻的比率荧光检测。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，其保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内，本发明的保护范围以权利要求书为准。