一种合成利司那肽的方法与流程

本发明属于多肽合成领域，特别是涉及一种合成利司那肽的方法。

背景技术：

国际糖尿病联合会(idf)最新发布的第9版糖尿病地图报告指出，“糖尿病是21世纪全球进展最快的紧急情况之一”，正在影响所有年龄段、各个地区的人群。2019年，全球20-79岁人群中约4.63亿人患有糖尿病，绝大多数为2型糖尿病，相当于每11个成人中就有1名患者。

利司那肽（lixisenatide），又译为利西拉来，2016年7月27日美国fda批准赛诺菲生产的lixisenatide（商品名为adlyxin）上市，用于成人2型糖尿病的治疗。利司那肽一天仅需一次注射，原因在于利司那肽与glp-1受体亲和度高，另外，可显著抑制胃排空，因此于餐时作用显著，降低三餐ppg，可作为餐时胰岛素的替代，具有广阔的使用前景。

glp-1的受体广泛分布于胰腺、脑、心脏、肾、胃肠道等，glp-1受体激动剂与glp-1受体结合后通过camp/pka信号通路作用于胰岛细胞，葡萄糖依赖性刺激胰岛素分泌，抑制胰高血糖素分泌；同时可作用于胃肠道延缓胃排空，延缓小肠对葡萄糖的吸收，有利于餐后血糖控制；另外还可抑制中枢神经系统的摄食中枢，有利于控制体重。利司那肽在exendin-4的基础上去掉第38位的脯氨酸，并在39位的丝氨酸连接6个赖氨酸，修饰后的结构提高了药物对抗dpp-4降解的能力，半衰期可延长至3～4h。其氨基酸序列为：h-¹his-gly-glu-gly-⁵thr–phe-thr-ser-asp-¹⁰leu-ser-lys-gln-met-¹⁵glu-glu-glu-ala-val-²⁰arg-leu-phe-ile-glu-²⁵trp-leu-lys-²⁸asn-gly-³⁰gly–pro-ser–ser-gly-³⁵ala–pro-pro-ser-lys-⁴⁰lys-lys-lys-lys–lys-nh2

利司那肽的合成，国内多采用固相fmoc化学法合成，cn102558338b和cn102875663b公开了采用常规的逐步固相合成和纯化利司那肽的方法，由于利司那肽结构中含有44个氨基酸残基，导致采用逐步固相合成的利司那肽的粗肽纯度较低，纯化难度大，总收率低。cn103709243b通过将片段1-2与片段3-44肽树脂，或者将片段1-4与片段5-44肽树脂进行固相缩合；cn103819553a利用固相化学分别合成1-17，18-29和30-44三个肽中间体片段，然后利用液相化学缩合得到利西拉来。cn106928340a采用特定的保护的丝氨酸二肽作为原料偶联到肽序中，由于形成了类似脯氨酸的环状结构，能有效的防止肽键旋转，抑制肽链卷曲剂收缩，使活性官能团(伯胺)充分暴露，从而有利于氨基酸的偶联，减少缺损等副反应的发生；cn104844706b分别合成利西拉来1-2位氨基酸片段、3-4位氨基酸片段、29-30位氨基酸片段、32-33位氨基酸片段、34-35位氨基酸片段，而后采用片段和逐一合成两种方式来制备利司那肽；cn105713082b采用片段20-44肽树脂与片段15-19进行固相缩合，然后逐步偶联剩余氨基酸至固相合成结束；cn104211801a通过液相合成片段fmoc-ser(tbu)-ser(tbu)-gly-ala-oh参与固相合成利司那肽，此工艺既能有效控制杂质di-ser33-利西拉来和di-ala35-利西拉来的含量又不影响利西拉来的收率；以上采用的片段偶联法，与常规的逐步偶联相比，提高了粗肽纯度和纯化收率；但是仍存在，制备工艺较复杂，规模化放大受限等难题。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种合成利司那肽的方法，主要解决现有合成方法存在的合成周期长，生产成本高，产品收率低，不利于后期工业化放大的技术问题。

为实现以上目的，本发明提供以下技术方案：一种合成利司那肽的方法，包括如下步骤：

(a)采用siberamideresins为固相载体，用fmoc-lys(boc)-lys(boc)-oh与之偶联反应制备fmoc-lys(boc)-lys(boc)-siberamideresins，再按序列依次偶联保护氨基酸，得到h-gly-gly-pro-ser(tbu)-ser(tbu)-gly-ala–pro-pro-ser(tbu)-lys(boc)-lys(boc)-lys(boc)-lys(boc)-lys(boc)–lys(boc)-siberamideresins，经裂解得到全保护片段肽29-44:h-gly-³⁰gly-pro-ser(tbu)–ser(tbu)-gly-³⁵ala–pro-pro-ser(tbu)-lys(boc)-⁴⁰lys(boc)-lys(boc)-lys(boc)-lys(boc)–lys(boc)-nh2；

(b)采用氨基树脂为固相载体，用fmoc-asp-all与之偶联反应制备fmoc-asp(氨基树脂)-oall，再按序列依次偶联保护氨基酸，得到片段肽1-28肽树脂boc–¹his(trt)-gly-glu(otbu)-gly-⁵thr(tbu)-phe-thr(tbu)-ser(tbu)-asp(otbu)-¹⁰leu-ser(tbu)-lys(boc)-gln(trt)-met-¹⁵glu(otbu)-glu(otbu)-glu(otbu)-ala-val-²⁰arg(pbf)-leu-phe-ile-glu(otbu)-²⁵trp(boc)-leu-lys(boc)-²⁸asp(氨基树脂)-oall；

(c)用脱all试剂处理片段肽1-28肽树脂，得到boc–¹his(trt)-gly-glu(otbu)-gly-⁵thr(tbu)-phe-thr(tbu)-ser(tbu)-asp(otbu)-¹⁰leu-ser(tbu)-lys(boc)-gln(trt)-met-¹⁵glu(otbu)-glu(otbu)-glu(otbu)-ala-val-²⁰arg(pbf)-leu-phe-ile-glu(otbu)-²⁵trp(boc)-leu-lys(boc)-²⁸asp(氨基树脂)-oh，然后在偶联剂存在下与全保护片段肽29-44反应，得到利司那肽肽树脂：

boc–¹his(trt)-gly-glu(otbu)-gly-⁵thr(tbu)-phe-thr(tbu)-ser(tbu)-asp(otbu)-¹⁰leu-ser(tbu)-lys(boc)-gln(trt)-met-¹⁵glu(otbu)-glu(otbu)-glu(otbu)-ala-val-²⁰arg(pbf)-leu-phe-ile-glu(otbu)-²⁵trp(boc)-leu-lys(boc)-²⁸asp(氨基树脂)-gly-³⁰gly-pro-ser(tbu)–ser(tbu)-gly-³⁵ala–pro-pro-ser(tbu)-lys(boc)-⁴⁰lys(boc)-lys(boc)-lys(boc)-lys(boc)–lys(boc)-nh2；

(b)利司那肽肽树脂经裂解、纯化、冻干得利司那肽精肽：h-¹his-gly-glu-gly-⁵thr-phe-thr-ser-asp-¹⁰leu-ser-lys(boc)-gln-met-¹⁵glu-glu-glu-ala-val-²⁰arg-leu-phe-ile-glu-²⁵trp(boc)-leu-lys-²⁸asn-gly-³⁰gly–pro-ser–ser-gly-³⁵ala–pro-pro-ser-lys-⁴⁰lys-lys-lys-lys–lys-nh2。

优选的，步骤（a）中所述固相载体siberamideresins的替代度为0.2-1.0mmol/g。裂解用的试剂为三氟乙醇、三氟异丙醇与dcm的混合溶剂，体积比优选为1/4。

优选的，步骤（a）中fmoc-lys(boc)-lys(boc)-oh合成的具体操作步骤为：取碱a溶解在溶剂b中，配成碱性溶液；在低温浴下将h-lys(boc)-oh溶解于配置好的碱性溶液中，且溶解后溶液仍显碱性；低温下向反应液中加入fmoc-lys(boc)-osu/溶剂c溶液，滴加完毕后，升温继续搅拌反应，经浓缩、调酸、析晶、重结晶，得到单体fmoc-lys(boc)-lys(boc)-oh。

进一步的，所述的碱a溶解在溶剂b中配成的碱性溶液可以是氨水、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钾等水溶液或与水互溶的有机溶剂的混合溶液；同时也可以是三乙胺、二乙胺、n，n-二异丙基乙胺等有机碱的有机溶液；所述的溶剂c可以是四氢呋喃、二氧六环、n，n-二甲基甲酰胺、丙酮中的一种或一种以上的混合液。

优选的，步骤（a）中29位和30位gly采用二肽单体fmoc-gly-gly-oh作为原料引入，34位gly和35位ala采用二肽单体fmoc-gly-ala-oh作为原料引入，39位和40位lys以及41位和42位lys均采用fmoc-lys(boc)-lys(boc)-oh作为原料引入。

优选的，步骤（b）中1位his和2位gly采用二肽单体boc-his(trt)-gly-oh作为原料引入，3位glu和4位gly采用二肽单体fmoc-glu(otbu)-gly-oh作为原料引入。

优选的，步骤（b）所述的氨基树脂是替代度为0.1-0.8mmol/g的rinkamideresins、rinkamideam-resins和rinkamide-mbharesins中的一种；优选的，偶联反应中所用的缩合剂为以下组合dic/hobt、dic/hoat、tbtu/hobt/dipea、hbtu/hobt/dipea、hatu/hoat/dipea的一种。

优选的，步骤（c）中脱all试剂为pd(pph3)4/chcl3-acoh-n-甲基吗啉(37:2:1)。

优选的，所述步骤（d）中，裂解试剂为加入体积比1-5%清除剂的tfa溶液，所述清除剂为苯甲醚、苯甲硫醚、乙二硫醇、巯基乙醇、苯酚、水和tis中的一种或几种。

相对于现有技术，本发明的有益效果是：

本发明首次采用fmoc-asp-oall的侧链羧基与氨基树脂偶联反应，制备得到片段肽1-28肽树脂，脱掉28位asp的α羧基保护基all，与全保护片段肽29-44偶联，得到利司那肽；与现有技术中的合成方法相比，本发明能够有效的提高粗肽的纯度，降低纯化的难度，提高终产品的收率，有利于合成规模的放大，降低生产成本。

附图说明

图1是利司那肽峰谱图。

图2是利司那肽峰面积结果图。

具体实施方式

下面用具体实施例对本发明进行详细说明，但不限定本专利；根据本发明改变原料的投料比、或是反应溶剂或及缩合剂等，均在本发明的保护范围内。

说明书和权利要求书中所使用的缩写含义如下：

fmoc：9-芴甲氧羰基；

tbu：叔丁基；

pbf：2，2，4，6，7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基；

trt：三苯甲基；

dcm：二氯甲烷；

dmf：n，n-二甲基甲酰胺；

dipea：n，n-二异丙基乙胺；

dic：n，n-二异丙基碳二亚胺；

hbtu：苯并三氮唑-n，n，n'，n'-四甲基脲六氟磷酸盐；

hatu：2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n，n，n'，n'-四甲基脲六氟磷酸酯；

tbtu：o-苯并三氮唑-n，n，n'，n'-四甲基脲四氟硼酸；

hobt：1-羟基苯并三唑；

hoat：1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑；

tfa：三氟乙酸；

tis：三异丙基硅烷；

boc：叔丁氧羰基；

su：琥珀酰亚胺基；

dtt：二硫苏糖醇；

all：烯丙基。

实施例1：fmoc-lys(boc)-lys(boc)-oh的合成

准确称取h-lys(boc)-oh5.92kg(1.0mol)于100l反应釜中，加入10%碳酸钠水溶液24l，搅拌下溶解；待溶清后，低温下滴加入fmoc-lys(boc)-osu11.30kg(2mol)/24l四氢呋喃溶液，搅拌反应，tlc监测终点；经减压浓缩、调酸、乙酸乙酯萃取、干燥、析晶，得纯度99.0%的二肽单体fmoc-lys(boc)-lys(boc)-oh11.16kg，收率80.1%。

实施例2：全保护片段肽29-44的制备

准确称取替代度为0.62mmol/g的siberamideresins484g(合成规模300mmol)置于10l合成釜中，加入5000mldcm溶胀30min；抽滤掉dcm后，5000mldmf洗涤2次，加入20%哌啶/dmf溶液5000ml脱保护2次，分别反应10min和10min；然后用5000mldmf、dcm、dmf分别洗涤2次；依次和fmoc-lys(boc)-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-lys(boc)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-gly-ala-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-gly-gly-oh偶联，得到肽树脂h-gly-gly-pro-ser(tbu)-ser(tbu)-gly-ala–pro-pro-ser(tbu)–lys(boc)-lys(boc)-lys(boc)-lys(boc)-lys(boc)–lys(boc)-siberamideresins；然后用7000ml20%三氟乙醇/dcm(体积比)处理肽树脂60min，再分别用1000ml20%三氟乙醇/dcm(体积比)溶液洗涤两次，合并裂解液和洗涤液，旋蒸掉dcm，加入甲基叔丁基醚20l，析晶，沉降、过滤、洗涤，真空干燥得到672.6g全保护片段肽29-44：h-gly-³⁰gly-pro-ser(tbu)–ser(tbu)-gly-³⁵ala–pro-pro-ser(tbu)-lys(boc)-⁴⁰lys(boc)-lys(boc)-lys(boc)-lys(boc)–lys(boc)-nh2，收率99.52%，纯度95.62%。

实施例3：利司那肽肽树脂的制备

准确称取替代度为0.32mmol/g的rinkamideam-resins62.5g(合成规模20mmol)置于2l合成柱中，加入600mldcm溶胀30min；抽滤掉dcm后，600mldmf洗涤2次，加入20%哌啶/dmf溶液600ml脱保护2次，分别反应10min和10min；然后用600mldmf、dcm、dmf分别洗涤2次；依次和fmoc-asp-oall、fmoc-lys(boc)–oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-met-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-lys(boc)–oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-gly-oh、boc–¹his(trt)-gly-oh偶联，得到片段肽1-28肽树脂boc–¹his(trt)-gly-glu(otbu)-gly-⁵thr(tbu)-phe–thr(tbu)-ser(tbu)-asp(otbu)-¹⁰leu-ser(tbu)-lys(boc)-gln(trt)-met-¹⁵glu(otbu)-glu(otbu)-glu(otbu)-ala-val-²⁰arg(pbf)-leu-phe-ile-glu(otbu)-²⁵trp(boc)-leu-lys(boc)-²⁸asp(氨基树脂)-oall；在氩气保护下向合成柱中加入69.36g(60mmol)pd(pph3)4/700mlchcl3-acoh-n-甲基吗啉(37:2:1)，反应2h后，抽滤掉反应液，然后用700mldmf、dcm、dmf分别洗涤2次；然后准确称取151.37g(60mmlo)实施例2得到全保护片段肽29-44/8.91g(66mmol)hobt/8.32g(66mmol)dic/600mldmf加入反应釜中，室温下反应4h，抽滤掉反应液（加入甲基叔丁基醚回收全保护片段肽29-44），经700mldmf、dcm、甲醇分别洗涤2次，真空干燥后得利司那肽肽树脂132.60g。

实施例4：利司那肽肽树脂的制备

准确称取替代度为0.32mmol/g的rinkamideresins62.5g(合成规模20mmol)置于2l合成柱中，加入600mldcm溶胀30min；抽滤掉dcm后，600mldmf洗涤2次，加入20%哌啶/dmf溶液600ml脱保护2次，分别反应10min和10min；然后用600mldmf、dcm、dmf分别洗涤2次；依次和fmoc-asp-oall、fmoc-lys(boc)–oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-met-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-lys(boc)–oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-gly-oh、boc–¹his(trt)-gly-oh偶联，得到片段肽1-28肽树脂boc–¹his(trt)-gly-glu(otbu)-gly-⁵thr(tbu)-phe–thr(tbu)-ser(tbu)-asp(otbu)-¹⁰leu-ser(tbu)-lys(boc)-gln(trt)-met-¹⁵glu(otbu)-glu(otbu)-glu(otbu)-ala-val-²⁰arg(pbf)-leu-phe-ile-glu(otbu)-²⁵trp(boc)-leu-lys(boc)-²⁸asp(氨基树脂)-oall；在氩气保护下向合成柱中加入69.36g(60mmol)pd(pph3)4/700mlchcl3-acoh-n-甲基吗啉(37:2:1)，反应2h后，抽滤掉反应液，然后用700mldmf、dcm、dmf分别洗涤2次；然后准确称取151.37g(60mmlo)实施例2得到全保护片段肽29-44/8.91g(66mmol)hobt/8.32g(66mmol)dic/600mldmf加入反应釜中，室温下反应4h，抽滤掉反应液（加入甲基叔丁基醚回收全保护片段肽29-44），经700mldmf、dcm、甲醇分别洗涤2次，真空干燥后得利司那肽肽树脂131.80g。

实施例5：利司那肽肽树脂的制备

准确称取替代度为0.30mmol/g的rinkamide–mbha-resins62.7g(合成规模20mmol)置于2l合成柱中，加入600mldcm溶胀30min；抽滤掉dcm后，600mldmf洗涤2次，加入20%哌啶/dmf溶液600ml脱保护2次，分别反应10min和10min；然后用600mldmf、dcm、dmf分别洗涤2次；依次和fmoc-asp-oall、fmoc-lys(boc)–oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-met-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-lys(boc)–oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-gly-oh、boc–¹his(trt)-gly-oh偶联，得到片段肽1-28肽树脂boc–¹his(trt)-gly-glu(otbu)-gly-⁵thr(tbu)-phe–thr(tbu)-ser(tbu)-asp(otbu)-¹⁰leu-ser(tbu)-lys(boc)-gln(trt)-met-¹⁵glu(otbu)-glu(otbu)-glu(otbu)-ala-val-²⁰arg(pbf)-leu-phe-ile-glu(otbu)-²⁵trp(boc)-leu-lys(boc)-²⁸asp(氨基树脂)-oall；在氩气保护下向合成柱中加入69.36g(60mmol)pd(pph3)4/700mlchcl3-acoh-n-甲基吗啉(37:2:1)，反应2h后，抽滤掉反应液，然后用700mldmf、dcm、dmf分别洗涤2次；然后准确称取151.37g(60mmlo)实施例2得到全保护片段肽29-44/8.91g(66mmol)hobt/8.32g(66mmol)dic/600mldmf加入反应釜中，室温下反应4h，抽滤掉反应液（加入甲基叔丁基醚回收全保护片段肽29-44），经700mldmf、dcm、甲醇分别洗涤2次，真空干燥后得利司那肽肽树脂132.90g。

实施例6：利司那肽肽树脂的裂解

将实施例3得到的130g肽树脂，加入到冷冻的1300ml裂解液(体积配比为tfa/苯甲硫醚/tis/h20=90/5/2.5/2.5)中，室温下搅拌反应4h；裂解反应结束，过滤树脂，130mltfa洗涤树脂2次，合并滤液和洗液，倒入16l冷冻甲叔醚中，析出白色沉淀；静置30min后，过滤，甲叔醚洗涤6次，真空干燥得粗肽94.90g，粗肽收率99.62%，纯度72.68%。

实施例7：利司那肽肽树脂的裂解

将实施例4得到的130g肽树脂，加入到冷冻的1300ml裂解液(体积配比为tfa/苯甲硫醚/tis/h20=90/5/2.5/2.5)中，室温下搅拌反应4h；裂解反应结束，过滤树脂，130mltfa洗涤树脂2次，合并滤液和洗液，倒入16l冷冻甲叔醚中，析出白色沉淀；静置30min后，过滤，甲叔醚洗涤6次，真空干燥得粗肽94.20g，粗肽收率98.29%，纯度73.82%。

实施例8：利司那肽肽树脂的裂解

将实施例5得到的130g肽树脂，加入到冷冻的1300ml裂解液(体积配比为tfa/苯甲硫醚/tis/h20=90/5/2.5/2.5)中，室温下搅拌反应4h；裂解反应结束，过滤树脂，130mltfa洗涤树脂2次，合并滤液和洗液，倒入16l冷冻甲叔醚中，析出白色沉淀；静置30min后，过滤，甲叔醚洗涤6次，真空干燥得粗肽95.00g，粗肽收率99.95%，纯度74.60%。

实施例9：利司那肽的纯化

将实施例6所得粗肽溶液用0.45um滤膜过滤备用。

内径为150mmc18制备柱，流动相为0.1%tfa/水-0.1%tfa/乙腈体系，上样量为30g/次，流速500ml/min，梯度洗脱；峰前和峰后循环进样，得到中控分析纯度合格的精肽溶液，脱盐后冻干得精肽49.67g，收率52.14.0%，纯度99.86%，单杂均小于0.2%.

实施例10：利司那肽的纯化

将实施例7所得粗肽溶液用0.45um滤膜过滤备用。

内径为150mmc18制备柱，流动相为0.1%tfa/水-0.1%tfa/乙腈体系，上样量为30g/次，流速500ml/min，梯度洗脱；峰前和峰后循环进样，得到中控分析纯度合格的精肽溶液，脱盐后冻干得精肽48.92g，收率51.04%，纯度99.80%，单杂均小于0.2%.

实施例11：利司那肽的纯化

将实施例8所得粗肽溶液用0.45um滤膜过滤备用。

内径为150mmc18制备柱，流动相为0.1%tfa/水-0.1%tfa/乙腈体系，上样量为30g/次，流速500ml/min，梯度洗脱；峰前和峰后循环进样，得到中控分析纯度合格的精肽溶液，脱盐后冻干得精肽48.62g，收率51.15%，纯度99.74%，单杂均小于0.2%。利司那肽精肽的纯度谱图见图1和图2，图1是利司那肽峰谱图，图2是利司那肽峰面积结果图。