本发明涉及一种生物黏附增强型温敏壳聚糖基防粘连水凝胶的制备，及其在预防外科手术术后粘连中的应用，属于医药及卫生
技术领域：
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背景技术：
：：：术后粘连为常见的临床外科手术术后并发症，绝大部分腹腔、关节、盆腔等外科手术后都会发生术后粘连，发病率从50％到97％不等。外科手术后粘连往往会严重危害患者健康，大幅降低患者术后生活质量，给患者带来巨大的精神情绪压力和沉重的经济负担。因此，预防外科手术后粘连对于接受外科手术的患者具有十分重要的意义。目前术后粘连的预防方法主要分为三类：(1)改进手术技术以减少手术创伤；(2)使用抗炎药或者影响纤维蛋白形成/降解平衡的药物；(3)使用屏障材料物理隔离创面，阻止邻近的创伤组织与器官之间直接接触，进而预防术后粘连的形成。改良外科手术技术能够在一定程度上降低术后粘连发生率，减小术后粘连规模，减轻术后粘连发病程度，但无法完全预防粘连形成；防粘连药物在体内代谢与吸收速度较快，存留时间较短，而且可能会影响伤口的正常愈合过程；目前防粘连物理屏障产品的开发与改进是预防术后粘连的重点。目前已上市的防粘连屏障产品存在一定的缺陷：生物安全性较差，临床使用后不良反应报道较多；对术后创面尤其是不规则创面贴合程度和覆盖程度差；生物黏附力不足，容易从作用部位移动或者脱落，影响防粘连屏障效果，或者需要额外缝合固定，给患者带来额外负担；作用部位保留时间过短，在术后粘连形成的关键期7天内就被降解；材料价格昂贵，患者难以负担等。壳聚糖是近些年生物医用高分子材料领域的研究热点。壳聚糖基材料组织生物相容性好，生物可降解且体内保留时间适宜，有抗菌活性和抗炎活性。同时壳聚糖具有较好的化学改性潜力，原料价廉易得。在壳聚糖分子链上的-nh2、-c6-oh上引入羟丁基基团即制得具有温敏性能的壳聚糖衍生物-羟丁基壳聚糖(hbc)。hbc在略低于室温的储存温度下为流动性良好的液体，方便注射使用，注射到创口时可以快速流动覆盖不规则的创面，在生理温度下可以迅速发生相变形成水凝胶屏障，隔离创面附近相邻的组织或器官表面，阻止术后粘连发生。在壳聚糖分子链上的-nh2上通过酰胺化等反应引入巯基基团即制得巯基化壳聚糖(cs-sh)。巯基化壳聚糖上的巯基可以和生物黏膜中含有丰富半胱氨酸的蛋白通过氧化反应或巯基-二硫键交换形成二硫键，显著增强凝胶体系的生物黏附能力，使凝胶能够牢固黏附在术后湿润不规则的创面，不易脱落和移动。羟丁基壳聚糖和巯基化壳聚糖等壳聚糖基水凝胶混合相容性好，将制得的hbc水溶液和cs-sh水溶液按照适宜比例进行物理混合，制备既保留hbc温度敏感能力又保留cs-sh增强的生物黏附能力的生物黏附增强型温敏壳聚糖基防粘连水凝胶hbc/cs-sh。hbc/cs-sh的温敏性能使水凝胶注射到创面后可以快速流动贴合覆盖不规则创面，并迅速形成水凝胶屏障隔离相邻组织或器官表面；增强的生物黏附能力使水凝胶可以持续黏附在创面发挥防粘连物理屏障作用，不易移动或脱落。综上所述，对壳聚糖进行化学接枝改性制得羟丁基壳聚糖(hbc)和巯基化壳聚糖(cs-sh)，将羟丁基壳聚糖溶液和巯基化壳聚糖溶液按一定比例混合制得生物黏附增强型温敏壳聚糖基防粘连水凝胶hbc/cs-sh。该方法制得的生物黏附增强型温敏壳聚糖基防粘连水凝胶性能优良，可满足术后防粘连的需求。技术实现要素：本发明的目的是针对目前市售的防粘连产品存在的缺陷，开发具有理想术后防粘连效果的水凝胶材料。在壳聚糖分子链上的-nh2、-c6-oh上引入羟丁基基团即制得具有温敏性能的羟丁基壳聚糖(hbc)，在壳聚糖分子链上的-nh2上引入巯基基团即制得巯基化壳聚糖cs-sh，将制得的hbc水溶液和cs-sh水溶液按照适宜比例进行物理混合，制备既保留hbc温度敏感能力又保留cs-sh增强的生物黏附能力的生物黏附增强型温敏壳聚糖基防粘连水凝胶hbc/cs-sh。本发明所述的水凝胶，制备过程主要包括以下步骤：(1)羟丁基壳聚糖(hbc)制备1)碱化：将壳聚糖(cs)放入氢氧化钾或氢氧化钠水溶液中充分分散碱化12-24h，备用；2)异丙醇/水体系分散：用异丙醇和去离子混合得到异丙醇水溶液，用异丙醇水溶液充分搅拌分散碱化后的壳聚糖，搅拌分散时间为12-24h；3)接枝反应：在上述溶液中加入1,2-环氧丁烷，水浴加热搅拌发生接枝反应，反应温度为40-80℃，时间为12-36h，4)调节ph和透析：接枝反应后用酸调ph至5.0-7.0，将反应液装入分子截留量8000-14000da的透析袋中透析；5)冷冻干燥：透析结束后将产物冷冻干燥，冻干后低温密封保存备用；(2)巯基化壳聚糖(cs-sh)制备1)体系一配制：称取n-羟基丁二酰亚胺(nhs)，用n,n-二甲基甲酰胺(dmf)溶解nhs，滴加巯基乙酸(tga)，备用；配置dmf和水的混合溶剂，将1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐(edac)充分溶解；将edac溶液匀速缓慢地滴加入nhs和tga的dmf溶液中，滴加完毕后避光搅拌过夜，得到体系一；2)体系二配制：称取壳聚糖，加入1mhcl溶液使壳聚糖充分酸化溶胀，溶胀后加入去离子水并持续搅拌使壳聚糖充分溶解；3)体系一、体系二混合反应：壳聚糖原料完全溶解后，在持续搅拌的条件下，将体系一溶液体系匀速缓慢滴加到体系二溶液内，滴加完毕后用1mnaoh溶液调节混合体系ph至4.0-6.0，持续搅拌反应；4)调节ph和透析：将反应体系装入截留分子量8000-14000da的透析袋中，先用hcl溶液体系透析，然后用含有nacl的hcl溶液体系透析，最后用hcl溶液体系透析；5)冷冻干燥：透析结束后将产物冷冻干燥，备用；(3)生物黏附增强型温敏壳聚糖基防粘连水凝胶制备将hbc溶液和cs-tga溶液混合，混合比例为v(hbc):v(cs-tga)为6-1:0.5-2，混合后涡旋震荡，静置消去气泡后得到水凝胶hbc/cs-tga。其中，步骤(2)巯基化壳聚糖，所应用的巯基化试剂为巯基乙酸，本方法可以使用的巯基化试剂包括且不限于巯基乙酸(tga)、谷胱甘肽(gsh)、巯基乙胺(mea)、半胱氨酸(cys)、n-乙酰半胱氨酸(nac)等。优选的，本发明所述的水凝胶的制备方法，包括以下步骤：(1)羟丁基壳聚糖制备1)碱化：将壳聚糖(cs)放入到氢氧化钾或氢氧化钠水溶液充分分散碱化12-24h，2)异丙醇/水体系分散：用异丙醇和去离子混合得到的异丙醇水溶液，充分搅拌分散碱化后的壳聚糖，异丙醇和去离子混合比例为6-1:0.5-2，搅拌分散时间为12-24h；3)接枝反应：在上述溶液中，加入1,2-环氧丁烷，水浴加热搅拌发生接枝反应，1,2-环氧丁烷使用量为0.5-2g:40-160ml，反应温度为40-80℃，时间为12-36h；4)调节ph和透析：接枝反应后用1mhcl调ph至5.0-7.0，将反应液装入分子截留量8000-14000da的透析袋中透析；5)冷冻干燥：透析结束后将产物冷冻干燥，冻干后低温密封保存备用；(2)巯基化壳聚糖制备1)体系一配制：按与壳聚糖相对用量2-8g:0.5-2g的比例称取n-羟基丁二酰亚胺(nhs)，用n,n-二甲基甲酰胺(dmf)按0.5-2g:5-20ml的比例溶解nhs，按与壳聚糖相对用量0.5-2g:1-4ml的比例滴加巯基乙酸(tga)；配置dmf和水体积比1:1至1:6的混合溶剂，用混合溶液将1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐(edac)充分溶解，二者的用量比为0.5-2g:5-20ml；将edac溶液匀速缓慢地滴加入nhs和tga的dmf溶液中，滴加完毕后避光搅拌过夜，得到体系一；2)体系二配制：按用量比巯基乙酸(tga)0.5-2g:1-4ml的用量称取壳聚糖，加入1mhcl溶液使壳聚糖充分酸化溶胀2-6h，溶胀后加入去离子水并持续搅拌使壳聚糖充分溶解；3)体系一、体系二混合反应：壳聚糖原料完全溶解后，在持续搅拌的条件下，将体系一溶液体系匀速缓慢滴加到体系二溶液内，滴加完毕后用1mnaoh溶液调节混合体系ph至4.0-6.0，在4℃的条件下封口避光持续搅拌反应；4)调节ph和透析：将反应后的反应体系装入截留分子量8000-14000da的透析袋中，用透析夹夹紧，先用1mhcl溶液体系透析1-3次，然后用含有nacl的1mmhcl溶液体系透析1-3次，最后用0.2mmhcl溶液体系透析1-2次；5)冷冻干燥：透析结束后将产物冷冻干燥，冻干后产物置于冰箱密封保存备用；(3)生物黏附增强型温敏壳聚糖基防粘连水凝胶制备将步骤(1)羟丁基壳聚糖hbc溶液和步骤(2)cs-tga溶液混合，混合比例为6-1:4-0.5，混合后涡旋震荡，静置消去气泡后得到水凝胶hbc/cs-tga。进一步优选的，本发明所述的水凝胶的制备方法，包括以下步骤：(1)羟丁基壳聚糖制备1)碱化：将壳聚糖(cs)放入50％(w/v)的氢氧化钾或氢氧化钠水溶液充分分散碱化12-24h，碱液用量比例为1g:50ml；2)异丙醇/水体系分散：用异丙醇和去离子混合得到的异丙醇水溶液，充分搅拌分散碱化后的壳聚糖，异丙醇和去离子混合比例为3:1-1:1，分散比例为1g:80ml，搅拌分散时间为12-24h；3)接枝反应：在上述溶液中，加入1,2-环氧丁烷，水浴加热搅拌发生接枝反应，1,2-环氧丁烷使用量为1g:80ml，反应温度为40-80℃，时间为12-36h；4)调节ph和透析：接枝反应后用1mhcl调ph至5.0-7.0，将反应液装入分子截留量8000-14000da的透析袋中去离子水透析5次以上；5)冷冻干燥：透析结束后将产物冷冻干燥，冻干后低温密封保存备用；(2)巯基化壳聚糖制备1)体系一配制：按与壳聚糖相对用量4g:1g的比例称取n-羟基丁二酰亚胺(nhs)，用n,n-二甲基甲酰胺(dmf)按1g:10ml的比例溶解nhs，按与壳聚糖相对用量1g:2ml的比例滴加巯基乙酸(tga)；配置dmf和水体积比1:1至1:3的混合溶剂，用混合溶液将1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐(edac)充分溶解，二者的用量比为1g:10ml；将edac溶液匀速缓慢地滴加入nhs和tga的dmf溶液中，滴加完毕后避光搅拌过夜，得到体系一；2)体系二配制：按用量比巯基乙酸(tga)1g:2ml的用量称取壳聚糖，加入1mhcl溶液使壳聚糖充分酸化溶胀2-6h，加入量为1g:5ml，溶胀后加入去离子水并持续搅拌使壳聚糖充分溶解，去离子水加入量为1g:50ml；3)体系一、体系二混合反应：壳聚糖原料完全溶解后，在持续搅拌的条件下，将体系一溶液体系匀速缓慢滴加到体系二溶液内，滴加完毕后用1mnaoh溶液调节混合体系ph至4.0-6.0，在4℃的条件下封口避光持续搅拌反应4-5h；4)调节ph和透析：将反应后的反应体系装入截留分子量8000-14000da的透析袋中，用透析夹夹紧，先用1mhcl溶液体系透析2次，然后用含有1％nacl的1mmhcl溶液体系透析2次，最后用0.2mmhcl溶液体系透析1次；5)冷冻干燥：透析结束后将产物冷冻干燥，冻干后产物置于-20℃冰箱密封保存备用；(3)生物黏附增强型温敏壳聚糖基防粘连水凝胶制备按照一定比例的2.5-4.5％(w/v)的hbc水溶液和1.5-3％(w/v)的cs-tga水溶液混合，混合比例为v(hbc):v(cs-tga)为3:1-2:1，混合后涡旋震荡，静置消去气泡后得到生物黏附增强型温敏壳聚糖基防粘连水凝胶hbc/cs-tga。本发明的另一个目的在于提供水凝胶作为手术后防止粘连的医用材料。水凝胶用于防止手术后粘连，包括腹腔、关节、盆腔等外科手术后粘连的发生。水凝胶作为外科手术术后粘连的物理屏障材料。生物黏附增强型温敏壳聚糖基防粘连水凝胶可作为预防腹腔等外科手术术后粘连的物理屏障材料。本发明的优点：(1)无毒，生物安全性好，不会引发炎症和感染等不良反应；(2)可生物降解且降解速度适宜，在术后0-7天粘连形成的关键期内不会被降解；(3)具有温敏性能，在略低于室温的储存温度下为流动性良好的液体，方便注射使用，注射到创口时可以快速流动覆盖不规则的创面，在生理温度下可以迅速发生相变形成水凝胶屏障，隔离创面附近相邻的组织或器官表面，阻止术后粘连发生；(4)具有足够的生物黏附力，可以牢固覆盖在湿润不规则创面，不易从作用部位移或脱落；(5)原料获取容易，成本低廉等。附图说明：图1、羟丁基壳聚糖(hbc)红外光谱图图2、37℃下hbc溶液相变时间随浓度的变化图3、巯基化壳聚糖(cs-tga)红外光谱图图4、hbc/cs-tga可逆温敏相变能力图5、37℃下hbc/cs-tga相变时间随体积混合比例变化关系图图6、生物黏附增强型温敏壳聚糖凝胶hbc/cs-tga流变学曲线图7、hbc水凝胶和hbc/cs-tga水凝胶的最大黏附力和黏附能量对比；a为最大黏附力对比，b为黏附能量对比；**代表hbc/cs-tga与hbc相比存在显著性差异(p<0.01)。图8、凝胶浸提液在l929细胞和huvec细胞的细胞毒。a为l929细胞上各组450nm处吸光度，b为huvec细胞上各组450nm处吸光度。positive：阳性对照组；negative：阴性对照组；a：100％hbc浸提液组；b：75％hbc浸提液组；c：50％hbc浸提液组；d：25％hbc浸提液组；e：100％hbc/cs-tga浸提液组；f：75％hbc/cs-tga浸提液组；g：50％hbc/cs-tga浸提液组；h：25％hbc/cs-tga浸提液组。图9、大鼠背部凝胶皮下注射降解实验a-e为第1周-第5周大鼠背部凝胶残留情况图10、大鼠盲肠-腹腔壁粘连模型上防粘连实验a.空白组(不进行开腹腔造模手术，正常饲养)的大鼠术后粘连情况，结果显示所有大鼠都没有粘连；b.阴性对照组(进行盲肠-腹腔壁术后粘连模型造模，注射生理盐水)的大鼠术后粘连情况，结果显示6只大鼠中只有一只为中度粘连，其他5只均为重度以上粘连；c.对照组1组(进行盲肠-腹腔壁术后粘连模型造模，按5ml/kg的剂量注射2.67％hbc水凝胶)的大鼠术后粘连情况，结果显示6只大鼠中只有2只无术后粘连，1只中度粘连，3只重度粘连；d.对照组2组(进行盲肠-腹腔壁术后粘连模型造模，按5ml/kg的剂量注射3.33％hbc水凝胶)的大鼠术后粘连情况，结果显示6只大鼠中只有1只无术后粘连，1只轻度粘连，2只中度粘连，1只重度粘连，1只重度以上粘连；e.对照组3组(进行盲肠-腹腔壁术后粘连模型造模，按5ml/kg的剂量注射市售医用几丁糖防粘连溶液)的大鼠术后粘连情况，结果显示6只大鼠中只有1只无粘连，1只轻度粘连，3只中度粘连，1只重度以上粘连；f.为实验组(进行盲肠-腹腔壁术后粘连模型造模，按5ml/kg的剂量注射hbc/cs-tga水凝胶)的大鼠术后粘连情况，结果显示6只大鼠中只有1只轻度粘连，其他5只均无术后粘连；g.为低剂量实验组(进行盲肠-腹腔壁术后粘连模型造模，按2ml/kg的剂量注射hbc/cs-tga水凝胶)的大鼠术后粘连情况，结果显示6只大鼠中只有2只中度粘连，其他4只均无术后粘连。图11、大鼠盲肠-腹腔壁粘连模型上防粘连实验粘连程度分级统计结果a-g指代实验组同图10。图12、大鼠盲肠-腹腔壁粘连模型上防粘连实验各组大鼠受损盲肠组织he染色片a-g指代实验组同图10。图13、大鼠盲肠-腹腔壁粘连模型上防粘连实验各组大鼠血清中tgf-β1浓度a-g指代实验组同图10。**表示与b相比p<0.01；#表示与f相比p<0.05；##表示与f相比p<0.01。图14、大鼠盲肠-腹腔壁粘连模型上防粘连实验各组大鼠受损盲肠组织研磨液中il-6浓度a-g指代实验组同图10。**表示与b相比p<0.01。具体实施方式通过以下具体实施例对本发明作进一步的解释和说明，但不作为对于本发明的限制使用。实施例1、羟丁基壳聚糖的合成碱化：分别称取分子量为1000kd、600kd、100kd的壳聚糖300mg置于50ml锥形瓶中，加入50％(w/v)的氢氧化钾水溶液，搅拌，充分溶胀2h，然后在室温下搅拌碱化24h。异丙醇/水体系分散：碱化后的壳聚糖抽滤除去多余的碱液，在4℃条件下静置12h。取10ml异丙醇和10ml去离子水按体积比1:1混合得到异丙醇水溶液，将碱化静置后的壳聚糖加入1:1的异丙醇水溶液中，室温下搅拌24h，至碱化壳聚糖在异丙醇/水体系中完全分散开来。接枝反应：向分散有碱化壳聚糖的异丙醇/水体系逐滴滴加20ml1,2-环氧丁烷，边滴加边搅拌，滴加完毕后在60℃水浴中搅拌反应24h。调节ph和透析：60℃水浴加热搅拌反应结束后静置至室温，用1mhcl溶液逐滴滴加至反应液ph呈中性，然后将反应液装入截留分子量为8000-14000da的透析袋中，用去离子水透析6次以上，每次透析间隔4-6h。冷冻干燥：透析结束后将产物用多个50ml离心管分装，每管装20ml左右，pala膜封口并扎孔，-80℃预冻12h，冷冻干燥72h，冻干后产物即为hbc。实施例2、羟丁基壳聚糖红外光谱测定称取适量的hbc在相对湿度<70％的室温环境条件下与kbr粉末一起研磨，装入样品杯，压片，用傅立叶变换红外光谱仪在4000-400cm-1范围内扫描。hbc的红外光谱如图1所示。3400cm-1左右-oh与-n-h振动吸收峰叠加的强吸收峰是壳聚糖的特征峰，引入羟丁基后壳聚糖特征峰得以保留。2870cm-1-2980cm-1之间的羟丁基碳链中三个-c-h的振动吸收峰和1463cm-1附近新引入羟丁基上的-ch3的吸收峰是hbc的特征峰。由于新引入的羟丁基基团，在1155cm-1附近的-c6-oh的特征带变弱并几乎消失。不同分子量壳聚糖制备的hbc红外光谱证明了羟丁基基团成功接枝到了壳聚糖分子链上，成功制得了不同分子量的hbc。实施例3、羟丁基壳聚糖凝胶液使用浓度确定hbc相变时间的测定采用“试管法”，即取1ml水凝胶加入10ml离心管中，放入37℃水浴中，每隔5s观察是否相变，相变的标准为将离心管倒置放在桌面上，30s内离心管内hbc不沿着管壁流下，离心管从水浴取出来时已经在水浴中浸泡的时间为该温敏凝胶相变时间，精确到5s。配制1.5％-5％(w/v)的hbc水溶液，按照前述方法操作，观察不同浓度hbc溶液在37℃水浴中相变成凝胶的情况并记录下相变时间，绘制相变时间随浓度变化曲线，如图2所示。随着hbc溶液浓度逐渐增大，37℃下相变时间逐渐缩短，但变化幅度越来越小，有趋于平衡的趋势，实际使用时浓度升高羟丁基壳聚糖溶液的流动性会下降，因此为了兼顾温敏凝胶的流动性，确定hbc使用浓度为2.5-4.5％(w/v)。实施例4、巯基化壳聚糖(cs-tga)的合成体系一配制：称取1.2gn-羟基丁二酰亚胺(nhs)于50ml锥形瓶中，用6mldmf充分搅拌溶解，溶解后滴加600μl巯基乙酸(tga)，边搅拌边滴加。称取2.1gedac于50mlep管中，用10mldmf和水体积比1：1的混合溶剂在冰浴的条件下将edac充分溶解。edac充分溶解后将edac溶液匀速缓慢地滴加入nhs和tga的混合dmf溶液中，边搅拌边滴加，滴加完毕后避光搅拌过夜，得到体系一。体系二配制：称取300mg壳聚糖于100ml锥形瓶中，加入5ml0.1m的hcl溶液使壳聚糖充分酸化溶胀4h，溶胀后加入25ml去离子水并持续搅拌使壳聚糖充分溶解。体系一、体系二混合反应：壳聚糖原料完全溶解后，在持续搅拌的条件下，将体系一溶液体系匀速缓慢滴加到壳聚糖稀酸溶液内，滴加完毕后用1mnaoh溶液调节混合体系ph至5.0，在4℃的条件下封口避光持续搅拌反应4-5h。调节ph和透析：将反应4-5h后的反应体系装入分子截留量8000-14000da的透析袋中，用透析夹夹紧，先用1mhcl溶液体系透析2次，然后用含有1％nacl的1mmhcl溶液体系透析2次，最后用0.2mmhcl溶液体系透析1次。每次透析间隔4-6h。冷冻干燥：透析结束后将产物装用多个50ml离心管分装，每管装20ml左右，pala膜封口并扎孔，放入-80℃预冻12h，冷冻干燥72h，冻干产物即为cs-tga。实施例5、巯基化壳聚糖的红外光谱取适量cs-tga真空干燥过夜，在相对湿度<70％的室温环境条件下，与kbr粉末一起研磨后装入样品杯，压片，用傅立叶变换红外光谱仪在4000-400cm-1范围内扫描。从图3可以看出1650cm-1和1590cm-1附近均出现酰胺键特征峰，说明cs-tga和cs-nac中存在酰胺键，发生了酰胺化接枝反应；2500cm-1左右出现的吸收峰是巯基的伸缩振动吸收峰，证明cs-tga中有巯基存在，和预期的结果完全相符。cs-tga的红外光谱证明了巯基乙酸通过形成酰胺键接枝到了壳聚糖分子链上，成功制得了cs-tga。实施例6、巯基化壳聚糖(cs-tga)凝胶液使用浓度确定制得的cs-tga可以溶于去离子水得到0.5％-3.5％(w/v)的凝胶液。在溶解cs-tga时发现，当浓度过高时cs-tga开始难以完全溶解，同时溶液粘度比较大，流动性比较差，因此为了使cs-tga能在水中完全溶解同时能拥有良好的流动性，便于注射使用并流动覆盖不规则创面，我们确定cs-tga使用浓度为1.5-3％(w/v)。实施例7、生物黏附增强型温敏壳聚糖基防粘连水凝胶制备将2.5-4.5％(w/v)的hbc溶液和1.5-3％(w/v)的cs-tga溶液混合，涡旋震荡，静置消去气泡后得到生物黏附增强型温敏壳聚糖基防粘连水凝胶hbc/cs-tga。如图4所示。实施例8、hbc溶液和cs-tga溶液混合比例确定配制混合比例v(hbc):v(cs-tga)为4:1-1.5:1的hbc/cs-tga凝胶1ml于10ml离心管中，每个比例平行配制三份，测定其在37℃水浴中的相变时间。相变时间的测定方法同为“试管法”。最后根据测得的数据绘制37℃下不同v(hbc):v(cs-tga)混合比例的hbc/cs-tga相变时间随体积混合比例变化关系曲线，如图5所示。随着cs-tga比例逐渐增大，hbc的实际浓度逐渐降低，37℃下相变时间逐渐延长，特别是混合比例v(hbc)/v(cs-tga)从2:1变为1.5:1时，相变时间明显延长。cs-tga为hbc/cs-tga水凝胶提供游离巯基，cs-tga含量越高，hbc/cs-tga凝胶中巯基含量越高，黏膜黏附能力理论上越强，综合考虑hbc/cs-tga温敏相变能力和黏膜黏附能力，确定制备hbc/cs-tga的体积混合比例v(4％hbc):v(2％cs-tga)为3:1-2:1。实施例9、流变学测定用旋转流变仪测定hbc/cs-tga弹性模量g’和粘性模量g”随温度变化曲线。旋转流变仪型号为mcr301，德国thermofisherscientific公司生产。测试时向流变仪测试圆平台上滴加400μl凝胶溶液，旋转流变仪的参数设置为：取70个点，温度范围10℃到40℃，升温时间2500s，cs0.5pa应力，频率1hz，转速为6.28rad/s。启动仪器，流变仪会在运行时自动记录流变学数据。图6为hbc/cs-tga流变学曲线。随着温度升高，hbc/cs-tga的弹性模量g’和粘性模量g”都会逐渐升高，且弹性模量g’的变化速度要大于粘性模量g”的变化速度，说明随着温度升高，曲线会由g”大于g’逐渐转变为g’大于g”，证明hbc/cs-tga发生了由液体到固体凝胶的相变。从图6可以看出hbc/cs-tga相变温度在27℃左右。实施例10、生物黏附力测定本实验使用物性仪测定hbc/cs-tga水凝胶对sd大鼠盲肠和腹腔壁的生物黏附能力，并与hbc水凝胶进行对比。物性仪型号为ta.xtplus，英国stablemicrosystems公司生产。第一步，sd大鼠腹腔开腹，取大鼠腹腔内壁裁剪成1.5cm×2.5cm长方形，再取同一只大鼠的盲肠外壁裁剪成1cm×1cm正方形，用ph＝7.4pbs溶液清洗干净。第二步，将物性仪探针下端放置双面胶，将大鼠盲肠外壁牢固粘在探针下方双面胶上；用双面胶将大鼠腹腔内壁固定在装满37℃温水的带盖培养皿上，实验时水凝胶溶液注射在培养皿盖上的大鼠腹腔内壁上；装满37℃温水的带盖培养皿是为了保持大鼠腹腔壁的温度在凝胶的相变温度之上。第三步，设定好物性仪驱动程序参数：加载臂以0.1mm/s的速度下降，直至在盲肠壁与探针间达到2n的压力，保持2.5min，接着以10mm/s速度上升测量臂，直至黏附试剂和生物膜分离。向固定好的大鼠腹腔内壁上滴加200μl凝胶溶液，开始测试。测试结果通过分析软件在显示器上显示为黏附力-位移距离曲线图。黏附力-位移距离曲线的曲线下面积(auc)即为黏附能量(单位：mj)。物性仪测得的hbc/cs-tga水凝胶的最大黏附力和黏附能量如图7所示。我们可以看到hbc/cs-tga水凝胶相比hbc水凝胶，最大黏附力显著增强，p<0.01；黏附能量也显著增强，p<0.01。实施例11、水凝胶浸提液的细胞毒第一步，水凝胶dmem浸提溶液的制备：将hbc/cs-tga水凝胶或hbc水凝胶溶液以体积比1:4的比例，加入到dmem培养液中，在37℃恒温培养箱内静置孵化24h，得到水凝胶dmem培养液浸提液，吸取浸提液上清液作为100％浓度的凝胶浸提液。用dmem培养液将凝胶100％浸提液梯度稀释为75％、50％、25％三个不同浓度的浸提液。第二步，细胞准备：复苏小鼠成纤维细胞(l929)和人脐静脉血管内皮细胞(huvec)，将l929细胞和huvec细胞培养于37℃、相对湿度为90％、co2含量为5％的恒温细胞培养箱中，每两天更换细胞培养液。培养至细胞汇合度达90％左右时，用0.25％胰酶/0.02％edta消化传代，将细胞传代至获得无污染且生长良好的细胞。在96孔培养板每孔中加入5×104/ml浓度的细胞悬液100μl。第三步，实验组对照组设置：阴性对照组：每孔加入100μldmem培养液；阳性对照组：每孔加入100ml含0.5％苯酚的dmem培养液；实验组：每孔加入100μl的25％、50％、75％、100％水凝胶浸提液；每组6孔平行对照第四步，细胞培养方法：将96孔板放入恒温细胞培养箱内培养，24h后更换培养液，48h后在显微镜下观察l929细胞和huvec细胞的生长情况；第五步，cck-8检测：(1)吸出各组每孔中的培养液，用pbs润洗三遍；(2)用dmem配置10％cck-8溶液；(3)每孔加入100μl10％cck-8溶液；(4)在细胞培养箱内继续孵育2小时；(5)用酶标仪在450nm处测定96孔板各孔吸光度；(6)根据测定的吸光度计算各孔细胞的相对增殖率(rgr)。相对增殖率rgr＝实验组吸光度均值/阴性对照组吸光度均值×100％根据医疗器械生物学国家评价标准评定材料毒性程度，结果标准为：材料毒性程度分级0-1级为合格；2级可结合细胞形态和细胞生长密度综合评价是否合格；大于3级为不合格。表1材料毒性程度分级评分标准l929细胞和huvec细胞的cck-8细胞毒实验的结果如图8所示，rgr值及其材料毒性分级如表2和表3所示。由表2可以看出除了25％hbc浸提液组为1级，其余各组均为0级，证明hbc/cs-tga水凝胶和hbc水凝胶在l929细胞系上安全性合格。由表3可以看出所有材料组均为1级，证明hbc/cs-tga凝胶和hbc凝胶在huvec细胞系上安全性合格。上述结果显示hbc和hbc/cs-tga凝胶具有良好的生物相容性，满足作为理想防粘连材料的生物安全性要求。表2l929细胞cck-8细胞毒实验各组rgr值及毒性程度分级表3huvec细胞cck-8细胞毒实验各组rgr值及毒性程度分级实施例12、水凝胶体内降解实验为了验证hbc/cs-tga水凝胶、2.67％hbc水凝胶、3.33％hbc水凝胶在大鼠体内的降解速度，我们在雌性sd大鼠背部进行了水凝胶皮下注射降解实验，以大鼠背部脊柱为中轴线，左上，右上，左下，右下分别编号为1、2、3、4号注射位点。我们还n-乙酰-l-半胱氨酸接枝的巯基化壳聚糖cs-nac替换cs-tga，制得hbc/cs-nac水凝胶，来验证巯基化壳聚糖的种类对体内降解速度是否有影响。1、2、3、4号注射位点注射水凝胶及其用量为：1号位置注射200μlhbc/cs-nac水凝胶；2号位置注射200μlhbc/cs-tga水凝胶；3号位置注射200μl2.67％hbc水凝胶；4号位置200μl3.33％hbc水凝胶。200g左右的雌性sd大鼠18只分为6组，每组3只，分别按图10所示注射相应水凝胶，注射用1ml注射器(针头规格0.45×16twlb)，保证每次注射凝胶量一致且准确。第一周后处死第一组大鼠，剪开背部外皮，观察各个注射位点凝胶降解情况，第二周处死第二组大鼠，以此类推，直至该组所有注射位点的水凝胶都完全降解。图9为每周剪开sd大鼠背部外皮，观察1、2、3、4号注射位点所注射的水凝胶降解情况。大鼠皮下残留的凝胶均已在图中圈出，我们发现第一周1、2、3、4号注射位点都有明显的凝胶块残留，第二周1、2、3、4号注射位点的凝胶块变小，第三周4个注射位点凝胶残留量更小，第四周3号位点的2.67％hbc水凝胶已完全降解，其他位点凝胶残留量也很少，第五周1、2、3、4号位点所注射的水凝胶均完全降解。本实验说明hbc/cs-nac水凝胶、hbc/cs-tga水凝胶、3.33％hbc水凝胶体内完全降解时间都在28-35d之间，浓度较低的2.67％hbc水凝胶体内降解时间在21-28d之间。hbc/cs-tga水凝胶和hbc/cs-nac水凝胶相比，每周凝胶残留大小接近，说明巯基化壳聚糖种类的不同并未造成体内降解时间的差异。术后粘连形成的关键时期是术后0-7d，本实验说明hbc/cs-tga混合水凝胶体内降解速度适宜，在术后0-7d粘连形成的关键期内不会被降解，符合理想防粘连材料的降解时间要求。实施例13、大鼠盲肠-腹腔壁术后粘连模型造模和受损盲肠组织he染色观察第一步，腹腔注射水合氯醛溶液(10％，w/v)麻醉大鼠，麻醉剂量为0.3ml/100g；第二步，大鼠麻醉完成后将大鼠仰卧固定，适当修剪大鼠腹部皮毛，避免后续开腹时皮毛掉入腹腔，75％酒精消毒大鼠腹部；第三步，于大鼠下腹部中线用消毒后的手术剪刀剪开大鼠外皮，再剪开腹腔内皮，用消毒过的手术镊子提出盲肠，用干纱布轻轻擦干盲肠前侧面浆膜，再用手术刀片背部轻刮使盲肠浆膜表面有广泛出血点、轻微渗血为止；第四步，用镊子翻开大鼠盲肠对应位置的腹腔壁，用手术刀片背部轻刮使腹腔壁表面有广泛出血点、轻微渗血为止；第五步，根据不同动物分组所用水凝胶不同，在大鼠盲肠和腹腔壁部位注射一定用量的水凝胶，然后将盲肠放回腹腔，盲肠损伤位置朝向腹腔壁损伤位置；第六步，用手术缝合线逐层缝合，术后两周内每日观察并记录大鼠状态、体重及饮食情况。本实验所用雌性sd大鼠(6周龄，体重200g左右)分组情况及给药种类和剂量如表4所示：表4大鼠盲肠-腹腔壁术后粘连模型防粘连效果评价实验动物分组设置各组大鼠进行造模手术2周后采用椎脱臼法处死，沿大鼠原腹腔切口剪开大鼠腹腔，观察大鼠腹膜粘连情况，进行术后粘连严重程度分级评价，评价依据nair五级分级标准，如表5所示：表5大鼠盲肠-腹腔壁术后粘连模型粘连严重程度分级评价标准实验结果如图10和图11所示，实验组相比阴性对照组和对照组1组、对照组2组、对照组3组防术后粘连效果都明显改善，说明hbc/cs-tga水凝胶具有比2.67％hbc水凝胶、3.33％hbc水凝胶、市售医用几丁糖防粘连溶液更优的预防术后粘连性能。对各组大鼠模型的受损盲肠组织进行he染色观察，对比各组盲肠组织炎性细胞浸润程度和胶原纤维组织增生程度。观察各组大鼠受损盲肠组织的he染色片，如图12所示。黑色圆形虚线框圈的部分表示盲肠受损后增生的结缔组织，内部含有大量纤维蛋白、胶原以及增生的血管；黑色方形虚线框圈住的部分表示盲肠受损后增生结缔组织中增生的血管。大鼠盲肠组织从盲肠内部侧到腹腔侧由内而外分别是黏膜层(皱襞层)、黏膜下层、肌肉层(含有纵行肌、环行肌等)和浆膜层4层结构。空白组由于没有进行造模手术，盲肠各层结构排列清晰可见，排列有序，几乎没有炎细胞浸润；阴性对照组含有大量纤维蛋白和胶原的结缔组织增生严重，粘膜层和粘膜下层血管大量增生，盲肠各层结构难以分辨，增生的结缔组织内胶原和纤维蛋白排列致密且有大量炎细胞浸润；对照组1组、对照组2组和对照组3组相比阴性对照组盲肠各层结构较清晰，也存在结缔组织增生，但结缔组织内部的增生血管比阴性对照组少，炎细胞浸润和胶原纤维量比阴性对照组少；实验组和低剂量实验组盲肠各层结构清晰可见，肌肉层仍能看到造模受损的痕迹，结缔组织增生和胶原纤维沉积程度显相比阴性对照组明显下降，炎症细胞浸润相比阴性对照组明显减少。说明hbc/cs-tga水凝胶防粘连效果优于3.33％hbc凝胶、2.67％hbc凝胶和市售医用几丁糖防粘连溶液。实施例14、与粘连严重程度相关细胞因子检测用elisa试剂盒测各组大鼠致纤维化因子tgf-β1的含量和炎症因子il-6的含量。tgf-β1和il-6检测结果如图13和图14所示，hbc/cs-tga水凝胶能显著抑制tgf-β1和il-6表达，因而能够显著减少术后炎症反应和纤维蛋白沉积，减轻术后粘连的炎症程度。当前第1页12当前第1页12