一种绿色荧光蛋白Clover4及其衍生的基于生物发光共振能量转移的探针和应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种绿色荧光蛋白clover4及其衍生的bret血清抗体检测系统。

背景技术：

生物发光共振能量转移技术

生物发光由于其不需要光激发，背景低特点，已成为活体光学成像的重要手段之一。然而荧光素酶(通过催化底物的生化反应而产生光子)不仅量子产率低，而且发射光子的波长较短，因此限制其在动物体内的应用。基于荧光素酶和荧光蛋白的生物发光共振能量转移(bret)技术则很好的解决了上述问题。生物发光共振能量转移(bret)作为一种高效的光学“分子尺”，其技术原理是建立在非辐射能量转移的基础上，通过分子间的电偶极相互作用，将荧光素酶供体激发态能量转移到荧光蛋白受体激发态的过程(xuy,pistondw,johnsonch.abioluminescenceresonanceenergytransfer(bret)system:applicationtointeractingcircadianclockproteins.proceedingsofthenationalacademyofsciences,1999,96(1):151-156.)只有当能量供体荧光素酶的发射谱与能量荧光受体(如荧光蛋白)的激发谱相重叠，且供体和受体之间的空间距离接近(<10nm)时，供体可催化底物释放光信号，光信号能量(部分或全部)转移给受体分子，而使受体分子产生光信号。这是单一液相内实现的均相检测技术，无需任何固体介质(磁珠、微球等)的参与，近十几年受到了广大学者们的广泛关注。由于无需外源激发光源(背景信号低)和操作简单，该技术可以实现快速的高灵敏度检测，已被广泛用于生物医学基础研究和高通量药物筛选。

血清抗体检测mneongreen-lumabs系统

体外诊断的bret检测几年来逐渐兴起，但研究非常少，仅集中在抗体的检测。2016年，maartenmerkx实验室通过对已有抗体检测探针absense的改造，首次实现了用于血浆内抗体的智能手机即时分析bret检测技术，并将该检测系统命名为lumabs(artsr,h.i.,zijlemase,thijssenv,beelenshe,merkxm.detectionofantibodiesinbloodplasmausingbioluminescentsensorproteinsandasmartphone.analyticalchemistry88(8),4525–4532(2016).)。该系统在荧光素酶nluc和绿色荧光蛋白mneongreen之间定向引入不同的帮助结构域，构建成了一个分子内bret探针。该探针在无抗体情况下，nluc与mneongreen之间存在较高的bret效率，发出绿色荧光；当存在抗体时，抗体与lumabs系统中抗原标签特异结合，使得nluc与mneongreen远离，bret效率降低，发出蓝色荧光。当应用于检测体系时，检测bret探针可针对血浆内抗体靶向设计，保证了检测的高特异，为未来临床应用提供了可能性。同时由于探针无需外源光激发，光信号源于荧光素酶催化底物发光的化学氧化过程，有效降低血浆的背景信号，保证了检测的高信噪比；与此同时，除了无需激发光源(光路设计简单)，bret检测步骤简单，使得检测仪器小型化、便携化成为可能，保证了检测的即时性。

在抗体存在的情况下，抗体与mneongreen-lumabs系统中抗原标签特异结合，使得nluc与mneongreen远离，bret效率此时会降到很低的状态，这种由于距离导致的低bret是很难改变的。但是在无抗体情况下，nluc与mneongreen之间的距离小，此时的bret效率主要由nluc和mneongreen这一对共振能量转移对本身决定。此时的bret效率如果高，那么抗体存在与否导致的bret变化(也就是动态范围(dynamicrange))就大，检测灵敏度(sensitivity)就高。然而mneongreen-lumabs系统最大的缺点就在于，其在无抗体情况下的bret效率并不高，导致在实际检测抗体时bret效率仅在较低的区间波动(动态范围小)，这极大限制了血浆中抗体的检测灵敏度，使得这一技术仅限于科学探索，无法进行临床应用。

最早被发现的野生型绿色荧光蛋白(wtgfp)是水母绿色荧光蛋白(avgfp)，由238个氨基酸组成，分子量约27kda。荧光蛋白分子中的ser65-tyr66-gly67在氧气存在的情况下会自发形成发光基团，位于中间，周围由11个β折叠包围形成桶状结构，在紫外光激发下能够发出微弱的绿色荧光(zimmerm.greenfluorescentprotein(gfp)applications,structure,andrelatedphotophysicalbehavior.chemrev,2002,3:759-782.)。经过对水母绿色荧光蛋白发光结构域的特定氨基酸定点改造，高亮度的绿色荧光蛋白clover被研发出来(lamaj,s.-p.f.,gongy,marshalljd,cranfillpj,bairdma,mckeownmr,wiedenmannj,davidsonmw,schnitzermj,tsienry,linmz..improvingfretdynamicrangewithbrightgreenandredfluorescentproteins.naturemethods9,1005–1012(2012).)。除水母绿色荧光蛋白之外，来源于文昌鱼的绿色荧光蛋白mneongreen(shanernc,l.g.,chammasa,niy,cranfillpj,bairdma,sellbr,allenjr,dayrn,israelssonm,davidsonmw,wangj.abrightmonomericgreenfluorescentproteinderivedfrombranchiostomalanceolatum.natmethods10(5),407-409(2013).)，其亮度比clover高一点，均为目前亮度最高的绿色荧光蛋白，但仍无法满足高检测灵敏度的需要。因此，亟需进一步对荧光蛋白进行改造，并设计新的荧光素酶和荧光蛋白bret对。

技术实现要素：

本发明的目的在于：提供一种高性能绿色荧光蛋白，能够提供更高的亮度和更好的单体性和ph稳定性。进一步地，将其与荧光素酶(nluc)构成新的生物发光共振能量转移系统，进而构建的clover4-lumabs系列探针，从而开发bret抗体即时检测系统。所述即时检测系统能够在无抗体情况下具有很高的bret效率，从而在实际检测抗体时具有很大的动态范围和检测灵敏度，使得这一技术真正可以走入临床。

本发明一个方面提供了一种绿色荧光蛋白clover4，所述绿色荧光蛋白的氨基酸序列与clover的氨基酸序列相比，具有以下突变位点：s72a、q80l、s86a、k101e、t153m、q157a、r168y、l178v、a206t、l221v、f223r。

在本发明的一些具体实施方案中，所述绿色荧光蛋白clover4的氨基酸序列如seqidno：1所示。

seqidno：1

mvskgeelftgvvpilveldgdvnghkfsvrgegegdatngkltlkficttgklpvpwptlvttfgygvacfarypdhmklhdffkaampegyvqertisfeddgtyktraevkfegdtlvnrielkgidfkedgnilghkleynfnshnvyimadkakngikanfkiyhnvedgsvqvadhyqqntpigdgpvllpdnhylshqstlskdpnekrdhmvlvervtaagithgmdelyk。

本发明另一个方面提供了编码上述的绿色荧光蛋白clover4的多核苷酸序列。

在本发明的一些具体实施方案中，所述多核苷酸序列具有如seqidno.2所示序列。

seqidno.2

atggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtccgcggcgagggcgagggcgatgccaccaacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccttcggctacggcgtggcctgcttcgccaggtaccccgaccacatgaagctgcacgacttcttcaaggccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatctctttcgaggacgacggtacctacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaacttcaacagccacaacgtctatatcatggccgacaaggccaagaacggcatcaaggctaacttcaagatctaccacaacgttgaggacggcagcgtgcaggtggccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagccatcagtccaccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctggtggagcgcgtgaccgccgccgggattacacatggcatggacgagctgtacaag

本发明再一个方面提供了一种能用于生物发光共振能量转移检测的蛋白对，其包括上述的作为生物发光共振能量转移受体的绿色荧光蛋白clover4，以及生物发光共振能量转移供体。

在本发明的一些具体实施方案中，生物发光共振能量转移供体选自荧光素酶。

本发明再一个方面提供了一种基于生物发光共振能量转移的探针，所述基于生物发光共振能量转移的探针包括上述用于生物发光共振能量转移检测的蛋白对。

在本发明的一些具体实施方案中，所述用于生物发光共振能量转移检测的蛋白对包括上述的生物发光共振能量转移受体以及生物发光共振能量转移供体；生物发光共振能量转移受体为本发明上述绿色荧光蛋白clover4。

在本发明的一些具体的实施方案中，所述基于生物发光共振能量转移的探针还包括包含抗原表位的片段以及帮助结构域。

在本发明的一些具体实施方案中，所述包含抗原表位的片段中的抗原表位选自病毒蛋白中的抗原表位片段。

在本发明的一些具体实施方案中，所述的病毒蛋白为登革病毒、禽流感病毒、艾滋病毒、eb病毒、乙肝病毒或冠状病毒。

在本发明的一些具体实施方案中，登革病毒的抗原表位片段如seqidno.3所示。

在本发明的一些具体实施方案中，禽流感病毒的抗原表位片段如seqidno.4所示。

在本发明的一些具体实施方案中，艾滋病毒的抗原表位片段如seqidno.5所示。

在本发明的一些具体实施方案中，eb病毒的抗原表位片段如seqidno.6或seqidno.7所示。

在本发明的一些具体实施方案中，乙肝病毒的抗原表位片段如seqidno.8所示。

在本发明的一些具体实施方案中，新型冠状病毒的抗原表位片段如seqidno.9所示。

在本发明的一些具体实施方案中，所述的帮助结构域选自sh3/sp1结构域。

在本发明的一些具体的实施方案中，所述的探针中，其中的荧光蛋白clover4还选自：连接原始的n端和c端，在荧光蛋白clover4的其他位点打开肽链所形成的荧光蛋白clover4环化重排(cp)衍生物；并在荧光蛋白clover4衍生物打开位点的n端和c端连接帮助结构域以及包含抗原表位的片段。打开的其他位点例如，在蛋白序列中第2-237位中的任意一个位置，例如第157位或第173位。

本发明再一个方面提供了本发明上述的绿色荧光蛋白clover4，或荧光蛋白clover4的环化重排衍生物作为生物发光共振能量转移检测中的生物发光共振能量转移受体的用途；

所述荧光蛋白clover4的环化重排衍生物为：连接原始如seqidno.1所示的荧光蛋白clover4的n端和c端，并在其他位点打开肽链所形成的环化重排衍生物。

本发明再一个方面提供了本发明上述的绿色荧光蛋白clover4，或荧光蛋白clover4的环化重排衍生物在制备基于生物发光共振能量转移检测的探针或试剂中的用途；

所述荧光蛋白clover4的环化重排衍生物为：连接原始如seqidno.1所示的荧光蛋白clover4的n端和c端，并在其他位点打开肽链所形成的环化重排衍生物。

在本发明的一些具体实施方案中，在上述用途中，所述绿色荧光蛋白clover4与生物发光共振能量转移供体配合使用，优选地，生物发光共振能量转移供体选自荧光素酶。

本发明再一个方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒中包含上述基于生物发光共振能量转移的探针。

在本发明的一些具体实施方案中，所述试剂盒用于血清检测用。

本发明再一个方面提供了上述基于生物发光共振能量转移的探针在制备检测血清中特定抗体的试剂中的用途。

在本发明的一些具体实施方案中，所述特定抗体为能够与探针中的抗原表位相结合的抗体。

在本发明的一些具体实施方案中，所述的检测为定性检测或定量检测。

本发明再一个方面提供了一种检测生物样品中抗体的方法，所述方法包括以上述基于生物发光共振能量转移的探针对待检测物进行检测的步骤。

在本发明的一些具体的实施方案中，所述的检测方法为对待测物中抗体进行定性检测或定量检测。

在本发明的一些具体的实施方案中，所述的待检测物为液体样品，优选为血清样本。

在本发明的一些具体的实施方案中，所述检测方法包括将待测物与所述探针进行接触，并分别观察检测体系中含有待测物或不含待测物时所述探针的生物发光共振能量转移效率。

有益效果

(1)本发明通过荧光蛋白工程，突变筛选出了一种绿色荧光蛋白clover4，其光谱性质与其出发蛋白clover相似，亮度比clover高，单体性及ph稳定性比clover好；

(2)对于七个不同的抗原表位，在没有添加抗体时，clover4-lumabs系列探针在血清中的bret效率(hibret)均高于mneongreen-lumabs探针。其中clover4-hiv、clover4-den1更是高达mneong-hiv、mneong-den1的4-5倍。

(3)对于四个不同的抗原表位，clover4-lumabs系列探针在抗体检测时的动态范围均高于mneongreen-lumabs探针。其中对新冠抗体的检测动态范围更是高达mneongreen探针的20倍。

(4)对于四个不同的抗原表位，clover4-lumabs系列探针在抗体检测时的最低检测限均低于mneongreen-lumabs探针。可以在更低浓度抗体环境下检出抗体，更利于早期诊断。

附图说明

图1中(a)为荧光蛋白clover和clover4的序列，其中标记了clover4突变位点；黑色方框中为发光基团；(b)为clover晶体结构(pdb编号5wj2)；(c)为clover4激发和发射光谱。

图2为clover、mclover3、clover4以及megfp在100μm(a)和5μm(b)浓度下的hplc结果图。出峰越晚(即出峰时体积越大)单体性越强。

图3为clover4的ph稳定性结果。

图4为clover4-lumabs探针结构示意图。

图5为在血清中孵育30分钟后lumabs-hiv探针检测抗体的动态范围和抗体浓度检测范围。(a)mneong-lumabs-hiv(左)和clover4-lumabs-hiv(右)探针的发射光谱图；(b)lumabs-hiv系列探针在无抗体时的发射光谱比较；(c)探针分别在有或无1nmanti-hiv-p17抗体时的bret效率；(d)mneong-lumabs-hiv(左)和clover4-lumabs-hiv(右)探针对0-100nmanti-hiv-p17抗体的滴定曲线。嵌套表:确定检测范围的线性校准曲线。误差线：mean±sd＝3。显著性差异：*，p＜0.001；**，p＜0.05。

图6为未经孵育时lumabs探针的hibret。误差线：mean±sd＝3。显著性差异：*，p＜0.001；**，p＝0.358。

图7为在血清中孵育30分钟后mneong-lumabs(a)和clover4-lumabs(b)系列探针分别在有或无1nm不同抗体时的bret效率。误差线：mean±sd＝3。显著性差异：*，p＜0.001；***，p＜0.05；****，p＝0.823。

具体实施方式

为了使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。

实施例1绿色荧光蛋白clover4的构建和光物理性质检测

(1)对绿色荧光蛋白clover进行晶体结构分析(图1b)，并与同源序列比对，对影响荧光蛋白光谱的关键位点及与其相互作用的氨基酸进行合理设计和定点突变，然后在组成型表达载体pncs上对突变体进行表达和筛选，所用表达菌株为stellar。为确保文库的完整性，每个突变体设置10个克隆，最后通过肉眼分辨以及蓝色led激发光透过橙色丙烯酸滤波器检测突变体的荧光性质，筛选出表达光谱蓝移的荧光蛋白的单克隆。随后进一步对光谱蓝移的突变体荧光蛋白发光基团周围的非保守氨基酸残基进行定点突变，稳定发光基团，筛选出高量子产率(高亮度)的单克隆，命名为clover4，其在clover的基础上突变了11个位点(s72a,q80l,s86a,k101e,t153m,q157a,r168y,l178v,a206t,l221v,f223r)，clover与clover4序列对比结果见图1a。

(2)使用b-perii(购买自皮尔斯公司)对表达clover4的细菌进行裂解，然后采用hispurcobaltresin(购买自皮尔斯公司)纯化蛋白，紧接着通过econo-pac10dg重力流色谱柱(购买自美国bio-rad公司)去盐。完成以上蛋白纯化步骤后，使用lambda35uv/visandls-55荧光光谱仪(购买自perkinelmer公司)检测clover4的单光子激发光谱和发射光谱。如表1和图1c所示，clover4的激发峰为506nm，发射峰为516nm，与clover类似。其在峰值处的消光系数为115mm^-1cm^-1，量子产率为0.77(见表1)，分子亮度为89，比clover高。

(3)将纯化的clover4蛋白分别浓缩至100μm的高浓度和5μm的低浓度，并用高效液相色谱仪(岛津lc20a)进行层析分析，检测蛋白的单体性。如附图2所示，clover4在高浓度和低浓度的情况下单体性均比clover及其另外一个衍生物mclover3(mclover3结构见201910057635.8)更好，其状态更接近一个单体。

(4)将纯化的clover4蛋白浓缩至5mg/ml的高浓度，并使用lambda35uv/visandls-55荧光光谱仪(购买自perkinelmer公司)检测clover4在不同ph值的缓冲液中，被同一波长的激发光激发所发出的荧光读值，并据此计算该蛋白的pka值。如表1和图3所示，clover4的pka值为5.6，比clover、mclover3和mneongreen都更低一点，ph稳定性比clover好。

表1相关绿色荧光蛋白性能表征

表注：a亮度按峰值ec与qy的乘积计算

实施例2clover4在bret及血清抗体检测clover4-lumabs系统中的应用(在探针中mneongreen简写为mneong)

(1)clover4-lumabs-hiv探针

首先分别构建了mneng-lumabs-hiv和clover4-lumabs-hiv探针，探针结构示意图如图4所示，mneng-lumabs-hiv为通过包含hiv抗原表位的序列连接荧光素酶(nluc)和mneongreen的探针，探针中还包括sh3/sp1结构域，而clover4-lumabs-hiv为通过包含hiv抗原表位的序列连接荧光素酶(nluc)和clover4的探针，探针中还包括sh3/sp1结构域。抗原表位见表2。

通过在小牛血清(fbs)中进行测试，检测结果见表3，实验结果显示clover4-lumabs-hiv探针在无抗体条件下的bret效率(hibret)为mneng-lumabs-hiv的4.6倍(其中clover4-lumabs-hiv为14.00，mneng-lumabs-hiv为3.07)。在anti-hiv-p17抗体的检测中，将anti-hiv-p17抗体与上述探针分别进行孵育，孵育时间为30分钟，然后进行检测用于评估探针的动态范围，clover4探针显示出了极大的动态范围(dynamicrange)：807.7±9.9％，是mneongreen的四倍多。动态范围计算公式(hibret^b-lobret)/lobret，其中lobret为抗体存在时的bret效率。hibret^b为无抗体时孵育30分钟后的bret效率，lobret为加入抗体后孵育30分钟后的bret效率。

同时构建了与clover4同一蛋白系列的clover-lumabs-hiv和mclover3-lumabs-hiv探针，其hibret和动态范围均比mneongreen探针小，clover4探针的动态范围是它们的9倍多。说明本发明的探针具有更高的灵敏度。

此外，通过对不同浓度(0-100nm)anti-hiv-p17抗体的滴定，确定了上述四个探针对的检测范围(detectionrange)和最低检测限(limitofdetection，lod)。clover4探针的检测范围为3-120pm，lod根据3σ标准计算为2.5pm。mneongreen、clover和mclover3探针的检测范围分别为20-500pm、25-500pm和30-500pm，lod分别为14pm、24pm和25pm。证明clover4-lumabs-hiv与其它探针相比可以检测到浓度更低的抗体，例如是mclover3-lumabs-hiv探针最低检测限的十分之一。

为分析clover4探针高bret效率的机理，本发明人构建了两个基于环化重排荧光蛋白(cpfp)的clover4衍生物探针cp157clover4-lumabs-hiv和cp173clover4-lumabs-hiv，它们的hibret分别为clover4探针的50％和70％。所述cp157clover4-lumabs-hiv和cp173clover4-lumabs-hiv分别为在clover4荧光蛋白第157位和第173位打开肽链，并在打开位置连接帮助结构域和包含抗原表位的片段。从实验结果来看，clover4衍生物探针cp157clover4-lumabs-hiv和cp173clover4-lumabs-hiv虽然比clover4探针clover4-lumabs-hiv的hibret低，但是其hibret要高于mneong-lumabs-hiv、clover-lumabs-hiv、mclover3-lumabs-hiv。换言之，本发明突变获得的clover4荧光蛋白在生物发光共振能量转移技术探针中极大的提高了探针灵敏度。在探针中，clover4荧光蛋白不同位点打开肽链获得的clover4荧光蛋白衍生物依然为生物发光共振能量转移技术探针带来了超过其他荧光蛋白的、更高的灵敏度和hibret，以及更大的动态范围。

此外，还构建了去除掉sh3/sp1结构域的探针clover4-lumabs-hivw/osh3/sp1，其检测功能基本丧失。

上述lumabs-hiv探针检测数据均见表3或图5。

(2)不同抗原表位的clover4-lumabs系列探针

为了验证clover4-lumabs的适应性，针对不同病毒的不同抗原表位，构建了不同长度和结构的clover4-lumabs系列探针，包括针对禽流感病毒的clover4-lumabs-ha和登革病毒的clover4-lumabs-den1，针对鼻咽癌eb病毒的clover4-lumabs-ebna1和clover4-lumabs-vca，针对乙肝病毒的clover4-lumabs-hbv以及针对新冠病毒的clover4-lumabs-s1rbd探针。本部分所有的病毒及抗原表位(epitope)见表2。

表2相关抗原表位信息

同时，还一一对应地构建了相应的mneongreen探针，即以mneongreen替换clover4构建的探针。结果见附图6，所有的clover4探针的hibret都高于相同抗原表位的mneongreen探针：1)den1，clover4探针是mneongreen探针的5.5倍(clover4探针为16.63，mneongreen探针为3.01)；2)ha，clover4探针是mneongreen探针的2.2倍(clover4探针为6.09，mneongreen探针为2.80)；3)vca，clover4探针是mneongreen探针的3.3倍(clover4探针为4.66，mneongreen探针为1.40)；4)ebna1，clover4探针是mneongreen探针的4.2倍(clover4探针为9.30，mneongreen探针为2.20)；5)hbv，clover4探针是mneongreen探针的1.3倍(clover4探针为3.95，mneongreen探针为3.01)；6)s1-rbd,clover4探针是mneongreen探针的1.9倍(clover4探针为5.60，mneongreen探针为2.88)。

检测clover4-lumabs系列探针对禽流感、登革热和新冠等病毒的抗体的检测效果。结果见图7，所有的clover4探针的动态范围都高于相同抗原表位的mneongreen探针：1)den1，clover4探针是mneongreen探针的5.7倍(clover4探针为498.7±24.4％，mneongreen探针为87.9±3.5％)；2)ha，clover4探针是mneongreen探针的2.5倍(clover4探针为247.8±1.7％，mneongreen探针为99.7±1.6％)；3)s1-rbd,clover4探针是mneongreen探针的20倍(clover4探针为105.9±8.4％，mneongreen探针为5.3±0.8％)。

对这三种病毒的抗体进行了不同浓度(0-100nm)的滴定，以确定检测范围和最低检测限。1)den1，clover4探针的检测范围为8-200pm，lod为7.7pm。mneongreen探针的检测范围分别为25-1000pm，lod为22.7pm。；2)ha，clover4探针的检测范围为8-200pm，lod为7.5pm。mneongreen探针的检测范围分别为300-500pm，lod为25pm。3)s1-rbd,clover4探针的检测范围为20-200pm，lod为15.5pm。mneongreen探针因为结合浓度太高直接无法测算。证明clover4系列探针均比mneongreen系列探针可以检测到浓度更低的抗体。

所有探针检测数据均在表3中列出。

表3lumabs探针检测数据

表注：hibret^a:探针未经孵育；hibret^b:探针孵育30分钟；lod：最低检测限。

sequencelisting

<110>深圳先进技术研究院

<120>一种绿色荧光蛋白clover4及其衍生的基于生物发光共振能量转移的探针和

应用

<130>cp121010311c

<160>9

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>239

<212>prt

<213>人工序列

<400>1

metvalserlysglyglugluleuphethrglyvalvalproileleu

151015

valgluleuaspglyaspvalasnglyhislyspheservalarggly

202530

gluglygluglyaspalathrasnglylysleuthrleulyspheile

354045

cysthrthrglylysleuprovalprotrpprothrleuvalthrthr

505560

pheglytyrglyvalalacysphealaargtyrproasphismetlys

65707580

leuhisaspphephelysalaalametprogluglytyrvalglnglu

859095

argthrileserphegluaspaspglythrtyrlysthrargalaglu

100105110

vallysphegluglyaspthrleuvalasnargilegluleulysgly

115120125

ileaspphelysgluaspglyasnileleuglyhislysleuglutyr

130135140

asnpheasnserhisasnvaltyrilemetalaasplysalalysasn

145150155160

glyilelysalaasnphelysiletyrhisasnvalgluaspglyser

165170175

valglnvalalaasphistyrglnglnasnthrproileglyaspgly

180185190

provalleuleuproaspasnhistyrleuserhisglnserthrleu

195200205

serlysaspproasnglulysargasphismetvalleuvalgluarg

210215220

valthralaalaglyilethrhisglymetaspgluleutyrlys

225230235

<210>2

<211>717

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

atggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggac60

ggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtccgcggcgagggcgagggcgatgccaccaac120

ggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccacc180

ctcgtgaccaccttcggctacggcgtggcctgcttcgccaggtaccccgaccacatgaag240

ctgcacgacttcttcaaggccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatctct300

ttcgaggacgacggtacctacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctg360

gtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcac420

aagctggagtacaacttcaacagccacaacgtctatatcatggccgacaaggccaagaac480

ggcatcaaggctaacttcaagatctaccacaacgttgaggacggcagcgtgcaggtggcc540

gaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccac600

tacctgagccatcagtccaccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtc660

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195200