一种活性氧响应性材料PAM-SH的制备方法与应用

本发明属于纳米材料制备技术领域，具体涉及一种具有活性氧(ros)响应，能特异性释药能力的纳米粒子的制备与应用。

背景技术：

心血管疾病(cvds)在中国乃至世界的发病率和死亡率都很高，被列为头号死亡原因。动脉粥样硬化(as)是心血管疾病的重要病理基础，占心血管疾病死亡人数的61％。炎症会促进过量活性氧(ros)的产生，因此可以利用斑块处特殊的ros微环境设计药物传递系统，触发药物释放。

众所周知，功能纳米粒子是一种革命性的疾病治疗方法，已广泛应用于生物医学领域。阳离子聚酰胺-胺(pamam)树枝状大分子是第一类与蛋白质具有相似结构的商业树枝状大分子，具有独特的树状结构和三维球形结构，并且由于其良好的水溶性，单分散性，可调节的分子大小，非免疫原性，能够跨越生物屏障和容易功能化的能力已经广泛应用于生物医学纳米技术领域。

辛伐他汀是一种内酯前药，具有抑制肝细胞内源性胆固醇生物合成、促进新血管生长、抗炎、抗氧化、改善内皮功能、稳定动脉粥样硬化斑块等多种功能，是处方药中降胆固醇程度最高的药物之一，在世界范围内广泛应用于心血管疾病的一级和二级防治。然而，在辛伐他汀自由给药期间，肝毒性和肌肉疼痛是已知的严重副作用，并且由于横纹肌溶解患者不得不中止治疗。因此，寻求新的药物递送方式迫在眉睫。

技术实现要素：

本发明的目的在于，为解决传统响应性纳米粒子功能单一的局限，提供一种既能响应活性氧又能消耗活性氧的载药纳米粒子sapam(载辛伐他汀酸(sa)的交联树枝状纳米粒子)，同时还提供该材料的制备方法及其在抗血栓纳米粒子方面的应用。

本发明的技术方案如下:

一种活性氧响应性材料pam-sh的制备方法，具有以下步骤:

1)-0.5gpamam的合成

在n2保护下，将丙烯酸甲酯(ma)溶于无水甲醇，在冰浴条件下缓慢滴入乙二胺(eda)中反应30min，eda，ma与甲醇的质量比为1:5～15:1～100，室温反应18h，最后，减压旋转蒸发除去甲醇和多余的ma，真空干燥24h，得到淡黄色粘稠液体-0.5gpamam；

2)0gpamam的合成

在冰浴条件下，将eda的无水甲醇溶液缓慢滴入-0.5gpamam的甲醇溶液中反应20min，-0.5gpamam与eda质量比为1:1～10，然后在35℃下搅拌反应24h，反应完成后，通过减压旋转蒸发除去甲醇和未反应的eda，真空干燥24小时后得到淡黄色粘性液体，即0gpamam；

3)0.5gpamam的合成

在冰浴条件下，将0gpamam的甲醇溶液缓慢滴入ma的无水甲醇溶液中反应20min，0gpamam与ma的质量比为1:1～10，然后在35℃下搅拌反应24h，反应完成后，通过减压旋转蒸发除去甲醇和未反应的ma，真空干燥24小时后得到淡黄色粘性液体，即0.5gpamam；

4)4.0gpamam的合成

交替进行步骤2)和步骤3)的操作，并将前一个步骤的产物作为后一个步骤的原料，最终制备得到4.0gpamam；其中，制备1.5gpamam时反应时间为36h，制备2.0g和2.5gpamam时反应时间均为48h，制备3.0g和3.5gpamam时反应时间均为72h，制备4.0gpamam时反应时间为96h；

5)pam-sh的合成

在n2和黑暗条件下，将pamam溶于pbs中，然后加入2-亚氨基硫烷盐酸盐，2-亚氨基硫烷盐酸盐与4.0gpamam的质量比为1:10～30，室温搅拌过夜，将反应液用透析膜在去离子水中透析48小时后用冻干机冻干，得到白色絮凝固体pam-sh，在-20℃条件下保存。

作为优选，步骤5)中所述的pbs是ph＝8含0.001medta的磷酸缓冲液。

一种活性氧响应性材料pam-sh的应用，其特征在于，是用于制备具备特异性释放药物能力的纳米粒子，步骤为：将辛伐他汀溶解于乙醇中，加入naoh，在50℃下反应2h，用盐酸调节反应溶液ph至中性，旋转蒸发除去反应溶液中的乙醇，并加入正丁醇萃取sa(辛伐他汀)，其中辛伐他汀、乙醇、naoh和正丁醇的质量比为30～90:800～1500:1:500～5000；有机相经旋转蒸发和真空干燥后得到sa；随后，以pam-sh与sa的质量比为1:1～10制备得到sapam。

所述的制备得到sapam，具体步骤为：在n2保护下，将nabh4加入到含pam-sh的去离子水中，pam-sh与nabh4质量比为1:500～1000，在室温下搅拌3h，将反应体系用0.1mhcl调至中性，将含有sa的dmso溶液缓慢滴加到反应体系中，sa与dmso质量比为1:2～10，室温反应5h，最后，用透析袋在去离子水中透析2天得到sapam。

本发明在阳离子4.0gpamam的末端引入了巯基，通过静电吸附与阴离子sa自组装，从而获得了交联型载药纳米粒子(sapam))，既增强了纳米粒子的稳定性，又实现了药物在特定环境中的释放。sa的加入可以中和4.0gpamam的部分正电荷。因此，本发明对基于动脉粥样硬化治疗提供了一种有前途的方法。

综上，本发明有以下有益效果：

1、本发明将毒副作用较大的辛伐他汀酸通过用pam-sh包覆形成纳米粒子使其具有良好的生物相容性。

2、纳米粒子具有过氧化氢特异性响应的特点。

3、本发明的载药纳米粒子不仅具有过氧化氢响应的能力，还可以通过辛伐他汀酸消耗活性氧的能力提高治疗的效果。

附图说明

图1是实施例1中pam-sh的合成路线图

图2是实施例1中4.0gpamam和pam-sh的ftir图。

图3是实施例2中辛伐他汀酸的合成路线图。

图4是实施例2中辛伐他汀酸和辛伐他汀的¹hnmr图。

图5是实施例2中辛伐他汀酸(sa)和辛伐他汀(sv)的ftir光谱图。

图6是实施例2中sapam的tem图。

图7是实施例2中sapam的稳定性图。(a)为dls图；(b)为zeta电位图。

图8是实施例3中sapam在含有不同浓度h2o2的pbs中的sa的体外累积释放曲线图。

图9是实施例4中pam-sh、sa和sapam与rbc孵育1h后的溶血率图。(a)为pam-sh的溶血率图；(b)为sa和sapam的溶血率图。

图10是实施例5中pam-sh、sa和sapam的mtt图。(a)为pam-sh的mtt图；(b)为sa和sapam的mtt图。

图11是实施例6中sa、pam-sh和sapam对raw264.7的细胞内ros含量的影响图。

图12apoe^-/-小鼠的体内治疗效果。其中(a)为主动脉弓油红o染色；(b)为油红o染色量化。

具体实施方式

实施例1：活性氧响应性材料pam-sh的合成

1)-0.5gpamam的合成

pamam通过发散法合成，包括两步迭代反应，利用michael加成和酰胺化反应逐渐向外围发散，从而在中心引发剂核心周围产生分支(代)的同心壳。首先，将含有丙烯酸甲酯(ma,146ml,1.6mol)的无水甲醇(200ml)在冰浴中缓慢滴入乙二胺(eda,13ml,0.2mol)中反应30min，然后在室温下反应18h。以上反应均在n2保护下进行。最后，减压旋转蒸发除去甲醇和多余的ma，真空干燥24h，得到淡黄色粘稠液体(-0.5gpamam,79g,97％)。

2)0gpamam的合成

在冰浴条件下，将含eda的无水甲醇(140ml,2.1mol)缓慢滴入含-0.5gpamam(35g,0.087mol)的甲醇溶液(150ml)中反应20min，然后在35℃下搅拌反应24h。反应完成后，通过减压旋转蒸发除去甲醇和未反应的eda,真空干燥24小时后得到淡黄色粘性液体，，即0gpamam(43g,96％)。

3)0.5gpamam的合成

在冰浴条件下，将含0gpamam(36g，0.07mol)的甲醇溶液(150ml)缓慢滴入含ma(223ml，2.4mol)的无水甲醇中反应20min，然后在35℃下搅拌反应24h。反应完成后，通过减压旋转蒸发除去甲醇和未反应的ma，真空干燥24小时后得到淡黄色粘性液体，即0.5gpamam(81g，97％)。

4)4.0gpamam的合成

1.5g、2.5g、3.5gpamam的制备方法与0.5gpamam相同，1.0g、2.0g、3.0g、4.0gpamam的制备方法与0gpamam相同。ma和eda的剂量按比例增加，反应时间相应延长，具体如表1所示。从图2中可以看出，在3270和1554cm^–1的强吸收峰归因于伯胺(-nh2)中n-h键的伸缩和弯曲振动，在1659cm^-1处出现的尖锐吸收峰代表co-nh基团中的c＝o伸缩振动，说明树枝状结构中同时存在酯基和伯胺，证实了4.0gpamam的成功合成。

表1.每代的比率，反应时间和产率

5)pam-sh的合成

将0.04g2-亚氨基硫烷盐酸盐加入50ml含有0.5g4.0gpamam的pbs(ph＝8,0.001medta)中。反应在n2和黑暗条件下进行，室温搅拌过夜。将反应液用透析膜(mwco1.0kda)在去离子水(9×3l)中透析48小时后用冻干机冻干，得到白色絮凝固体(pam-sh,0.613g)，并保存在-20℃。图1为pam-sh的合成路线。图2中578cm^–1处的峰代表-s-s-而不是-sh的吸收峰，因为不稳定的巯基很容易在空气中交联成为二硫键，这也说明pam-sh的成功制备。

实施例2：sapam纳米粒子的制备

将0.456g辛伐他汀溶解于11ml乙醇中，加入naoh(17ml，0.1m)，在50℃下反应2h，用盐酸调节反应溶液ph至中性。旋转蒸发除去反应溶液中的乙醇，并加入正丁醇萃取sa。有机相经旋转蒸发和真空干燥后得到0.402gsa。随后，以pam-sh与sa的质量比为5:10制备了sapam。具体步骤为：在n2保护下，将0.1mnabh4加入到含有5mgpam-sh的去离子水中，在室温下搅拌3h，将溶液用0.1mhcl调至中性，将含有10mgsa的2mldmso溶液缓慢滴加到反应溶液中，室温反应5h。最后，用透析袋(mwco1.0kda)在去离子水透析2天得到sapam。图3是sa的合成路线图。图4和图5分别是辛伐他汀酸和辛伐他汀的¹hnmr和ftir图。¹hnmr中可以看到由于内酯结构的开环，连接羟基的邻位h(e)的峰已经从原来的4.62ppm变为3.64ppm，连接羧基的邻位h(s)的峰从2.71ppm变为2.34ppm。ftir中1583cm^–1处的尖峰是羧酸基团(-cooh)中的-coo-不对称伸缩特征峰，而3363cm^–1处的宽峰是由于氢键存在的原因，为羟基(-oh)的伸缩振动吸收峰。图6和图7是sapam的tem和稳定性图。tem图像证实了sapam为球形纳米结构，粒径为100nm。图7说明纳米粒子在一个月内非常稳定，粒径和zeta电位几乎保持不变。

实施例3：载药与药物释放

用紫外-可见光谱仪(uv-2450，日本岛津公司)在243nm处检测含h2o2的去离子水中sapam中的sa含量。将sapam溶液冻干后，称取一定量的sapam粉末溶解在含有过氧化氢的去离子水中，高速离心后，将上清液转移到石英比色皿中，25℃条件下观察sa的紫外吸收峰，并根据已建立的标准曲线获得载药量。使用透析袋进行了体外药物释放的研究。简而言之，将装在透析袋(mwco3.5kda)中等量的sapam溶液浸入含不同浓度h2o2(0，2.5，5，7.5和10mm)的pbs(ph7.4)中，每个样品的体积为68ml。将实验置于37℃的黑暗环境中的摇床上轻轻晃动。在预定的时间点，取出3ml透析液用于紫外测定，以定量sa，同时加入等体积的新鲜透析液以保持体积恒定。图8是sapam在含有不同浓度h2o2的pbs(ph7.4)中的sa的体外累积释放曲线图，可以发现明显的h2o2依赖性药物释放曲线，说明sapam具有h2o2响应性释放药物的特性。

实施例4：血液相容性

sapam的溶血活性按照先前报道的方法进行了一些修改。简而言之，在含有抗凝剂柠檬酸钠的离心管中收集新鲜兔血，以2000rpm离心10min，弃去含有血浆和白细胞的上清，获得红细胞。将所得的红细胞用pbs(ph7.4)洗涤3次，待上清液澄清后吸弃上清液，将红细胞重悬于pbs中。将红细胞悬液(100μl)与不同浓度的sapam在37℃共孵育1h。在这项研究中，我们测试了7种浓度(0、2、4、6、8、16、24、32、38μg/ml)的pam-sh的溶血情况，以及另外7种浓度(0、2、4、6、8、10、16、24μg/ml)的sa和sapam的溶血情况。孵育后，将混合物以2000rpm离心10min，并使用紫外-可见光谱仪在540nm处分析各上清液的吸光度，以测定血红蛋白释放量。阴性对照为未经处理的红细胞(溶血率0％)，而用去离子水处理过的红细胞作为阳性对照(溶血率100％)。图9说明当pam的浓度小于32μg/ml时，pam组是安全的。当sa浓度达到10μg/ml时，sa组被视为溶血，而sapam组的溶血率仅为3.5％，说明pam可在一定范围内降低红细胞的溶血。

实施例5：mtt

通过mtt法检测huvecs的细胞活力。将细胞以5×10³细胞/孔的密度置于96孔板中，为并在37℃和5％co2下培养24h，然后加入20μl不同浓度的sapam处理细胞。培养24h后，在黑暗条件下向每个孔中加入20μlmtt，再次培养4h。小心弃掉培养基，加入150μldmso溶解甲瓚晶体。使用酶标仪(spectramax340pc，美国分子仪器公司)获得每孔在492nm处的吸光度。图10中pam-sh组的细胞存活率在各浓度之间无显著差异，且细胞存活率均不低于80％，说明具有良好的细胞相容性。

实施例6：细胞内ros的检测

采用dcfh-da法检测raw264.7细胞内的ros水平。乙酸酯基团被细胞内酯酶水解后被ros氧化，dcfh-da转化为带有绿色荧光的2'，7'-二氯荧光素(dcf)，其荧光强度与ros的含量成正比。简而言之，将raw264.7以每孔1×10⁵个细胞的密度接种在激光共聚焦培养皿中，并在37℃，5％co2下用lps(4μg/ml)处理36h。用pbs缓冲液洗涤细胞3次后，加入含有sa或sapam的新鲜培养基作用一段时间后，洗涤细胞3次，并在黑暗中与10μmdcfh-da培养30分钟，然后除去荧光探针溶液，并用pbs洗涤细胞。raw264.7用hoechst33342(1mm)染色5分钟后，用共聚焦激光扫描显微镜(clsm,zeisslsm780，德国)测量细胞的共聚焦荧光成像。图11说明sa和sapam能有效抑制ros水平。

实施例7：apoe^-/-小鼠模型

经过正常饮食喂养三天之后，apoe^-/-小鼠被随机分为3组:空白对照组，sa组和sapam组。小鼠连续24周接受高脂喂养，并在最后8周内每3天接受80mg/kg剂量的治疗。高胆固醇喂养24周后，末次治疗24h后处死所有小鼠。图12说明sapam的治疗效果优于游离sa。