一种基于超声辅助的杏鲍菇多糖的提取方法

本发明涉及多糖提取技术领域，具体涉及一种基于超声辅助的杏鲍菇多糖的提取方法。

背景技术：

杏鲍菇含有丰富的真菌多糖，是其主要活性成分，杏鲍菇营养成分十分丰富，有蛋白质、氨基酸、糖类、脂类、维生素及矿物质等。其中含有的食用菌多糖可抑制肿瘤细胞的增殖生长，具有抗菌和抗病毒的功效，可降血脂血糖，预防糖尿病等，所以在提取杏鲍菇多糖时，采用能完整提取多糖的方法尤为重要，最大限度不破坏多糖的化学结构，保护其活性结构。

目前，杏鲍菇多糖的提取，主要采用的是热水浸提多糖的方法，存在提取得率低的问题。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种基于超声辅助的杏鲍菇多糖的提取方法。本发明所述方法极大保护了多糖的活性结构，保证了多糖的完整性，安全绿色无毒，工业成本低，时间短，可作为基料用于新型食品生产开发中。

本发明提供了一种基于超声辅助的杏鲍菇多糖的提取方法，包括以下步骤：

1)将粉碎后的杏鲍菇与乙醇水溶液混合，静置4～12h，离心，得到沉淀；

2)将步骤1)得到的沉淀与水混合，超声处理10～50min，离心，得到上清；所述超声处理的功率为348～580w，温度为20～60℃；

3)将步骤2)得到的上清与乙醇水溶液混合，离心后取沉淀，得到杏鲍菇多糖。

优选的是，所述步骤1)中，粉碎前，还包括对杏鲍菇进行清洗、烘干。

优选的是，所述烘干的温度为40～60℃。

优选的是，所述步骤1)中，粉碎包括将杏鲍菇进行第一粉碎至80目和进行第二粉碎至300目。

优选的是，步骤1)和步骤3)所述乙醇水溶液中乙醇的体积百分含量分别为95％。

优选的是，步骤1)所述杏鲍菇的质量与乙醇水溶液的体积比为1:10g/ml。

优选的是，步骤1)或2)或3)所述离心的条件为4000～7500r/min，10～15min。

优选的是，所述步骤2)中，沉淀的质量和水的体积比为1:(10～50)g/ml。

优选的是，所述步骤3)中，上清与乙醇水溶液混合的体积比为1:3。

优选的是，步骤3)所述离心前，还包括静置4～12h。

本发明提供了一种基于超声辅助的杏鲍菇多糖的提取方法。本发明通过超声波的使用，可以辐射产生热效应、空化效应和机械剪切效应，增大物质分子的运动速率和频率，加速物质的扩散溶解，且空化效应可瞬间产生巨大的压力，超声波破坏杏鲍菇的细胞壁结构，释放细胞壁和细胞质中的多糖，加速杏鲍菇细胞中的多糖溶于水中，从而提高多糖的得率。本发明所述方法极大保护了杏鲍菇多糖免疫增强功能的活性结构，保证了免疫增强活性多糖制备的靶向性和完整性；在整个实验过程中只采用乙醇这一有机试剂，安全绿色无毒，工业成本低；时间极大缩短，比传统工艺用时短；且可作为基料用于新型食品生产开发中。

附图说明

图1为本发明提供的杏鲍菇免疫增强活性多糖制备不同阶段表观示意图；其中，a：乙醇脱色；b：超声后得到的上清；c：乙醇沉淀；d：预离心样品；e：烘干后成品。

具体实施方式

本发明提供了一种基于超声辅助的杏鲍菇多糖的提取方法，包括以下步骤：

1)将粉碎后的杏鲍菇与乙醇水溶液混合，静置4～12h，离心，得到沉淀；

2)将步骤1)得到的沉淀与水混合，超声处理10～50min，离心，得到上清；所述超声处理的功率为348～580w，温度为20～60℃；

3)将步骤2)得到的上清与乙醇水溶液混合，离心后取沉淀，得到杏鲍菇多糖。

本发明将粉碎后的杏鲍菇与乙醇水溶液混合，静置4～12h，离心，得到沉淀。本发明对所述杏鲍菇的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规市售杏鲍菇即可，如购自江苏江苏天丰生物科技有限公司提供。在本发明中，粉碎前，优选还包括对杏鲍菇进行清洗、烘干。在本发明中，所述烘干的温度优选为40～60℃，更优选为50℃，烘干时间优选为3～5h，烘干后含水量优选降至0。在本发明中，所述粉碎优选包括将杏鲍菇进行第一粉碎至80目和进行第二粉碎至300目，在此粉碎条件下，可加速杏鲍菇细胞的破碎度，使杏鲍菇中活性多糖组分在最快速度及最大程度下溶出。本发明所述第一粉碎优选使用粉碎机进行，所述第二粉碎优选使用气流粉碎机进行，本发明每次粉碎后，优选过相应目数的筛，过筛后，优选将杏鲍菇粉分装后置于干燥器中备用。本发明对乙醇的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可，如购自南京化学试剂有限公司。在本发明中，所述乙醇水溶液中乙醇的体积百分含量优选为95％。在本发明中，所述杏鲍菇的质量与乙醇水溶液的体积比优选为1:10g/ml。在本发明中，所述静置的时间优选为4～12h，更优选为4h，本发明所述静置的温度优选为4℃，在上述体积比、时间及温度条件下，可实现杏鲍菇中有色物质、低聚糖和脂肪的最有效溶出及快速去除，保证最终多糖产品颜色更加趋向于白色。在本发明中，所述离心的条件优选为4000～7500r/min，10～15min，更优选7500r/min，15min。

得到沉淀后，本发明将沉淀与水混合，超声处理10～50min，离心，得到上清；所述超声处理的功率为348～580w，温度为20～60℃。在本发明中，所述沉淀的质量和水的体积比优选为1:(10～50)g/ml，更优选为1:30g/ml。在本发明中，所述水优选为超纯水。本发明所述超声处理能够促进杏鲍菇多糖溶于水中。在本发明中，所述超声处理的时间优选为20min，功率优选为522w，温度优选为40℃。在本发明中，所述离心的条件优选为4000～7500r/min，10～15min，更优选7500r/min，15min。在此条件下，可保证杏鲍菇多糖的快速溶出，显著提升其提取效率，在保证产品的纯度的同时，维持了杏鲍菇多糖的结构完整性，及在免疫增强方面的功能活性。

得到上清后，本发明将上清与乙醇水溶液混合，离心后取沉淀，得到杏鲍菇多糖。在本发明中，所述上清与乙醇水溶液混合的体积比优选为1:3。在本发明中，所述乙醇水溶液中乙醇的体积百分含量优选为95％。在本发明中，所述离心前，还包括静置4～12h，更优选静置4h。在此条件下，可保证杏鲍菇免疫增强活性多糖在沉淀过程中的质构感，极大程度保持原有性状。在本发明中，所述离心的条件优选为4000～7500r/min，10～15min，更优选7500r/min，10min。本发明得到沉淀后，优选进行冷冻干燥，称重记录数据。本发明多糖得率的计算公式优选为：

多糖得率(％)＝(m1/m2)×100％

式中：m1为粗多糖质量(g)，m2为杏鲍菇粉重(g)。

下面结合具体实施例对本发明所述的一种基于超声辅助的杏鲍菇多糖的提取方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

新鲜杏鲍菇洗净，于烘箱中50℃烘干，粉碎机粉碎后，80目过筛，再经气流粉碎机粉碎，300目过筛，制得杏鲍菇粉，装入自封袋置于干燥器中备用。

取5g杏鲍菇粉于250ml锥形瓶中，1:10g/ml加入95％乙醇，混合均匀，常温下放置4h，除去其中的有色物质、低聚糖、去脂等。以7500r/min，15min离心取混合溶液的沉淀，加入1:30g/ml料液比的超纯水，在超声功率464w下，设置温度为40℃超声30min，杏鲍菇多糖溶于超纯水中。7500r/min，15min离心取浸提液的上清液，以上清液：乙醇＝1：3，在上清液中加入三倍体积95％乙醇，沉淀4h得多糖。7500r/min离心10min取白色沉淀，冷冻干燥，称重记录数据，得杏鲍菇多糖，多糖得率7.10％。

图1为杏鲍菇免疫增强活性多糖制备不同阶段表观示意图；其中，a：乙醇脱色；b：超声后得到的上清；c：乙醇沉淀；d：预离心样品；e：烘干后成品。

实施例2

新鲜杏鲍菇洗净，于烘箱中50℃烘干，粉碎机粉碎后，80目过筛，再经气流粉碎机粉碎，300目过筛，制得杏鲍菇粉，装入自封袋置于干燥器中备用。

取5g杏鲍菇粉于250ml锥形瓶中，1:10g/ml加入95％乙醇，混合均匀，常温下放置4h，除去其中的有色物质、低聚糖、去脂等。以7500r/min，15min离心取混合溶液的沉淀，加入1:30g/ml料液比的超纯水，在超声功率522w下，设置温度为40℃超声20min，杏鲍菇多糖溶于超纯水中。7500r/min，15min离心取浸提液的上清液，以上清液：乙醇＝1：3，在上清液中加入三倍体积95％乙醇，沉淀4h得多糖。7500r/min离心10min取白色沉淀，冷冻干燥，称重记录数据，得杏鲍菇多糖，多糖得率8.79％。

实施例3

其它制备条件同实施例1，将超声处理的料液比为40ml/g、超声功率为522w、超声温度为40℃和超声时间为30min，多糖得率为7.3％。

实施例4

其它制备条件同实施例1，将超声处理的料液比为20ml/g、超声功率为464w、超声温度为40℃和超声时间为20min，多糖得率为6.87％。

实施例5

其它制备条件同实施例1，将超声处理的料液比为20ml/g、超声功率为464w、超声温度为40℃和超声时间为40min，多糖得率为8.77％。

实施例6

其它制备条件同实施例1，将超声处理的料液比为30ml/g、超声功率为464w、超声温度为50℃和超声时间为20min，多糖得率为8.57％。

实施例7

其它制备条件同实施例1，将超声处理的料液比为30ml/g、超声功率为406w、超声温度为30℃和超声时间为30min，多糖得率为6.46％。

实施例8

其它制备条件同实施例1，将超声处理的料液比为40ml/g、超声功率为464w、超声温度为40℃和超声时间为20min，多糖得率为6.83％。

实施例9

其它制备条件同实施例1，将超声处理的料液比为20ml/g、超声功率为464w、超声温度为50℃和超声时间为30min，多糖得率为5.64％。

实施例10

其它制备条件同实施例1，将超声处理的料液比为30ml/g、超声功率为522w、超声温度为50℃和超声时间为30min，多糖得率为7.05％。

对比例1

传统工艺(凡军民,谢春芹,史俊等.杏鲍菇多糖提取工艺条件的研究[j].江苏农业科学,2012,第40卷(6):251-253)采用提取温度81℃，提取时间3.4h，料液比1:27g/ml，提取1次，该条件下杏鲍菇多糖得率为8.29％，可见，在多糖得率相差不大的前提下，本发明在超声波辅助提取的基础上，提取时间极大缩短为30min，提取温度大幅度降低，极大程度节约了能耗，降低了生产成本，有助于工业化生产。

实施例4

利用体外细胞实验，选择热水浸提法制备杏鲍菇多糖得组分1(p1)，热水浸提结合超声辅助法得组分2(p2)，与本发明所得组分3(p3)，通过下述方法对三种组分的免疫增强活性进行比较验证。发现p3免疫增强活性最高，主要表现在对raw264.7巨噬细胞增殖率的显著提高，及对各免疫因子的分泌的促进。

利用正常raw264.7巨噬细胞对不同组分的免疫增强活性进行评价。细胞(2×10⁵个细胞/ml)接种于96孔细胞培养板，过夜培养后，去掉旧培养基，加入200μl含有不同浓度多糖的新鲜培养基，培养2h后，吸弃20μl旧培养基，加入20μl含有或不含lps(100ng/ml)的新鲜培养基培养24h。其中，以在整个培养过程中仅含有培养基(不含多糖或lps)的培养孔为空白对照；培养孔中含有细胞且仅含lps的培养孔为阴性对照孔。培养结束后，向各孔中加入10μl，浓度为5mg/ml的mtt溶液，继续培养4h以形成结晶。去掉培养基，加入100μldmso溶解结晶后，570nm测定各孔中的吸光值，并按照下式计算各孔的细胞增殖率：

细胞增殖率率(％空白对照)＝[(as–ab)/(ac–ab)]×100

其中，ac是空白对照组的吸光值，ab是整个单纯培养基的吸光值，as是含有多糖及lps处理(样品处理组)或者仅含lps(阴性对照组)的吸光值。

收集各处理组培养基上清，并按照试剂盒说明操作，测定各处理组细胞培养上清液中各免疫因子的浓度，结果显示增殖率方面，p3组分较其他两个组分增长25％以上，tnf-α，il-6浓度分别提升10％～20％，且并未产生炎性反应。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。