乳菇薁素、其制备方法以及其应用

本发明涉及天然提取物技术领域，具体而言，涉及乳菇薁素、其制备方法以及其应用。

背景技术：

红汁乳菇是红菇科、乳菇属食药两用的大型真菌，广泛分布于我国湖南、安徽、福建、四川、湖北和广西等地。红汁乳菇中含有多糖、萜类、甾醇类、多酚和脂肪酸等多种生物活性成分。萜类化合物是自然界中分子式以异戊二烯为单位的倍数的烃类及其衍生物，萜类化合物根据异戊二烯的数量来命名和分类，例如单萜(10个碳)，倍半萜(15个碳)，二萜(20个碳)，二倍半萜(25个碳)，三萜(30个碳)和四萜(35个碳)。常见的萜类化合物有：樟科植物中的单萜龙脑和樟脑，菊科植物中的倍半萜青蒿素，动物肝脏中的二萜维生素a以及食用菌中的三萜灵芝酸等。萜类物质所具有的抗炎、抗肿瘤、抗氧化和抑菌等活性，在医药行业具有重大的开发和利用价值。

炎症是对机体损伤的局部组织所呈现的反应，特征是功能障碍、疼痛、发热和红肿等。通常和病原体疾病相关，例如糖尿病、关节炎、肥胖、代谢综合症、癌症和心血管疾病。炎症是由致炎因子刺激细胞(例如巨噬细胞和单核细胞等)开始分泌大量炎症介质例如白介素(il-1β、il-6和il-8)、肿瘤坏死因子(tnf-α)、核因子-kb(nf-kb)、细胞间的粘附分子-1(icam-1)、诱导环氧合酶-2(cox-2)、前列腺素e2(pge2)，5-脂肪氧化酶(5-lox)和诱导一氧化氮合酶(inos)等，这些炎症因子能够介导炎症反应发生。常见的致炎因子有细菌、病毒和真菌等生物性因子，高温及紫外线等损伤的物理因子，酸碱和毒素等化学性因子，还有异物进入机体、组织坏死等都能诱导炎症反应的发生。

临床上使用的抗炎药有甾体抗炎药和非甾体抗炎药，甾体抗炎药抗炎作用强，但有水钠潴留、变虚胖、感染危险和骨质疏松等副作用。非甾体抗炎药主要用于治疗慢性炎症，但同时也会对胃肠道、肾、肝和心血管均有损坏，还有可能引起皮疹和哮喘。因此，应该研发抗炎效果好、副作用低、价格低廉的抗炎药物，以便满足市场和临床需要。研究红汁乳菇中萜类化合物的生物活性，不仅能提高乳菇产品的附加值，促进地方经济发展，同时对医药和保健品的开发具有重大意义。

鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供乳菇薁素、其制备方法以及其应用。本发明实施例提供一种乳菇薁素，其从红菇科乳菇中提取得到，并具有优异的抗炎活性，可以用于制备抗炎的药物。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明提供一种乳菇薁素，其结构式如下所示：

第二方面，本发明提供一种前述实施方式所述的乳菇薁素的制备方法，包括：对含有所述乳菇薁素的乳菇进行提取形成所述乳菇薁素。

第三方面，本发明提供前述实施方式所述的乳菇薁素在制备抗炎药物中的应用。

第四方面，本发明提供前述实施方式所述的乳菇薁素在制备抑制或降低下述任意一种情况的抑制剂中的应用；

(1)il-6、il-1β、tnf-α和inos的mrna的表达；

(2)cox-2、il-1β、il-6、inos和tnf-α蛋白质表达；

(3)p44/42、p38和jnk的磷酸化水平；

(4)制mapks炎症通路的活化。

本发明具有以下有益效果：本发明实施例提供一种新型结构的乳菇薁素，其从红菇科乳菇内提取得到，并具有优异的抗炎活性，继而可以用于制备抗炎药物，进一步扩大了天然提取物中抗炎药物的类型，也扩大了红菇科乳菇的应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例提供的乳菇薁素的制备液相色谱图(a)和纯度分析色谱图(b)；

图2为本发明实施例提供的乳菇薁素的紫外可见图谱；

图3为本发明实施例提供的乳菇薁素的红外图谱；

图4为本发明实施例提供的乳菇薁素的质谱图；

图5为本发明实施例提供的乳菇薁素的核磁氢谱图；

图6为本发明实施例提供的乳菇薁素的合体碳谱图；

图7为本发明对比例提供的高效液相分析图；

图8为本发明实验例1提供的乳菇薁素对巨噬细胞活性的影响结果图；

图9为本发明实验例2提供的乳菇薁素对lps诱导巨噬细胞炎症因子mrna表达的影响结果图，其中，(a)il-6mrna；(b)il-1βmrna；(c)tnf-αmrna；(d)inosmrna；

图10为本发明实验例3提供的乳菇薁素对lps诱导巨噬细胞炎症因子蛋白表达水平影响结果图；其中，(a)cox-2蛋白质；(b)il-1β蛋白质；(c)inos蛋白质；(d)tnf-α蛋白质；(e)il-6蛋白；

图11为本发明实验例4提供的乳菇薁素乳菇薁素对lps诱导巨噬细胞中mapks磷酸化的影响结果图；其中，(a)p-jnk蛋白；(b)p-p38蛋白；(c)p-p44/42蛋白。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明提供一种乳菇薁素，其分子式为c15h16，其结构式如下所示：

本发明提供一种前述实施方式所述的乳菇薁素的制备方法，包括：对含有所述乳菇薁素的乳菇进行提取形成所述乳菇薁素。

具体地，该含有所述乳菇薁素的乳菇为破损的红菇科乳菇，发明人猜测该乳菇薁素是红菇科乳菇破损后，为了修复破损处或者受损后产生了应激反应，才能形成该化合物。总之不论何种原由，需要该红菇科乳菇破损或者受损后才能提取得到该乳菇薁素，若该红菇科乳菇并未破损，则检测不到乳菇薁素，继而不能提取得到该乳菇薁素。其中，上述该红菇科乳菇可以为橙红乳菇或红汁乳菇。

当然可以理解的是，若其他科属的乳菇或者菌子实体破损后能够含有乳菇薁素，也可以对破损后的其他科属的乳菇或菌子实体进行提取，若其他科属的乳菇或菌子实体直接含有乳菇薁素也可以直接对其进行提取。

具体地，制备含有所述乳菇薁素的乳菇的步骤包括：对新鲜摘取的红菇科乳菇进行粉碎，而后静置2小时以上；该红菇科乳菇需要为新鲜摘取的乳菇，且粉碎新鲜摘取的红菇科乳菇，也就是使得红菇科乳菇破损，继而能够形成乳菇薁素，才能在后续提取过程中提取得到该物质。而静置并静置2小时以上，是能够让粉碎或破损的红菇科乳菇充分形成乳菇薁素，有利于提升乳菇薁素的收率。

静置时间为3-4小时较佳，虽然静置时间2小时以上即可，甚至可以达到2天，例如2小时，3小时、4小时、10小时、12小时、18小时、24小时、30小时、36小时等。但是若静置时间过长可能导致红菇科乳菇的子实体内的成分发生改变，影响后续的提取效果。

静置后，进一步对该红菇科乳菇进行进一步粉碎，此处的粉碎主要目的是为了提升乳菇薁素的溶出，继而提升其提取效率。

而后利用有机溶剂进行提取得到提取物，其中，采用的有机溶剂选自酮类溶剂(例如丙酮)、醇类溶剂(例如甲醇)和卤素取代甲烷溶剂(例如氯仿)中的至少一种。

可以理解的是，上述丙酮、甲醇以及氯仿仅仅是对应类型溶剂的举例，只要可以提取得到该乳菇薁素，同类型的其他溶剂例如乙醇、二氯甲烷也可以，甚至其他类型的溶剂，例如环己烷也是可以的。

具体地，将丙酮与含有所述乳菇薁素的所述乳菇混合进行多次浸提；其中，每次浸提的温度为室温(25-30℃)，每次浸提时间为20-36小时，例如为20小时、24小时、30小时、32小时、35小时以及36小时等20-36小时之间的任意数值。

将甲醇和氯仿形成的混合溶剂与含有所述乳菇薁素的所述乳菇混合进行多次提取；其中，提取的温度为(25-30℃)，时间为20-36小时，例如为20小时、24小时、30小时、32小时、35小时以及36小时等20-36小时之间的任意数值，甲醇和氯仿的体积比为1:1-1:2，例如为1:1、1:1.2、1:1.5、1:1.9以及1:2等1:1-1:2之间的任意数值。

需要说明的是，(1)提取的含有所述乳菇薁素的所述乳菇可以是新的未被浸提的乳菇，也可以是上述与丙酮浸提后的乳菇。

(2)多次浸提和多次提取的次数可以是1次、也可以是2次甚至是3次。

(3)上述利用丙酮浸提、甲醇和氯仿混合液进行提取仅仅是举例，并不限于该提取溶剂或方法。

而后合并上述浸提得到的浸提液和提取得到的提取液形成提取物，即提取混合液。可以理解的是，也可以将每次浸提得到的浸提液合并，将每次提取得到的提取液合并，而后再将二者合并形成提取混合液。

接着，对提取物进行浓缩，去除提取物中的溶剂形成粗提取物；而后对粗提取物进行萃取，并收集萃取的有机溶剂部位。

具体地，萃取的步骤包括：利用酯类溶剂和水的混合溶剂进行萃取，并收集酯类部分即有机溶剂部位；其中，酯类溶剂包括乙酸乙酯、乙酸甲酯、甲酸乙酯和甲酸甲酯中的任意一种；酯类溶剂和水的体积比为1:1-1:2；例如为1:1、1:1.2、1:1.5、1:1.9以及1:2等1:1-1:2之间的任意数值。

而后，对酯类部分进行柱层析分离，其中，利用醚类溶剂(例如石油醚)进行洗脱，并收集洗脱液，而后洗脱液进行液相色谱分离纯化制备，其中，液相色谱分离纯化制备的条件包括：流动相包括：醇类溶剂(例如分析级别的纯甲醇溶液)。

本发明实施例还提供一种乳菇薁素的应用，其可以抑制il-6、il-1β、tnf-α和inos的mrna的表达、降低cox-2、il-1β、il-6、inos和tnf-α蛋白质表达、降低p44/42、p38和jnk的磷酸化水平，继而抑制mapks炎症通路的活化，同时，上述情况的实现，可以缓解炎症，因此，该乳菇薁素不仅仅可以用于制备抑制或者调解上述情况的抑制剂，也可以用于制备抗炎药物。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本发明实施例提供一种乳菇薁素的制备方法，包括：

(1)将新鲜的红汁乳菇子实体1.3kg用组织破碎机绞碎，而后室温下静置3小时；

(2)将上述(1)中绞碎的红汁乳菇子实体进一步粉碎，而后，用丙酮(0.5l)室温浸提3次，每次24小时，合并每次丙酮浸提的浸提液，继续用体积比为1：1的甲醇：氯仿的混合溶液(0.5l)提取上述浸提后的红汁乳菇子实体2次，每次24小时，收集并合并每次提取的提取液，再合并上述浸提液和提取液形成提取物，而后，旋蒸除去丙酮、甲醇和氯仿等有机溶剂得到粗提取物，将粗提取物用乙酸乙酯完全溶解，将同等体积的水加入到溶解有粗提取物的乙酸乙酯溶液中萃取3次，弃去水相，收集乙酸乙酯部分，并真空蒸干乙酸乙酯部分得乙酸乙酯浸膏。

(3)称取上样量40倍200-300目的硅胶(150g)，加入石油醚(0.5l)搅成均一无气泡的匀浆，将硅胶匀浆加入到已打开活塞的玻璃层析柱中，待硅胶沉降后继续用石油醚冲洗至柱顶部液面稳定且层析柱无气泡后上样。将上述(2)得到的乙酸乙酯浸膏(5g)用石油醚(25ml)溶解后用滴管滴加到硅胶柱顶部，用石油醚进行洗脱，收集得到蓝色级分。

(4)将蓝色级分用甲醇溶解，以纯甲醇为流动相进行hplc制备纯化。制备液相条件为：流动相为纯甲醇溶液，流速为10ml/min，进样浓度：10mg/ml，进样量为2ml，检测波长为289nm。得到蓝色的目标化合物，参见图1中a。

纯度检测：以纯甲醇为流动相，分析柱为odsc18柱(4.6mm×250mm，5μm)，波长289nm，流速为1ml/min，检测结果参见图1中b，检测得纯度为96.7％。

对本发明实施例提供的乳菇薁素进行表征，结果参见图2-图6，其中，图2为紫外可见光谱图；图3为红外图谱；图4为质谱图；图5为核磁氢谱图；图6为核磁谈谱图。根据图2-图6可知，其表征数据如下：在1523和1421cm^-1处有红外特征吸收峰，表明化合物含有c＝c双键，在2924cm^-1处有吸收峰，则含有-ch3；m/z：197[m+h]⁺，分子量为196，推测其分子式为c15h16；¹h-nmr(dmso-d6,400mhz):8.36(1h,d,j＝2.0hz,h-8),7.69(1h,dd,j＝10.9,2.0hz,h-6),7.64(1h,d,j＝3.8hz,h-2),7.30(1h,d,j＝3.8hz,h-3),7.07(1h,d,j＝10.9hz,h-5),5.37(1h,brs,h-13a),5.20(1h,brs,h-13b),2.79(3h,s,h-14),2.62(3h,s,h-15),2.26(3h,brs,h-12)；¹³c-nmr(dmso-d6,100mhz):146.4(s,c-4),145.1(s,c-11),136.9(s,c-7),136.5(d,c-8),135.0(s,c-10),134.0(d,c-6),132.8(s,c-9),131.7(d,c-5),127.1(s,c-1),124.5(d,c-2),114.4(t,c-13),113.8(d,c-3),23.5(q,c-14),22.9(q,c-12),12.8(q,c-15)。

综合以上所有谱图结果，最终确定蓝色化合物为愈创木烷型倍半萜乳菇薁素，单体为蓝色固体化合物，容易见光分解，其结构式为

对比例1：采用实施例1的制备方法进行提取和分离纯化，区别仅仅在于：未进行步骤(1)，即仅仅是将新鲜的红汁乳菇子实体绞碎后再进一步粉碎，而后直接采用丙酮进行浸提，则在进行绞碎后未进行静置，而后绞碎后直接进行浸提，其与步骤以及操作均与实施例1一致。

在步骤(3)利用石油醚进行柱层析洗脱时，收集的级分不含有本发明实施例的乳菇薁素，具体地，高效液相色谱图结果参见图7，其中样品1(受损)、样品2(未受损)未受损样品，说明提取未受损新鲜红汁乳菇子实体不能分离得到乳菇薁素，需要提取受损的新鲜红汁乳菇子实体才能得到所需的乳菇薁素。

实验例1mts实验

用mts实验确定不同浓度的乳菇薁素对巨噬细胞raw264.7活性的影响，具体实验方法如下：

用胰蛋白酶将对数生长期的巨噬细胞raw264.7制成均匀的混悬液，调整浓度为6x10⁴个/ml，96孔板中接入100μl的细胞悬液，37℃，5％co2培养箱中培养24小时，对照组加入溶剂对照，实验组加入终浓度为25μg/ml、50μg/ml和100μg/ml的实施例1的乳菇薁素，每组实验设置5个复孔用，重复3次，培养24小时后加入mts20μl，避光孵育2小时后加入20μl的10％sds终止反应，酶标仪上测定每孔的od值。

实验结果参见图8，根据图8可知，不同浓度的乳菇薁素对巨噬细胞raw264.7无明显的毒性，故可以进行后续实验。

实验例2pcr检测炎症因子mrna的表达

具体实验方法如下：将浓度为10⁶个/ml的巨噬细胞放入37℃，5％co2培养箱中培养24小时，对照组不做处理，实验组加入lps和乳菇薁素(25μg/ml、50μg/ml和100μg/ml)，lps模型组加入终浓度为1μg/ml的lps，培养2小时后离心提取各组培养液中的rna，继续将rna反转录后进行pcr反应，反应条件为预变性94℃进行3min，94℃变性30s，60℃退火40s，72℃延伸1min，最后循环40。根据2^-δδct(rq)计算炎症因子的mrna表达量。

实验结果参见图9，根据图9可知，不同浓度的乳菇薁素(25μg/ml、50μg/ml和100μg/ml)能明显降低炎症因子il-6、il-1β、tnf-α和inosmrna的表达，且均呈浓度依赖性。

实验例3westernblot检测蛋白质的表达

具体实验方法如下：将巨噬细胞制成浓度为10⁶个/ml的巨噬细胞放入37℃，5％co2培养箱中培养24小时，对照组不做处理，实验组加入lps和乳菇薁素(25μg/ml、50μg/ml和100μg/ml)，lps模型组加入终浓度为1μg/ml的lps，培养24小时后提取各组细胞的蛋白质，将提取到的蛋白质分别进行凝胶电泳，电泳结束后显色拍照，分析计算内参蛋白和目的蛋白条带的平均光密度值。

实验结果参见图10，根据图10可知，不同浓度的乳菇薁素(25μg/ml、50μg/ml和100μg/ml)对炎症因子cox-2、tnf-α和inos的蛋白质表达有明显的抑制效果，且呈浓度依赖性，而100μg/ml的乳菇薁素对il-6和il-1β的表达有显著的抑制效果。

实验例4乳菇薁素对lps诱导巨噬细胞的mapks信号通路影响具体实验方法：

取生长状态良好的、处于对数生长期的巨噬细胞，用d-hanks缓冲液清洗2遍，吸干d-hanks溶液后，用0.25ml浓度为0.25％的胰蛋白酶消化液消化巨噬细胞，使其成为均匀稳定的单细胞混悬液，用微量分光光度计调节细胞悬液的浓度约为106个/ml，将细胞悬液接种到每个培养皿中，使各个培养皿中含有8ml的细胞和培养基的混合液，将混合液置于37℃、5％co2培养箱中培养12-16小时，生长至细胞贴壁后倒掉旧培养基并加入新鲜培养基。空白对照组不加任何药物，实验组先加入不同浓度的乳菇薁素使其终浓度为25μg/ml、50μg/ml和100μg/ml，培养4小时后，加入lps使其终浓度为1μg/ml，而lps模型组仅含有浓度为1μg/ml的脂多糖，将空白对照组、乳菇薁素实验组和lps模型组放入37℃、5％co2培养箱中培养12小时，每组实验设置3个平行。将1ml磷酸酶抑制剂与ripa裂解液混合溶解完全，配制成浓度为10mmol/l的抑制剂工作液。将培养皿中的旧培养基除去，用磷酸盐缓冲液清洗2遍洗净旧培养基，各培养皿中加入0.3ml预冷的磷酸化蛋白提取液ripa蛋白裂解液(终浓度为：磷酸酶抑制剂1mmol/l、pmsf1mmol/l和蛋白酶抑制剂cocktail10％)，在冰上将所有细胞转入1.5ml离心管中，可以用涡旋振荡或移液枪反复吹打细胞来帮助细胞裂解，待细胞在冰上裂解30min后离心(转速13000r/min、4℃离心20min即可)，所得的上层清液就是细胞的磷酸化蛋白。测定磷酸化蛋白的浓度并进行westernblot分析蛋白质的表达情况

实验结果参见图11，根据图11可知，不同浓度的乳菇薁素(25μg/ml、50μg/ml和100μg/ml)可以影响jnk磷酸化蛋白的表达，其中当乳菇薁素浓度达到100μg/ml时，jnk磷酸化蛋白的表达明显降低；不同浓度的乳菇薁素对p-p38蛋白表达的抑制效果几乎一致；浓度为50和100μg/ml乳菇薁素可以明显调节lps刺激的巨噬细胞中p44/42磷酸化蛋白的下降。

综上可知，本发明实施例提供的乳菇薁素不仅对正常的巨噬细胞没有毒性，且可以抑制il-6、il-1β、tnf-α和inos的mrna的表达、降低cox-2、il-1β、il-6、inos和tnf-α蛋白质表达、降低p44/42、p38和jnk的磷酸化水平，继而抑制mapks炎症通路的活化，说明其对lps诱导巨噬细胞raw264.7的炎症反应具有明显的抑制作用，证明乳菇薁素具有良好的抗炎活性，其具有作为抗炎药物的开发潜力。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。