一种米糠多糖锌螯合物的制备方法及应用与流程

本发明涉及具有抗氧化活性的多糖锌螯合物的制备工艺，具体为一种米糠多糖锌螯合物的制备方法及应用。

背景技术：

我国是大米主产国，米糠资源丰富。米糠粕是米糠提取油脂后的主要副产品，目前其利用主要为动物饲料，产品价值低。米糠多糖是米糠粕中重要的功能性成分，是一类结构复杂的杂聚糖，具有抗氧化、提高免疫力、降血糖、降脂、抗菌、抗辐射、保鲜等多种功效。现关于米糠多糖的研究多集中于多糖的提取和活性研究，对于米糠多糖螯合物的相关应用研究极少。

2017年中国国家发明专利cn107267571a公开了一种米糠多糖的提取方法，多糖制备过程包括酶解、一次提取、二次提取、一次纯化、二次纯化，不仅工艺复杂，而且多糖得率只能达到6.96％；2019年中国国家发明专利cn109608560a公开了一种米糠多糖的提取方法及其制作的饼干和方法。其多糖制备过程包括纤维素酶和蛋白酶酶解以及超声提取，虽然制备的多糖纯度较专利cn107267571a提高了14％，但多糖得率仍为6.6-6.8％，而且超声技术在工业化生产中有困难，限制了该工艺的应用。

天然植物多糖与金属离子的螯合物是目前临床上广泛应用的新型高效营养强化剂，这种稳定的螯合物容易被小肠黏膜细胞吸收，同时能够减少游离金属离子对胃肠黏膜的刺激作用，并且当金属离子释放之后，多糖配体能够继续发挥其生物活性功能。锌作为必需微量元素之一，广泛参与能量代谢、核酸和蛋白质合成、细胞与体液免疫等过程。机体缺锌会导致基础代谢下降、蛋白质利用率降低、食欲与消化功能低下、影响生长发育等。有关多糖-锌螯合物的研究已有报道：2014年中国国家发明专利cn104031156a公开了夏枯草多糖锌鳌合物及其制备方法与在抗癌药物中的应用，但该专利中螯合物锌含量仅为1.5％；2017年中国国家发明专利cn109776694a公开了褐藻多糖铜、铁、锌三联螯合物的制备方法及其应用，该专利中螯合物锌含量提高到8.5％；2020年中国国家发明专利cn112048025a公开了一种补锌剂水溶性大豆多糖锌螯合物及其制备方法与应用，该专利中螯合物锌含量也仅为2-3％。综上所述，以米糠多糖作为配体进行的锌螯合还未见报道，而且需要开发一种锌含量更高的有机螯合产品。

技术实现要素：

本发明针对目前米糠多糖得率较低的现状，采用了一种新型的活性物质提取技术-水力振荡技术辅以酶解法提取米糠多糖，该技术不仅在保证米糠多糖纯度的同时提高了米糠多糖得率，而且可实现提取设备由小试-中试-大规模生产的无缝衔接，本发明针对多糖-锌螯合物中锌含量较低的问题，提供了一种可工业化生产的米糠多糖锌螯合物的制备方法，产品得率高、多糖含量高、锌离子含量高。一方面克服了现有技术中米糠多糖制备存在的得率较低、工艺复杂、无法放大生产的问题；另一方面开发了一种易生产、成本低、含量高、抗氧化活性强的有机锌螯合产品。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种米糠多糖锌螯合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)原料预处理：将米糠粕进行粉碎；

(2)物料混合：将米糠粕与α-淀粉酶、中性蛋白酶进行混合；

(3)水力振荡提取：将混合后的物料加水进行配料，搅拌均匀后，在水力振荡设备中进行振荡处理；

(4)酶解：将步骤(3)获得的提取混合物ph调至4.5～5.5，分别加入植酸酶、木聚糖酶和纤维素酶，酶解温度45～55℃，酶解时间1.5～2.5h；

(5)灭酶：将步骤(4)获得的酶解混合液升温到90～100℃，保温5～10min；

(6)离心：将灭酶后的混合液离心收集上清液；

(7)添加金属离子：在步骤(6)获得的上清液中加入锌离子盐，锌离子的质量与米糠粕原料质量比为(1～3):100；

(8)螯合：将上述加入金属盐的多糖提取液升温至60～80℃，搅拌40～80min，螯合反应结束后，将多糖螯合液在70～85℃减压浓缩；

(9)离心：将多糖螯合浓缩液离心收集上清液；

(10)乙醇沉淀：将步骤(9)获得的上清液中加入无水乙醇，4℃冷藏8～12h；

(11)固液分离：多糖螯合浓缩清液经乙醇沉淀后分层，固液分离后收集沉淀；

(12)干燥：将步骤(11)获得的沉淀烘干，粉碎过筛，得到米糠多糖锌螯合物。

进一步地，所述步骤(1)中原料的粉碎粒度为60～80目。

进一步地，所述步骤(2)中，α-淀粉酶的添加量为40～120u/g米糠粕，中性蛋白酶的添加量为3000～5000u/g米糠粕。

进一步地，所述步骤(3)固液质量比为1:(15～25)，水力振荡处理时间为8～12min，温度为室温。

进一步地，所述步骤(4)中采用柠檬酸调节提取混合物的ph。

进一步地，所述步骤(4)中，植酸酶的添加量为120～180u/g米糠粕、木聚糖酶添加量为2000～4000u/g米糠粕、纤维素酶添加量为500～1000u/g米糠粕。

进一步地，所述步骤(6)中离心转数为4000～5000r/min，离心时间5～10min，步骤(9)中离心转数为4000～5000r/min，离心时间10～20min。

进一步地，所述步骤(7)中锌离子盐为氯化锌或硫酸锌，经过酶解和添加金属盐后，体系的ph维持在4.0～6.0，可直接进行螯合。

进一步地，所述步骤(8)中浓缩液的体积与螯合液原液体积的比值为1:10～1:12。

进一步地，所述步骤(10)中无水乙醇的加入量为步骤(9)获得的上清液体积的2～4倍，多糖螯合浓缩清液经乙醇沉淀后分层明显，且沉淀聚集不分散，多糖锌螯合物存在于沉淀中。

进一步地，所述步骤(12)中干燥温度为70～85℃，粉碎后采用60～80目筛过筛。

进一步地，所述步骤(12)得到的多糖锌螯合物得率为10～16％，多糖含量为45～65％，锌离子含量为8～15％。

本发明还提供了一种米糠多糖锌螯合物的应用，基于上述制备方法制得的米糠多糖锌螯合物用于制备临床用药、保健品、食品添加剂、饲料添加剂中任意一种产品。

本发明的优势体现在同时采用水力振荡技术和酶解处理能够断开多糖与蛋白、多糖与植酸、植酸-蛋白-金属离子之间的交联作用，让米糠多糖在短时间内大量溶出，并利用米糠多糖的强螯合作用，生产了一款高含量的有机锌螯合产品，工艺简单、成本可控、抗氧化活性显著。

水力振荡技术用于提取米糠多糖时，要严格控制处理时间，随着处理时间的延长，多糖提取率会显著降低。在水力振荡提取的同时加入淀粉酶，即使处理时间较短，淀粉也可被全部降解；米糠粕中的多糖与植酸、纤维素、蛋白质等交联在一起，通过植酸酶、木聚糖酶、纤维素酶的共同作用可进一步释放多糖，水力振荡与蛋白酶共同作用可显著降低多糖产品中蛋白质的含量，从而提高产品得率和纯度。

本发明的有益效果在于：

本发明将水力振荡技术与酶法提取有效结合，不需要专门的纯化工艺，即可显著提高米糠多糖的得率和纯度，且生产工艺可直接放大生产。利用米糠多糖的超强螯合能力，将添加的锌离子有效螯合到多糖中，通过乙醇沉淀，将螯合后的锌离子随着多糖一起沉淀出来，使其存在状态由无机转变为有机。最终提供了一种低成本、高含量的多糖锌螯合产品。螯合前，米糠多糖得率＞9％，多糖纯度＞70％；螯合后，随着锌离子添加量的变化，多糖锌螯合物得率为10～16％，多糖含量为45～65％，锌离子含量为8～15％。

附图说明

图1为米糠多糖和米糠多糖锌螯合物对dpph自由基清除率的变化趋势；

图2为米糠多糖和米糠多糖锌螯合物对oh自由基清除率的变化趋势。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

米糠多糖锌螯合物的制备：

实施例1

(1)将米糠粕进行粉碎，过60目筛；

(2)称取过筛后的米糠粕2kg，与α-淀粉酶、中性蛋白酶进行混合，其中α-淀粉酶的添加量为40u/g米糠粕，中性蛋白酶的添加量为3000u/g米糠粕；

(3)将混合后的物料按固液质量比1:15加水进行配料，搅拌均匀后，在水力振荡设备中处理8min，温度为室温；

(4)将上述提取混合物用柠檬酸调ph为5.5，分别加入植酸酶、木聚糖酶和纤维素酶，酶解温度45℃，酶解时间1.5h，其中植酸酶的添加量为120u/g米糠粕、木聚糖酶添加量为2000u/g米糠粕、纤维素酶添加量为500u/g米糠粕；

(5)将酶解液升温到100℃，保温5min；

(6)将灭酶后的混合液离心，转数为4000r/min，离心时间5min，收集上清液；

(7)将离心上清液中加入硫酸锌，锌离子的质量与米糠粕原料质量比为1:100，此时体系的ph为5.4；

(8)将加入金属盐的多糖提取液升温至60℃，搅拌40min，反应结束后，螯合液在70℃减压浓缩，浓缩液的体积与原液体积的比值为1:12；

(9)将多糖螯合浓缩液离心，转数为4000r/min，离心时间10min，收集上清液；

(10)将多糖螯合浓缩上清液中加入4倍体积的无水乙醇，4℃冷藏8h；

(11)将冷藏后的上清液倾倒，收集沉淀；

(12)将上述沉淀在70℃条件下烘干，粉碎过60目筛，得到米糠多糖锌螯合物1。

实施例2

(1)将米糠粕进行粉碎，过80目筛；

(2)称取过筛后的米糠粕2kg，与α-淀粉酶、中性蛋白酶进行混合，其中α-淀粉酶的添加量为80u/g米糠粕，中性蛋白酶的添加量为4000u/g米糠粕；

(3)将混合后的物料按固液质量比1:20加水进行配料，搅拌均匀后，在水力振荡设备中处理10min，温度为室温；

(4)将上述提取混合物用柠檬酸调ph为5.0，分别加入植酸酶、木聚糖酶和纤维素酶，酶解温度50℃，酶解时间2.0h，其中植酸酶的添加量为150u/g米糠粕、木聚糖酶添加量为3000u/g米糠粕、纤维素酶添加量为750u/g米糠粕；

(5)将酶解液升温到95℃，保温8min；

(6)将灭酶后的混合液离心，转数为5000r/min，离心时间8min，收集上清液；

(7)将离心上清液中加入硫酸锌，锌离子的质量与米糠粕原料质量比为2:100，此时体系的ph为4.8；

(8)将加入金属盐的多糖提取液升温至70℃，搅拌60min，反应结束后，螯合液在80℃减压浓缩，浓缩液的体积与原液体积的比值为1:11；

(9)将多糖螯合浓缩液离心，转数为5000r/min，离心时间15min，收集上清液；

(10)将多糖螯合浓缩上清液中加入3倍体积的无水乙醇，4℃冷藏10h；

(11)将冷藏后的上清液倾倒，收集沉淀；

(12)将上述沉淀在80℃条件下烘干，粉碎过80目筛，得到米糠多糖锌螯合物2。

实施例3

(1)将米糠粕进行粉碎，过80目筛；

(2)称取过筛后的米糠粕2kg，与α-淀粉酶、中性蛋白酶进行混合，其中α-淀粉酶的添加量为120u/g米糠粕，中性蛋白酶的添加量为5000u/g米糠粕；

(3)将混合后的物料按固液质量比1:25加水进行配料，搅拌均匀后，在水力振荡设备中处理12min，温度为室温；

(4)将上述提取混合物用柠檬酸调ph为4.5，分别加入植酸酶、木聚糖酶和纤维素酶，酶解温度55℃，酶解时间2.5h，其中植酸酶的添加量为180u/g米糠粕、木聚糖酶添加量为4000u/g米糠粕、纤维素酶添加量为1000u/g米糠粕；

(5)将酶解液升温到90℃，保温10min；

(6)将灭酶后的混合液离心，转数为4000r/min，离心时间10min，收集上清液；

(7)将离心上清液中加入硫酸锌，锌离子的质量与米糠粕原料质量比为3:100，此时体系的ph为4.2；

(8)将加入金属盐的多糖提取液升温至80℃，搅拌80min，反应结束后，螯合液在85℃减压浓缩，浓缩液的体积与原液体积的比值为1:10；

(9)将多糖螯合浓缩液离心，转数为4000r/min，离心时间20min，收集上清液；

(10)将多糖螯合浓缩上清液中加入2倍体积的无水乙醇，4℃冷藏12h；

(11)将冷藏后的上清液倾倒，收集沉淀；

(12)将上述沉淀在85℃条件下烘干，粉碎过80目筛，得到米糠多糖锌螯合物3。

未螯合锌的米糠多糖的制备

对比例1

(1)将米糠粕进行粉碎，过60目筛；

(2)称取过筛后的米糠粕2kg，与α-淀粉酶、中性蛋白酶进行混合，其中α-淀粉酶的添加量为40u/g米糠粕，中性蛋白酶的添加量为3000u/g米糠粕；

(3)将混合后的物料按固液质量比1:15加水进行配料，搅拌均匀后，在水力振荡设备中处理8min，温度为室温；

(4)将上述提取混合物用柠檬酸调ph为5.5，分别加入植酸酶、木聚糖酶和纤维素酶，酶解温度45℃，酶解时间1.5h，其中植酸酶的添加量为120u/g米糠粕、木聚糖酶添加量为2000u/g米糠粕、纤维素酶添加量为500u/g米糠粕；

(5)将酶解液升温到100℃，保温5min；

(6)将灭酶后的混合液离心，转数为4000r/min，离心时间5min，收集上清液；

(7)将离心上清液在70℃减压浓缩，浓缩液的体积与原液体积的比值为1:12；

(8)将多糖浓缩液离心，转数为4000r/min，离心时间10min，收集上清液；

(9)将多糖浓缩上清液中加入4倍体积的无水乙醇，4℃冷藏8h；

(10)将冷藏后的上清液倾倒，收集沉淀；

(11)将上述沉淀在70℃条件下烘干，粉碎过60目筛，得到米糠多糖1。

对比例2

(1)将米糠粕进行粉碎，过80目筛；

(2)称取过筛后的米糠粕2kg，与α-淀粉酶、中性蛋白酶进行混合，其中α-淀粉酶的添加量为80u/g米糠粕，中性蛋白酶的添加量为4000u/g米糠粕；

(3)将混合后的物料按固液质量比1:20加水进行配料，搅拌均匀后，在水力振荡设备中处理10min，温度为室温；

(4)将上述提取混合物用柠檬酸调ph为5.0，分别加入植酸酶、木聚糖酶和纤维素酶，酶解温度50℃，酶解时间2.0h，其中植酸酶的添加量为150u/g米糠粕、木聚糖酶添加量为3000u/g米糠粕、纤维素酶添加量为750u/g米糠粕；

(5)将酶解液升温到95℃，保温8min；

(6)将灭酶后的混合液离心，转数为5000r/min，离心时间8min，收集上清液；

(7)将离心上清液在80℃减压浓缩，浓缩液的体积与原液体积的比值为1:11；

(8)将多糖浓缩液离心，转数为5000r/min，离心时间15min，收集上清液；

(9)将多糖浓缩上清液中加入3倍体积的无水乙醇，4℃冷藏10h；

(10)将冷藏后的上清液倾倒，收集沉淀；

(11)将上述沉淀在80℃条件下烘干，粉碎过80目筛，得到米糠多糖2。

对比例3

(1)将米糠粕进行粉碎，过80目筛；

(2)称取过筛后的米糠粕2kg，与α-淀粉酶、中性蛋白酶进行混合，其中α-淀粉酶的添加量为120u/g米糠粕，中性蛋白酶的添加量为5000u/g米糠粕；

(3)将混合后的物料按固液质量比1:25加水进行配料，搅拌均匀后，在水力振荡设备中处理12min，温度为室温；

(4)将上述提取混合物用柠檬酸调ph为4.5，分别加入植酸酶、木聚糖酶和纤维素酶，酶解温度55℃，酶解时间2.5h，其中植酸酶的添加量为180u/g米糠粕、木聚糖酶添加量为4000u/g米糠粕、纤维素酶添加量为1000u/g米糠粕；

(5)将酶解液升温到90℃，保温10min；

(6)将灭酶后的混合液离心，转数为4000r/min，离心时间10min，收集上清液；

(7)将离心上清液在85℃减压浓缩，浓缩液的体积与原液体积的比值为1:10；

(8)将多糖浓缩液离心，转数为4000r/min，离心时间20min，收集上清液；

(9)将多糖浓缩上清液中加入2倍体积的无水乙醇，4℃冷藏12h；

(10)将冷藏后的上清液倾倒，收集沉淀；

(11)将上述沉淀在85℃条件下烘干，粉碎过80目筛，得到米糠多糖3。

对比例及实施例制得的米糠多糖、米糠多糖锌螯合物得率、多糖含量、锌含量的测定：

按公式：得率/％＝米糠多糖质量(米糠多糖锌螯合物质量)/米糠粕质量×100，计算对比例及实施例中米糠多糖、米糠多糖锌螯合物的得率。

按照中华人民共和国出入境检验检疫行业标准sn/t4260-2015：出口植物源食品中粗多糖的测定(苯酚-硫酸法)测定样品中多糖含量。

采用原子吸收分光光度计测定样品中锌的含量，结果如表1所示。

表1螯合前后得率、多糖含量及锌含量的变化

对比例及实施例制得的米糠多糖、米糠多糖锌螯合物抗氧化能力的测定

(1)dpph自由基清除能力的测定：

将对比例及实施例中制备的米糠多糖、米糠多糖锌螯合物配成浓度梯度为0.2、0.4、0.6、0.8和1.0mg/ml的待检测溶液，吸取1ml待测液，分别加入0.2mmol/l的dpph乙醇溶液3ml，混匀后置暗处，室温反应30min后，以蒸馏水调零点，在517nm处测定空白管的吸光值ac、样品管的吸光值as。以vc作为阳性对照。

半抑制浓度ic50，根据浓度-清除率二维曲线上读取的清除率为50％时对应的浓度值计算。

按公式：清除率/％＝(ac-as)/ac×100，计算dpph自由基的清除率。

由图1可知，米糠多糖和米糠多糖锌螯合物都对dpph·有一定的清除作用，而且在0.2～1.0mg/ml浓度范围内随着浓度的升高清除率逐渐增大，呈现量-效关系，vc浓度为0.2mg/ml时，对dpph自由基的清除率已经超过90％，米糠多糖锌螯合物3清除dpph自由基的能力最强，当浓度为1.0mg/ml时，对dpph自由基的清除率超过90％。经计算，米糠多糖1、米糠多糖2、米糠多糖3的ic50值接近，为0.73mg/ml，米糠多糖锌螯合物1、米糠多糖锌螯合物2、米糠多糖锌螯合物3的ic50分别为：0.65mg/ml、0.56mg/ml、0.45mg/ml，表明随着米糠多糖中锌螯合量的增加，米糠多糖锌螯合物清除dpph·的效果逐渐增强。

(2)羟基自由基(·oh)清除能力的测定：

将对比例及实施例中制备的米糠多糖、米糠多糖锌螯合物配成浓度梯度为0.1、0.2、0.3、0.4和0.5mg/ml的待检测溶液，吸取1ml待测液，分别加入10mmol/l的feso41ml，10mmol/l水杨酸-乙醇溶液1ml，最后加入8.8mmol/l的h2o21ml启动反应，37℃反应30min，在510nm下测定空白管的吸光值ac、样品管的吸光值as。以vc作为阳性对照。

半抑制浓度ic50，根据浓度-清除率二维曲线上读取的清除率为50％时对应的浓度值计算。

按公式：清除率/％＝(ac-as)/ac×100，计算羟基自由基的清除率。

由图2可知，米糠多糖和米糠多糖锌螯合物都对·oh有一定的清除作用，而且在0.1～0.5mg/ml浓度范围内随着浓度的升高清除率逐渐增大，呈现量-效关系，米糠多糖锌螯合物3清除oh自由基的能力最强，当浓度为0.5mg/ml时，对oh自由基的清除率超过85％。经计算，米糠多糖1、米糠多糖2、米糠多糖3的ic50值接近，为0.38mg/ml，米糠多糖锌螯合物1、米糠多糖锌螯合物2、米糠多糖锌螯合物3、vc的ic50分别为：0.33mg/ml、0.28mg/ml、0.24mg/ml、0.20mg/ml，表明随着米糠多糖中锌螯合量的增加，米糠多糖锌螯合物清除·oh的效果逐渐增强。

本发明通过新型提取技术-水力振荡和酶解的复配使用，实现了米糠多糖短时高效的提取，水力振荡处理10min、酶解不超过2.5h，即可使米糠多糖的得率高于9％，未螯合金属离子前，米糠多糖的纯度高于70％。

本发明应用米糠多糖对锌离子的高效螯合作用，生产了一款锌离子含量高、抗氧化活性强的有机锌螯合产品。可以针对不同需求的人群、不同种类的动物灵活调整锌离子含量，产品可以直接添加到食品中，也可以作为饲料添加剂使用，既营养保健又绿色安全。

以上技术方案阐述了本发明的技术思路，不能以此限定本发明的保护范围，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上技术方案所作的任何改动及修饰，均属于本发明技术方案的保护范围。