低共溶溶剂（DES）用于从甜叶菊提取和分离甜菊糖的方法

本发明涉及天然活性成分的分离领域，具体而言，低共溶溶剂的制备并应用于提取甜菊糖。

背景技术：

甜菊糖是从天然植物甜叶菊中提取得到的天然高倍甜味剂，很多国家已经批准甜菊糖作为食品添加剂，其甜度是蔗糖的300倍，但热量仅为蔗糖的1/300。目前作为第三代糖替代蔗糖，已被国际知名公司率先使用作为甜度剂。天然的甜菊糖是一种混合物，由几种糖苷化合物组成，甜菊糖苷都含有相同的疏水性甜菊糖苷单元，不同之处在于c13位和c18位上的糖基取代基不同，主要成分为莱鲍迪苷a(rebaudiosidea,ra)、甜菊苷(stevioside,st)、莱鲍迪苷c(rebaudiosidec,rc)。天然甜叶菊中三者共占90％以上。其中ra甜度最高，甜味也与蔗糖相近，是一种高甜度、低热量、易溶解、耐热、稳定的新型天然甜味剂，其含量或纯度也是衡量甜菊糖质量的主要指标。长期食用对肥胖、高血压、高血糖等疾病具有保健治疗作用。除此之外，甜菊糖制品中还含有多种氨基酸和多种微量元素，故甜菊糖不仅可以作为食品甜味剂，还可以作为营养源食物或辅助治疗类药物。

由于甜菊糖结构复杂，活性位点多且容易失活、稳定性差，在工业生产中难以实现化学全合成，所以从甜叶菊中提取是获取甜菊糖的主要途径。目前提取甜菊糖的工业化方法首先是从甜叶菊原料中提取出甜菊糖与其他物质的混合液，再采用各具特点的不同分离方法和设备去除其他物质，从而获得高纯度的甜菊糖产品。提取混合液中的其他物质统称为杂质，至少包括蛋白质、有机酸、岛苷、叶绿素、无机盐等杂质，这些杂质的含量是糖苷含量的5-7倍，必须对其进行纯化处理，可见其成分很复杂。为了除去这些杂质，工业生产中通常采用多次使用有机溶剂沉淀、液液萃取以及柱层析的工艺流程，如附图1所示。该图所示工艺仅是整个高纯度的甜菊糖产品(高纯度ra)生产过程中的提取工艺流程部分，该提取基本目的是获得一定纯度的甜菊糖粗产物(ra大于60％)，作为进一步分离(ra大于80％)以及纯化(ra95％～99％)的原料。该提取工艺流程长、有机溶剂(乙醚、乙醇)使用量大、控制有机溶剂的挥发和完全回收废液中有机成分难度很高，因而生态环保性、生产安全性难以满足要求，其成本也难以降低。

在进一步改进传统提取工艺发展过程中，也有一些新技术的运用，例如结合离子沉淀法、树脂吸附法、膜分离以及分子印迹等技术，可以降低有机溶剂的使用量，也可在一定程度上缩短传统的工艺流程。

尽管如此，仍然存在不少问题。例如目前提纯法主要是利用絮凝除杂进行离心分离，通常采用铁盐或铝盐等无机低分子作为絮凝剂以石灰为助凝剂进行酸碱中和反应，形成絮凝沉淀。但是絮凝反应较慢，甜菊糖在其条件下易被分解破坏；同时絮凝剂耗量大，絮凝反应和压滤澄清周期较长；絮凝后的溶液还需要再进一步除杂。树脂吸附法是利用树脂的吸附特性和有选择性的洗脱剂来实现与其他浸提组分的分离。例如叶发银等(叶发银，杨瑞金*，华霄，赵伟，张文斌.大孔树脂d392对莱鲍迪苷a和甜菊苷吸附作用的研究[j].食品工业科技，2012.23.021)运用大孔树脂d392在水溶液中对ra和st具有较好的吸附选择性，一次吸附解析后ra的纯度达70.4％。但是该树脂吸附法缺点是柱填料用量大、价格贵,易失活；大规模连续性生产的设备投入和运行成本较高,并且该工艺在洗脱过程中使用了不少的易挥发有机溶剂乙醇，生态环保效果及生产安全性不够好。针对这些问题，又开发了利用膜的选择通性对产品进行分离。例如yao等(姚国新,毛波,王旭.膜技术在提取甜菊糖中的应用[j].食品研究与开发,2011,32(12):112-114.)应用微滤膜和超滤膜对甜菊糖水的提取液进行分离提纯，最后用纳滤膜进行脱盐浓缩，结果表明ra的纯度达到了87％左右，但在纳滤膜阶段膜通量的衰减随过滤时间的延长而逐步衰减，在3h后膜通量仅为1l/(h·m²)。由于操作工艺中的层层操作导致生产成本及时间大大增加，不利于工业大规模使用。

分子印迹聚合物(molecularimprintedpolymers，mips)对模板分子具有高“识别性”或特异选择性，是最有可能实现“一步”提纯ra工艺的功能性聚合物材料。例如ye等(杨瑞金,叶发银,华霄,唐乐乐,赵伟,张文斌.莱鲍迪苷a分子印迹聚合物的制备方法[p].中国专利申请号：201310120326.3)运用分子印迹技术对甜叶菊水溶液中ra选择性提取，最后分子印迹聚合物在平衡结合条件下对ra的平衡吸附量可达138.1μmol/g(134mg莱鲍迪苷a/g分子印迹聚合物)，可见选择性吸附ra的性能很优良，但对于工业化制备而言，吸附剂的吸附能力尚不满足要求；此外ra与分子印迹吸附剂的分离，需要再加入有机溶剂进行解吸方可得到产物。

如果能够选择性地提取甜菊糖而不吸附其他杂质，分离过程中又不引入别的有机溶剂那么就将极大简化甜菊糖的提取以及分离工艺，符合绿色环保、清洁工艺的要求。但面临的主要难题是既要具备优良的选择性，也要有足够高的吸附或萃取能力。尽管国内外已进行了大量的探索，尚未见实际性的突破进展。

低共溶溶剂(des)通常是由氢键受体(如季铵盐)和氢键给体(如多元醇、尿素和羧酸)形成的液态物质。des的合成成本较低，同时des与传统溶剂相比还具有很多其他特殊性能，如液态范围宽、热稳定性良好、可设计性强、蒸气压较低、不易挥发、循环使用性能良好等，亦被称之为新型离子液体。

近年来，des在新材料、分离纯化、电化学和催化剂等领域受到广泛关注，目前已开始用于萃取、吸附、催化剂等过程，展现出良好的应用前景。在食品药品应用领域，des的安全性就显得极为重要。那么开发出一种具有生物兼容性好、无毒等特性，且具有更好的安全性的dess就显得尤为重要。例如，ahmadroismansur等人(ahmadroismansura,nho-eulsong,taegyunametal,optimizingtheultrasound-assisteddeepeutecticsolventextractionofflavonoidsincommonbuckwheatsprouts.foodchemistry,2019,438-445)利用设计适当的低共溶溶剂开发出了一种具有选择性的提取分离普通荞麦芽中的黄酮类化合物的方法。该方法证明所使用的des具有良好的安全性，在生化、制药以及食品领域具有应用可行性。

本技术是在对des构成、性能大量探索研究后，开发出一种使用低共溶溶剂水溶液提取甜菊糖的方法，国内外尚未见有类似的报导，有关的des提取甜菊糖工艺路线(提取+分离)如附图2所示。

技术实现要素：

取甜叶菊材料，洗净、干燥后粉碎，过筛得甜叶菊粉末备用。低共溶溶剂(des)的制备过程中，首先加入适量的氢键受体和氢键供体的混合品于单口烧瓶中备用，混合物在80℃条件下搅拌4小时。反应结束后，得到无色透明液体，即低共溶溶剂。可将des置于低于室温环境中保存待用，在低共溶溶剂提取甜菊糖的过程中，取一定量粉碎的甜叶菊加入到一定含水量的dess水溶液中，在一定温度下提取一定时间，提取完成后固液分离，液相含较高纯度ra的甜菊糖。该液相可进一步使用一定量的低碳醇进行醇沉，能够进一步提高甜菊糖产品中的ra纯度。

本项目的特点简述如下

(1)设计、合成了一系列des。这些des具有良好的生物兼容性，从而具有良好的生态环保性、安全性。

(2)运用des水溶液一步提取操作即可获得ra浓度为68.6％的粗甜菊糖，比传统工艺(ra纯度主要在46％左右)提高了近50％，显著优于目前提取过程的产品质量，并且产物收率(甜菊糖与甜叶菊干叶的比值)为13.8％左右，与传统工艺的提取收率12.5％左右以及采用微滤膜-超滤膜-纳滤膜组合工艺的12.9％左右相当或略优。此外，还与柱层析结果(70％ra)相当。证明能够完全取代传统工艺中(见图1)乙醚脱脂肪、70％乙醇萃取、液液分离、ca(oh)2+kal(so4)2絮凝沉淀、离心过滤等构成的一系列提取工艺过程。所以，该技术完全能够使甜菊糖的传统提取工艺过程获得大幅度缩短及操作过程显著简化。

(3)在前面des提取工艺基础上，采用本技术的单一醇沉过程即可获得ra浓度高达84％的粗甜菊糖，比传统工艺中的柱层析效果(70％ra)提高20％左右，并接近文献报道中的微滤膜+超滤膜+纳滤膜的技术效果(87％ra)。表明在des提取基础上，采用简便的醇沉分离即可完全能够取代现有工艺过程中的操作技术要求较高、设备和运行成本较高的诸如柱层析、膜分离组合等技术。

(4)提取过程使用水作为溶剂，des是难以挥发和生物兼容性可行的，无任何易挥发性有机溶剂的使用，并且des和水全部能够回收和循环使用。所以完全符合绿色环保、清洁工艺的要求。

(5)通过des水溶液提取甜菊糖后，为了进一步分离提高甜菊糖中ra的含量，采用目前工业生产使用的乙醇并且使用量较少，符合国内外的有关规定或要求。如果不太考虑显著降低成本，也可以完全不使用醇沉而采用成本较高的纳滤膜分离技术，环保和安全性会进一步改善。

(6)提取分离过程的之间产物ra含量提高后，对于进一步生产商品化高纯度甜菊糖(95％～99％)提供更好的原料，能够显著提高收率、降低成本，经济效果显著。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定。

高效液相色谱分析条件：检测波长210nm，流动相是68％乙腈/32％水(磷酸缓冲液ph＝2.60)，流速1ml/min，进样体积20μl；柱温40℃。hplc分析使用的是c18柱(waters,massachusetts,usa)，检测器为spd-m20apdadetector(shimadzu,kyoto,japan)，柱温箱hct-360lc(hengaotech&dev,tianjin,china)，工作站为class-vp(shimadzu,kyoto,japan)。

附图1为传统有机溶剂提取路线；附图2为本发明提供的des提取路线；附图3为本发明提供的des合成路线；附图4为本发明提供的des[氯化胆碱][乙二醇]红外谱图的红外图谱，氯化胆碱和乙二醇的特征峰在合成des后出现了一定的红移；附图5为本发明提供的传统方法提取甜菊糖的高效液相色谱图；附图6为本发明提供的dess水溶液提取甜菊糖的高效液相色谱图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。下面对本发明实施例提供的des的制备并提取甜菊糖的方法进行具体说明。

实施例1des合成(注：该实施例仅以氢键受体[氯化胆碱]，氢键供体[乙二醇]为反应物，其余des合成条件与本实施例完全相同，仅是产物结构中氢键供体不同的差异。)

加入适量的氯化胆碱和乙二醇于单口烧瓶中备用，称量并配置成氯化胆碱：乙二醇＝1:2(摩尔比)的混合品备用；混合物在80℃条件下搅拌4小时，得到无色透明液体，即低共溶溶剂(des)。将des置于低于室温环境中保存待用，其中的水分适宜在4％以内。

实施例2乙二醇类dess用于提取甜菊糖

甜叶菊洗净后自然晾干粉碎过200目筛，取5克甜叶菊加入20％含水量的des水溶液(des:水＝1：20)g/ml，放入250ml单口烧瓶，在60℃下进行提取实验，固液比1:20(g/ml)，提取时间180min，经过滤分离固液相后，获得含甜菊糖(64.5％的ra)的提取液；进一步分离采用80％乙醇进行醇沉分离，获得更高含量甜菊糖(81.2％的ra)，单位des的甜菊糖提取率182mg/g。

实施例3～11des用于提取甜菊糖的其他实施例

其他不同条件下des应用于提取甜菊糖的实施例7～15见下表。表格里未提及的提取条件与实施例2相同。

综上所述，本发明提供低共溶溶剂的制备方法及其作用于甜菊糖的选择性吸附，该方法首次利用des提取甜菊糖，建立了des选择性吸附分离的新方法。

以上所述仅为本发明的优选实施方式而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。