从甜菊糖的一次结晶母液中二次结晶得到高纯度甜菊苷并富集莱鲍迪苷C

本发明涉及天然高倍甜味剂的分离领域，具体而言，涉及从甜菊糖一次结晶母液中通过第二次结晶得到高纯度甜菊苷并富集莱鲍迪苷c的方法。

背景技术：

甜菊糖(steviolglycosides,sgs)是从天然植物甜叶菊中提取得到的天然高倍甜味剂，很多国家已经批准甜菊糖作为食品添加剂，其甜度为蔗糖的200～300倍，而热量仅为蔗糖的1/300。天然的甜菊糖是一种混合物，由几种糖苷化合物组成，甜菊糖苷都含有相同的疏水性甜菊糖苷单元，不同之处在于c13位和c18位上的糖基取代基不同，主要成分为莱鲍迪苷a(rebaudiosidea,ra)、甜菊苷(stevioside,st)、莱鲍迪苷c(rebaudiosidec,rc)。天然甜叶菊中三者共占约90％以上。

工业生产甜菊糖一般都需要经过水提、絮凝、醇沉、柱层析、结晶等工序。结晶剩余的废母液中一般含有ra、st、rc、rf(莱鲍迪苷f)、杜克苷a(da)、甜茶苷以及rb(莱鲍迪苷b)等多种糖苷，其中st含量最高。

一次结晶母液中除了含有未结晶的莱鲍迪苷a，还含有大量的st，其口味稍差一点。但是由于st与ra在化学结构上只相差一个葡萄糖，可以通过酶嫁接一个葡萄糖合成ra，也可嫁接两个葡萄糖合成高价值得rd。此外，由于st也具有降血压等治疗效果。因此，从甜菊糖结晶母液中回收并获得较高纯度st具有重要的作用。目前，st的分离、纯化技术难度很大，导致产品售价很高。通过柱层析(硅胶柱)方法可以拿到高纯度st，成本较高，目前通过重结晶得到高纯度st还未见其报道。例如，98％纯度的20mgst售价可达260元。

rc可作为甜味增强剂来使用,从而可大大减少蔗糖的使用量,此外研究表明rc还具有降血压、降血脂、抗过敏及预防心血管疾病能保健功能。甜菊糖中rc含量非常低，只占甜叶菊糖的0.2％(王德骥.再论甜菊糖苷的甜度、甜味和苦涩后味的成因机理[j].食品工业科技,2010,31(05):417-420.)。所以，采用传统方法无法得到高纯度的rc。目前获得的高纯度rc都来自于制备型hplc或者纳滤膜技术分离得到。目前市场上高纯度rc的价格很高，例如99％纯度的20mgrc可以售价达2600元。

甜菊糖一次结晶母液的纯化方法主要可分为两种：结晶法和色谱法。结晶法成本较低，适合大批量规模化生产。色谱法产品纯度要高于结晶法，使用模拟移动床可实现自动化、连续化生产，但是其成本太高。如果能采用结晶方式得到高纯度的st那么将是我们所最期盼的方法。

关于莱鲍迪苷a的纯化，近年来获得较大进展。例如本技术发明人通过以一定浓度甲醇水作为结晶溶剂，利用结晶法纯化甜菊糖粗原料。一次结晶后的产品中，ra的纯度可以达到99％以上，且其收率在80％以上。剩下大量的st等物质就存在于该一次结晶母液中。目前国内外对甜菊糖结晶母液的有效回收方法报道较少，主要还是通过溶剂结晶法和色谱法。例如乔长晟等人(乔长晟，王彦飞，李利宁.一种回收甜菊糖母液糖的新方法[p].2012-10-10.)利用异丙醇、甲醇和乙醇三者的混合溶剂，进行结晶操作，所获得的结晶中总糖苷含量最高90％以上，回收率在45％～75％之间，主要作用在于提高母液中总糖苷的含量，几乎没有改变原来母液中ra与st的比例。liuyaxian等人(liuy,huax,wangm,etal.purificationofthemotherliquorsugarfromindustrialsteviaproductionthroughone-stepadsorptionbynon-polarmacroporousresin[j].foodchemistry,2019,274:337～344.)利用大孔树脂材料去除甜菊糖母液中黄酮、多酚类物质，但基本也没有改变母液中ra和st等物质的含量。

综上所述，通过一次结晶得到高纯度的ra后对于结晶母液的st、rc回收利用尤为重要。由于甜菊糖一次结晶母液中ra含量明显低于st的含量(ra含量约为st的含量1/2～2/3)，可以考虑通过二次结晶的方式得到高纯度的st，并同时富集rc，为制备高纯度rc提供重要的原料。

本发明的原理是根据甜菊糖苷以及其余物质在不同结晶溶剂中的特性以及溶解度差异进行纯化。甜菊糖苷st在结构上相比ra和rc缺少一个葡萄糖基单元，因此极性不同于ra和rc，使用不同结晶溶剂后，有利于打破一次结晶时各物质的溶解度平衡，导致ra和st的溶解度发生变化，但变化程度不一样。通过控制结晶溶剂的种类与比例，使st的析出量明显多于ra，且rc不析出，从而实现选择性地回收一次结晶母液中的st并同时富集rc。

技术实现要素：

本发明的目的就在于甜菊糖一次结晶后的母液糖在不同结晶溶剂中各成分溶解度不同在二次搅拌析晶后，过滤得到高纯度的甜菊苷(st)，且不析出rc，rc留在二次结晶溶剂中得到了富集。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

甜菊糖母液糖所用的二次结晶溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、水、氯仿、乙酸乙酯一种或两种以上混合使用的溶剂，结晶温度10℃～30℃，结晶静置时间8h～24h，结晶混合溶剂比例v:v＝1：1～1：8。

本项目特点简述如下

(1)利用较低价值的一次结晶母液为原料。进一步有效回收高价值甜菊苷(st)，其纯度从原料母液中的约66％提高到95％以上，回收率可达50％以上。

(2)二次结晶过程简单高效，方便快捷，耗能低。

(3)在二次结晶得到高纯度st的同时去除大部分黄酮、多酚类苦味杂质，使回收获得的st更具经济价值。

(4)二次结晶得到高纯度st的同时，二次结晶液相中的rc成分获得富集，进一步制备更高纯度的高价值rc提供了原材料。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定。

高效液相色谱分析条件：检测波长210nm，流动相是68％乙腈/32％水(磷酸缓冲液ph＝2.60)，流速1ml/min，进样体积20μl；柱温40℃。hplc分析使用的是c18柱(waters,massachusetts,usa)，检测器为spd-m20apdadetector(shimadzu,kyoto,japan)，柱温箱hct-360lc(hengaotech&dev,tianjin,china)，工作站为class-vp(shimadzu,kyoto,japan)。

附图1为本发明实施例提供的操作流程图。

附图2为本发明实施例提供的一次结晶母液的hplc图。

附图3为本发明实施例提供的结晶溶剂种类对st析出物纯度和收率的影响。

附图4为本发明实施例提供的结晶溶剂温度对st析出物纯度和收率的影响。

附图5为本发明实施例提供的结晶溶剂时间对st析出物纯度和收率的影响。

附图6为本发明实施例提供的结晶溶剂比例对st析出物纯度和收率的影响。

附图7为本发明实施例提供的优化后结晶溶剂对st析出物的hplc图。

附图8为本发明实施例提供的二次结晶后母液对rc富集的hplc图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。下面对本发明实施例提供的一次结晶母液糖二次结晶得到高纯度st的方法进行举例说明。

实施例1

用移液管精密量取100ml一次结晶母液，100℃烘干至恒重，得固体。取2g固体备用，配置90％浓度甲醇和乙醇水溶液作为结晶溶剂，以固液比1:8(g/ml)放入烧杯中搅拌30分钟，静置25℃下自然结晶8小时，过滤固体用纯甲醇冲洗烘干称重，根据国标方法取样进行hplc分析。

实施例2～21

其他不同条件下结晶应用于回收高纯度st的实施例2～21见下表。表格里未提及的参数条件与实施例1相同。

综上所述，本发明提供了从工业甜菊糖一次结晶母液回收甜菊苷st的方法。利用添加异丙醇的结晶溶剂对甜菊糖中各物质的溶解度影响，选择性回收st，该方法简单高效，方便快捷且去除一部分黄酮类苦味杂质，为后续制备高纯度莱鲍迪苷c提供了原材料。

以上所述仅为本发明的优选实施方式而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。