抗纤维蛋白-2抗体序列、四肽链分子及免疫球蛋白分子

本发明属于病毒抗体技术领域，尤其涉及一种抗血清4型禽腺病毒纤维蛋白-2抗体序列、四肽链分子、免疫球蛋白分子及应用。

背景技术：

血清4型禽腺病毒属于禽腺病毒科禽腺病毒属无囊膜的双链线性dna病毒，外形呈立体对称的二十面体、无囊膜，直径为70-90nm。根据抗原性不同，禽腺病毒可分为禽腺病毒-i群(fowladenovirus，fadvs)、ii群和iii群。根据分子特征和限制性内切酶分析，fadvs可分为a-e5个种，根据血清交叉中和试验结果可分为12个血清型(即1-8a和8b-11)。fadvs感染鸡主要引起肌胃糜烂、包涵体肝炎和心包积液-肝炎综合征等，同时还造成生长缓慢和长时间免疫抑制导致继发感染增加。近年来，国内外fadvs感染呈现明显增加的趋势，给肉鸡养殖业造成了严重的经济损失。

fadvs感染鸡可出现多种病理变化，如鸡包涵体肝炎、肝炎-心包积液综合征、肌胃糜烂等，其中鸡包涵体肝炎主要由血清2、7、8a、8b和ii型fadvs感染引起，发病率高达60-70％，被感染鸡出现突然死亡，死亡率为10-30％；鸡肝炎-心包积液综合征由血清4型fadvs感染引起，主要感染3-6周龄肉鸡，死亡率为30-70％；肌胃糜烂主要由血清i型fadvs感染引起，死亡率为3-8％。血清4型fadvs感染已成为严重影响我国养禽业的重要疾病，给我国养鸡业造成了巨大的经济损失。

针对fadvs感染的诊断和疫苗研究已有报道。目前，检测fadvs的经典方法主要有病毒的分离鉴定、病毒中和实验等；在实际生产中，以分子生物为基础的pcr检测方法是进行病原测定的主要方法，如针对六邻体蛋白基因和纤维蛋白基因进行的pcr方法、针对六邻体蛋白基因进行的pcr-rflp分型方法等是目前主要的诊断方法。研究报道有fadvs灭活疫苗、针对六邻体蛋白和纤维蛋白-2构建的亚单位疫苗等。但有关fadvs的血清学诊断方法和生物学治疗方法较少，仅见个别卵黄抗体的研究报道。

鉴于血清4型fadvs感染造成的严重经济损失，且目前仍无较好的血清学诊断方法和有效治疗药物。因此，为了更好地诊断和治疗该病，研制出抗体效价高、特异性好的抗体用于实验室研究和临床疾病的血清学诊断；研制出免疫保护率高、安全性好、成本低廉、适用于商业化生产的抗血清4型fadvs的抗体用于临床该病的治疗，具有重要的意义。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：有关fadvs的血清学诊断方法和生物学治疗方法较少，仅见个别卵黄抗体的研究报道，且目前仍无较好的血清学诊断方法和有效治疗药物。

解决以上问题及缺陷的难度为：要想得到一定规模的抗体库，首先要做的是借助pcr技术，获取机体本源的全套抗体基因，目前关于鸡源抗体基因序列报道较少，需要我们对抗体轻、重链可变区序列进行多对引物验证。

解决以上问题及缺陷的意义为：有利于筛选到针对特异性抗原的抗体，对后续诊断及治疗效果会更有优势。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种抗血清4型禽腺病毒纤维蛋白-2抗体序列、四肽链分子、免疫球蛋白分子及应用。

本发明是这样实现的，一种抗血清4型禽腺病毒纤维蛋白-2抗体序列，所述抗体序列包括：

所述重链可变区的氨基酸序列为seqidno：1，所述核苷酸序列为seqidno：3；所述轻链可变区的氨基酸序列为seqidno：2，所述核苷酸序列seqidno：4。

本发明的另一目的在于提供一种由所述抗血清4型禽腺病毒纤维蛋白-2抗体序列的重链和轻链通过二硫键连接形成的四肽链分子。

本发明的另一目的在于提供一种包含所述四肽链分子的免疫球蛋白分子。

本发明的另一目的在于提供一种血清4型禽腺病毒的检测方法，所述血清4型禽腺病毒的检测方法使用所述抗体序列。

本发明的另一目的在于提供一种治疗血清4型禽腺病毒感染的单抗制备方法，所述治疗血清4型禽腺病毒感染的单抗制备方法使用所述病毒抗体序列。

本发明的另一目的在于提供一种应用所述抗血清4型禽腺病毒纤维蛋白-2抗体序列对的筛选方法，所述抗体序列对的筛选方法包括以下步骤：

步骤一，噬菌体抗体的制备；

步骤二，噬菌体抗体文库的淘筛；

步骤三，phageelisa方法鉴定抗抗血清4型禽腺病毒纤维蛋白-2鸡源噬菌体单链抗体；

步骤四，将phageelisa鉴定结果为阳性的scfv菌液送测序公司测序，得到鸡源化的抗血清4型禽腺病毒纤维蛋白-2的基因工程抗体的重链、轻链可变区序列。

进一步，步骤一中，所述噬菌体抗体的制备，包括：

将1ml的噬菌体初级抗体库加入到3mlod600＝0.5的xli-blue菌液，37℃放置45min，加入6ml含amp+100μg/ml的lb液体培养基，并按1:1000加入葡萄糖1mol/l继续培养，待菌液od600＝0.5时，加入辅助噬菌体m13k07，放置37℃温箱感染30min后，220rpm/min，37℃培养1h，将菌液3500rpm离心10min，弃上清，用等体积含有amp+100μg/ml、kana50μg/ml的lb液体培养基，以1:1000加入1mol/l的iptg，220rpm/min，37℃，摇菌6h；将培养基12000rpm，离心10-20min，收集上清；以1:4-1:5的比例加入peg8000，颠倒混匀，此时会出现云雾状沉淀，至4℃冰箱过夜；12000rpm离心10min后收集沉淀，用1.5ml1×pbs重悬沉淀，按1:4-1:5的比例再次加入peg8000，颠倒均匀，至4℃冰箱2-3h，12000rpm离心10min，收集沉淀，用300μl1×pbs重悬沉淀，计算输入淘筛的噬菌体量后，待淘选。

进一步，步骤二中，所述噬菌体抗体文库的淘筛，包括：

(1)包被：用0.1mnahco3将纯化后的血清4型禽腺病毒纤维蛋白-2稀释成2μg/ml、4μg/ml和8μg/ml的不同浓度包被96孔酶标板，每孔100μl，放置4℃冰箱过夜；包被完毕后，将96孔酶标板内液体弃掉，每孔加入100μl洗涤缓冲液pbst，清洗3遍；

(2)封闭：每孔加入250μl的封闭液，放入37℃温箱2h进行封闭；

(3)洗涤：每孔加入100μlpbst，共洗涤3次；每次洗涤，用摇板仪以400rpm摇1min，并将酶标板竖立转动一圈，浸润管壁；

(4)加入噬菌体抗体：每孔100μl加入噬菌体抗体，先用摇板仪400rpm/min摇5min，室温孵育1h；

(5)洗涤：重复步骤(3)；

(6)洗脱：每孔50μl加入终止液，摇板仪以1000rpm摇5min；每400μl洗脱液加入75μltris-hcl进行中和；将20μl此液体加入到180μlod600＝0.5的感受态细胞中，感染20min，将20μl菌液涂在含amp+100μg/ml的lb平板上，37℃培养过夜，计算输出的噬菌体库量，并挑取单克隆菌落摇菌，进行pcr鉴定，并送测序；

(7)取上一级噬菌体抗体库总量的90％，加入3mlod600＝0.5的感受态细胞中，感染30min后，加入6mllb液体，并加入终浓度为100μg/ml的氨苄西林和以1:1000加入葡萄糖；待菌液od600＝0.5时加入4×10¹⁰辅助噬菌体m13k07，静置孵育30min后，以220rpm/min振荡培养1h，3500rpm/min离心6min，弃去上清，用等体积含amp+100μg/ml、50μg/mlkana的lb液体培养基重悬沉淀，37℃，220rpm/min振荡培养过夜；将培养基12000rpm，离心10-20min，收集上清；以1:4-1:5的比例加入peg8000，颠倒混匀，此时会出现云雾状沉淀，至4℃冰箱过夜；12000rpm离心10min后收集沉淀，用1.5ml1×pbs重悬沉淀，按1:4-1:5的比例再次加入peg8000，颠倒均匀，至4℃冰箱2-3h，12000rpm离心10min，收集沉淀，用300μl1×pbs重悬沉淀，得到第一轮单链抗体文库；

(8)进行3-4轮噬菌体淘筛，并每次计算输入及输出的噬菌体库量；并将最后一轮噬菌体库加入50％甘油储存在-80℃冰箱。

进一步，步骤三中，所述phageelisa方法鉴定抗抗血清4型禽腺病毒纤维蛋白-2鸡源噬菌体单链抗体，包括：

(1)包被：将纯化后血清4型禽腺病毒纤维蛋白-2用0.1mnahco3稀释成8μg/ml包被96孔酶标板，将bsa设为空白对照，m13k07为阴性对照；

(2)封闭：弃去96孔酶标板中的包被液，每孔200μl封闭液，37℃孵育2h；

(3)洗涤：每孔加入200μlpbst，洗3次，拍干；

(4)加入噬菌体单链抗体：将噬菌体单链抗体与pbst进行1:1混合，每孔200μl加入到96孔酶标板中，室温孵育2h；

(5)洗涤：重复步骤(3)；

(6)敷二抗：按1:5000稀释hrp标记抗m13抗体，37℃孵育1h；

(7)洗涤：重复步骤(3)；

(8)显色：每孔加入50μltmb显色液，用锡箔纸覆盖，37℃反应10min；

(9)终止：每孔加入50μl2mol/l的h2so4终止反应，酶标仪检测od450数值。

进一步，所述抗体序列对的筛选方法，还包括鸡源抗血清4型禽腺病毒单链抗体文库的构建，包括：

(1)鸡外周血淋巴细胞的分离，对5只实验鸡进行血清4型禽腺病毒灭活疫苗免疫；每次免疫间隔2周，共免疫3次，3次免疫后2周，采集新鲜血液5-10ml与全血及组织稀释液混合均匀，比例为1:1-1:2，在15ml的离心管中加入细胞分离液，并轻轻地沿管壁加入等体积的稀释后的抗凝血；水平离心机以转速400g-800g，时间15-25min进行离心，离心后，离心管内液体应分为四层，由上至下分别为：第一层：血浆层；第二层：淋巴细胞层；第三层：分离液和第四层：红细胞层；用吸管小心吸取第二层乳白色的淋巴细胞至另一15ml离心管中，加入10ml的清洗液进行混匀，以250g，10min离心；重复2-3次，弃上清；将管底的淋巴细胞用含有90％胎牛血清、10％dmso和1％双抗的冻存液进行重悬，分装到2ml的冻存管中，4℃冰箱放置30min，-20℃冰箱放置2h，-80℃冰箱过夜，第二天移至液氮的顺序冻存淋巴细胞；

(2)鸡外周血淋巴细胞总rna的提取，将冻存管中的pbmc移至1.5ml离心管中以1800rpm，离心5min，弃掉上清；留有50-100μl的上清在离心管底部，重悬管底细胞；加入1mltrizol，用移液枪反复吹打均匀，至室温孵育5min；加入0.2ml氯仿，用手剧烈震荡15s，至室温孵育2-3min，冷冻离心机以12000rpm，4℃离心15min，此时液体可分为下层含有dna和蛋白质的有机相，和上层含有rna的透明层；离心管倾斜45度，将透明层移至另一1.5ml离心管中；加入0.5ml异丙醇混匀，室温孵育10min后12000rpm离心10min，弃去上清；加入1ml75％乙醇用漩涡振荡器洗涤，7500rpm，4℃，离心5min，弃上清；将离心管放置超净工作台静置干燥5-10min，用至少30μldepc水重悬溶解，超微量分光光度计测定浓度及a260与a280比值，-80℃保存；

(3)鸡重链可变区vh和轻链可变区vl的扩增，以提取的总rna为模板，采用primescript^tmii1ststrandcdnasynthesiskit试剂盒使总rna反转录成cdna，以其为模板，pcr扩增vh基因和vl基因；配制1.5％的琼脂糖凝胶，进行核酸电泳检测鉴定，在凝胶成像仪观察结果，进行胶回收，纯化vh和vl片段；用linker接头的引物通过soe-pcr基因工程方法将重链可变区基因vh分别与轻链可变区基因vl、轻链可变区基因vl组装成scfv基因，形成vl-linker-vh的形式，配制1.0％琼脂糖凝胶，在凝胶成像仪观察结果，进行胶回收，纯化scfv基因片段，将纯化后的scfv基因产物与噬菌体载体pcomb3xss进行酶切与连接；

(4)单链抗体文库的构建，将20μl的的连接产物与80μl电转感受态xli-blue在2.5kv，800ω的条件下进行电击转化，电转杯用1mlsoc培养基进行冲洗，将液体吸至50ml离心管中，220rpm/min，37℃，摇菌45min；分别将10μl、50μl和100μl的菌液涂在含有amp+100μg/ml的平板，鉴定电转效果；在离心管中加入9ml含有amp+100μg/mllb液体培养基，以1:1000加入葡萄糖，220rpm/min，37℃，摇菌至od600＝0.5；加入20μl辅助噬菌体m13k07进行拯救，感染30min后摇菌1h；将菌液3000rpm，离心6min，弃上清，用等体积含有amp+100μg/ml、kana的lb液体培养基，以1:1000加入iptg，220rpm/min，37℃，摇菌6h；将培养基12000rpm/min，离心10-20min，收集上清；以1:4-1:5的比例加入peg8000，颠倒混匀，此时会出现云雾状沉淀，至4℃冰箱过夜，12000rpm离心10min后收集沉淀，用1.5ml1×pbs重悬沉淀，按1:4-1:5的比例再次加入peg8000，颠倒均匀，至4℃冰箱2-3h，12000rpm，离心10min，收集沉淀，用300μl1×pbs重悬沉淀，加入50％甘油混匀，放置-20℃保存，按此方法多次建库，建立scfv噬菌体抗体原始文库。

结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供的鸡源化抗抗血清4型禽腺病毒纤维蛋白-2抗体的重链、轻链的可变区氨基酸序列和核苷酸序列，为构建高亲和力、低免疫原性的鸡源化抗抗血清4型禽腺病毒纤维蛋白-2的基因工程抗体提供支持，对推动鸡源化抗体药物的发展具有重要意义。本发明选取免疫鸡为研究对象，先采集样本的外周血，紧接着再借助离心机对pbmc进行分离，最后基于噬菌体展示法，于噬菌体载体表面来进行鸡源抗体基因的表达，得到针对血清4型禽腺病毒纤维蛋白-2噬菌体单链抗体基因，实现抗体的同动物源化，为血清4型禽腺病毒感染的诊断和治疗提供材料。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的病毒抗体序列对的筛选方法流程图。

图2是本发明实施例提供的vh(420bp)和vl(390bp)基因pcr扩增产物。

图3是本发明实施例提供的scfv基因pcr扩增产物。

图4是本发明实施例提供的单链抗体基因文库构建库量。

图5是本发明实施例提供的抗血清4型禽腺病毒噬菌体抗体结合活性。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种病毒抗体序列、四肽链分子、免疫球蛋白分子及应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。

本发明提供的病毒抗体序列为：重链可变区氨基酸序列seqidno：1和核苷酸序列seqidno：3；轻链可变区氨基酸序列seqidno：2和核苷酸序列seqidno：4。

如图1所示，本发明实施例提供的病毒抗体序列对的筛选方法包括以下步骤：

s101，噬菌体抗体的制备；

s102，噬菌体抗体文库的淘筛；

s103，phageelisa方法鉴定抗血清4型禽腺病毒纤维蛋白-2鸡源噬菌体单链抗体；

s104，将phageelisa鉴定结果为阳性的scfv菌液送测序公司测序，得到鸡源化的抗血清4型禽腺病毒纤维蛋白-2的基因工程抗体的重链、轻链可变区序列。

下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步描述。

实施例1：鸡源抗血清4型禽腺病毒纤维蛋白-2单链抗体文库的构建

1.鸡外周血淋巴细胞的分离

根据国际动物免疫手册，对5只实验鸡进行血清4型禽腺病毒灭活疫苗免疫。每次免疫间隔2周，共免疫3次。3次免疫后2周，采集鸡外周血。取新鲜血液5-10ml与全血及组织稀释液混合均匀，比例为1:1-1:2。在15ml的离心管中加入细胞分离液，并轻轻地沿管壁加入等体积的稀释后的抗凝血。水平离心机以转速400g-800g，时间15min-25min进行离心，离心后，离心管内液体应分为四层，由上至下分别为：第一层：血浆层；第二层：淋巴细胞层；第三层：分离液和第四层：红细胞层。用吸管小心吸取第二层乳白色的淋巴细胞至另一15ml离心管中，加入10ml的清洗液进行混匀，以250g，10min离心。重复2-3次，弃上清。将管底的淋巴细胞用含有90％胎牛血清、10％dmso和1％双抗的冻存液进行重悬，分装到2ml的冻存管中，4℃冰箱放置30min，-20℃冰箱放置2h，-80℃冰箱过夜，第二天移至液氮的顺序冻存淋巴细胞。

2.鸡外周血淋巴细胞总rna的提取

将冻存管中的pbmc移至1.5ml离心管中以1800rpm，离心5min，弃掉上清。留有50μl-100μl的上清在离心管底部，重悬管底细胞。加入1mltrizol，用移液枪反复吹打均匀，至室温孵育5min。加入0.2ml氯仿，用手剧烈震荡15s，至室温孵育2-3min，冷冻离心机以12000rpm，4℃离心15min，此时液体可分为下层含有dna和蛋白质的有机相，和上层含有rna的透明层。离心管倾斜45度，将透明层移至另一1.5ml离心管中。加入0.5ml异丙醇混匀，室温孵育10min后12000rpm离心10min，弃去上清。加入1ml75％乙醇用漩涡振荡器洗涤，7500rpm，4℃，离心5min，弃上清。将离心管放置超净工作台静置干燥5-10min，注意不要让rna太干，用至少30μldepc水重悬溶解，超微量分光光度计测定浓度及a260与a280比值，-80℃保存。

3.鸡重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)的扩增

以提取的总rna为模板，采用primescript^tmii1ststrandcdnasynthesiskit试剂盒使总rna反转录成cdna。以其为模板，引物序列如seqidno：5所示，pcr扩增vh基因和vl基因。配制1.5％的琼脂糖凝胶，进行核酸电泳检测鉴定，在凝胶成像仪观察结果，进行胶回收，纯化vh和vl片段。用linker接头的引物通过soe-pcr基因工程方法将重链可变区基因vh分别与轻链可变区基因vl(lamda)、轻链可变区基因vl(kappa)组装成scfv基因，形成vl-linker-vh的形式。配制1.0％琼脂糖凝胶，在凝胶成像仪观察结果，进行胶回收，纯化scfv基因片段。将纯化后的scfv基因产物与噬菌体载体pcomb3xss进行酶切与连接。

4.单链抗体文库的构建

将20μl的的连接产物与80μl电转感受态xli-blue在2.5kv，800ω的条件下进行电击转化，电转杯用1mlsoc培养基进行冲洗，将液体吸至50ml离心管中，220rpm/min，37℃，摇菌45min。分别将10μl、50μl和100μl的菌液涂在含有amp+(100μg/ml)的平板，鉴定电转效果。在离心管中加入9ml含有amp+(100μg/ml)lb液体培养基，以1：1000加入葡萄糖(1mol/l)，220rpm/min，37℃，摇菌至od600＝0.5。加入20μl辅助噬菌体m13k07进行拯救，感染30min后摇菌1h。将菌液3000rpm，离心6min，弃上清，用等体积含有amp+(100μg/ml)、kana(50μg/ml)的lb液体培养基，以1:1000加入iptg(1mol/l)，220rpm/min，37℃，摇菌6h。将培养基12000rpm/min，离心10-20min，收集上清。以1:4-1:5加入peg8000，颠倒混匀，此时会出现云雾状沉淀，至4℃冰箱过夜。12000rpm离心10min后收集沉淀，用1.5ml1×pbs(ph7.4)重悬沉淀，按1:4-1:5的比例再次加入peg8000，颠倒均匀，至4℃冰箱2-3h，12000rpm,离心10min，收集沉淀，用300μl1×pbs(ph7.4)重悬沉淀，加入50％甘油混匀，放置-20℃保存。按此方法多次建库，建立scfv噬菌体抗体原始文库。

实施例2：鸡源抗血清4型禽腺病毒纤维蛋白-2单链抗体文库的筛选

1.噬菌体抗体的制备

将1ml的噬菌体初级抗体库加入到3mlod600＝0.5的xli-blue菌液，37℃放置45min，加入6ml含amp+(100μg/ml)的lb液体培养基，并按1:1000加入葡萄糖(1mol/l)继续培养，待菌液od600＝0.5时，加入辅助噬菌体m13k07，放置37℃温箱感染30min后，220rpm/min，37℃培养1h，将菌液3500rpm离心10min，弃上清，用等体积含有amp+(100μg/ml)、kana(50μg/ml)的lb液体培养基，以1:1000加入iptg(1mol/l)，220rpm/min，37℃，摇菌6h。将培养基12000rpm，离心10-20min，收集上清。以1:4-1:5加入peg8000，颠倒混匀，此时会出现云雾状沉淀，至4℃冰箱过夜。12000rpm离心10min后收集沉淀，用1.5ml1×pbs(ph7.4)重悬沉淀，按1:4-1:5的比例再次加入peg8000，颠倒均匀，至4℃冰箱2-3h，12000rpm离心10min，收集沉淀，用300μl1×pbs(ph7.4)重悬沉淀，计算输入淘筛的噬菌体量后，待淘选。

2.噬菌体抗体文库的淘筛

(1)包被：用0.1mnahco3将纯化后的血清4型禽腺病毒纤维蛋白-2稀释成2μg/ml、4μg/ml和8μg/ml的不同浓度包被96孔酶标板，每孔100μl，放置4℃冰箱过夜。包被完毕后，将96孔酶标板内液体弃掉，每孔加入100μl洗涤缓冲液pbst，清洗3遍；

(2)封闭：每孔加入250μl的封闭液，放入37℃温箱2h进行封闭；

(3)洗涤：每孔加入100μlpbst，共洗涤3次。每次洗涤，用摇板仪以400rpm摇1min，并将酶标板竖立转动一圈，浸润管壁；

(4)加入噬菌体抗体：每孔100μl加入噬菌体抗体，先用摇板仪400rpm/min摇5min，室温孵育1h；

(5)洗涤：重复步骤(3)；

(6)洗脱：每孔50μl加入终止液，摇板仪以1000rpm摇5min。每400μl洗脱液加入75μltris-hcl进行中和。将20μl此液体加入到180μlod600＝0.5的感受态细胞中，感染20min，将20μl菌液涂在含amp+(100μg/ml)的lb平板上，37℃培养过夜，计算输出的噬菌体库量。并挑取单克隆菌落摇菌，进行pcr鉴定，并送测序；

(7)取上一级噬菌体抗体库总量的90％，加入3mlod600＝0.5的感受态细胞中，感染30min后，加入6mllb液体，并加入终浓度为100μg/ml的氨苄西林和以1:1000加入葡萄糖(1m/l)。待菌液od600＝0.5时加入4×10¹⁰辅助噬菌体m13k07，静置孵育30min后，以220rpm/min振荡培养1h，3500rpm/min离心6min，弃去上清，用等体积含amp+(100μg/ml)、kana(50μg/ml)的lb液体培养基重悬沉淀，37℃，220rpm/min振荡培养过夜；将培养基12000rpm，离心10-20min，收集上清。以1:4-1:5加入peg8000，颠倒混匀，此时会出现云雾状沉淀，至4℃冰箱过夜。12000rpm离心10min后收集沉淀，用1.5ml1×pbs(ph7.4)重悬沉淀，按1:4-1:5的比例再次加入peg8000，颠倒均匀，至4℃冰箱2-3h，12000rpm离心10min，收集沉淀，用300μl1×pbs(ph7.4)重悬沉淀，得到第一轮单链抗体文库；

(8)进行3-4轮噬菌体淘筛，并每次计算输入及输出的噬菌体库量。并将最后一轮噬菌体库加入50％甘油储存在-80℃冰箱。

3.phageelisa方法鉴定抗血清4型禽腺病毒纤维蛋白-2鸡源噬菌体单链抗体

(1)包被：将纯化后血清4型禽腺病毒纤维蛋白-2用0.1mnahco3稀释成8μg/ml包被96孔酶标板，将bsa设为空白对照，m13k07为阴性对照；

(2)封闭：弃去96孔酶标板中的包被液，每孔200μl封闭液，37℃孵育2h；

(3)洗涤：每孔加入200μlpbst，洗3次，拍干；

(4)加入噬菌体单链抗体：将噬菌体单链抗体与pbst进行1:1混合，每孔200μl加入到96孔酶标板中，室温孵育2h；

(5)洗涤：同步骤(3)；

(6)敷二抗：按1:5000稀释hrp标记抗m13抗体，37℃孵育1h；

(7)洗涤：同步骤(3)；

(8)显色：每孔加入50μltmb显色液，用锡箔纸覆盖，37℃反应10min；

(9)终止：每孔加入50μl2mol/l的h2so4终止反应，酶标仪检测od450数值。

将phageelisa鉴定结果为阳性的scfv菌液送测序公司测序，得到鸡源化的抗血清4型禽腺病毒纤维蛋白-2的基因工程抗体的重链、轻链可变区序列。

seqidno：1：重链可变区氨基酸序列

alavalthrleuaspgluserglyglyglyleuglnthrproglyglyglyleuserleuvalcyslysalaserglyphethrphesersertyraspmetalatrpvalargglngluproglylysglyleugluphevalalaalaileasnseralaaspglyargtyrthrglytyrglyseralavallysglyargalathrileserargaspasnglyglnserthrvalargleuglnleuasnasnleuargalagluaspthrglythrtyrphecysalalysseralaglysercysileserthrtyrilephesercysgluserglyserthrileaspalatrpglyhisglythrgluvalilevalserser

seqidno：2：轻链可变区氨基酸序列

glyproalaleuthrglnproserservalseralaasnleuglyglythrvalgluilethrcysserglyglyglytyrsertyrglytrptyrglnglnargserproglyseralaprovalthrleuiletyrgluglythrlysargproserasnileproserargpheserglyserthrserglyserthrhisthrleuthrilethrglyvalglnalagluaspglualavaltyrtyrcysglyserthraspserseralaglytyrvalglyilepheglyalaglythrthrleuthrvalleu

seqidno：3：重链可变区核苷酸序列

gccgtgacgttggacgagtccgggggcggcctccagacgcccggaggagggctcagcctcgtctgcaaggcctccgggtt

caccttcagcagttacgacatggcctgggtgcgacaggagcccggcaaggggctggaattcgtcgctgctattaacagtg

ctgatggtagatacacaggctacgggtcggcggtgaagggccgtgccaccatctcgagggacaacgggcagagcacagtg

aggctgcagctgaacaacctcagggctgaggacaccggcacctacttctgcgccaaaagtgctggtagttgtatttccac

ttacattttcagttgtgaatctggtagtaccatcgacgcatggggccacgggaccgaagtcatcgtctcctccg

seqidno：4：轻链可变区核苷酸序列

ggcccagcgctgactcagccgtcctcggtgtcagcaaacctgggaggaaccgtcgagatcacctgctccgggggtggcta

tagctatggctggtaccagcagaggtctcctggcagtgcccctgtcactctgatctatgaaggcaccaagagaccctcga

acatcccttcacgattctccggttccacatctggctccacacacacattaaccatcactggggtccaagccgaggacgag

gctgtctattactgtgggagcacagacagcagtgctggttatgttggtatatttggggccgggacaaccctgaccgtcct

ag

seqidno：5：扩增重链可变区上游引物

5’-ggtggttcctctagatcttccccgtgacgttggacgagt-3’

扩增重链可变区下游引物

5’-cctggccggcctggccgaggagacgatgacttcg-3’

seqidno：6：

扩增鸡轻链(lamda)上游引物

5’-gggcccaggcggccctgactcagccgtccttcg-3’

扩增鸡轻链(lamda)下游引物

5’-ggaagatctagaggaaccaccacctaggacggtcagggt-3’

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>青岛农业大学

<120>抗纤维蛋白-2抗体序列、四肽链分子及免疫球蛋白分子

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>131

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

alavalthrleuaspgluserglyglyglyleuglnthrproglygly

151015

glyleuserleuvalcyslysalaserglyphethrphesersertyr

202530

aspmetalatrpvalargglngluproglylysglyleuglupheval

354045

alaalaileasnseralaaspglyargtyrthrglytyrglyserala

505560

vallysglyargalathrileserargaspasnglyglnserthrval

65707580

argleuglnleuasnasnleuargalagluaspthrglythrtyrphe

859095

cysalalysseralaglysercysileserthrtyrilephesercys

100105110

gluserglyserthrileaspalatrpglyhisglythrgluvalile

115120125

valserser

130

<210>2

<211>107

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

glyproalaleuthrglnproserservalseralaasnleuglygly

151015

thrvalgluilethrcysserglyglyglytyrsertyrglytrptyr

202530

glnglnargserproglyseralaprovalthrleuiletyrglugly

354045

thrlysargproserasnileproserargpheserglyserthrser

505560

glyserthrhisthrleuthrilethrglyvalglnalagluaspglu

65707580

alavaltyrtyrcysglyserthraspserseralaglytyrvalgly

859095

ilepheglyalaglythrthrleuthrvalleu

100105

<210>3

<211>394

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

gccgtgacgttggacgagtccgggggcggcctccagacgcccggaggagggctcagcctc60

gtctgcaaggcctccgggttcaccttcagcagttacgacatggcctgggtgcgacaggag120

cccggcaaggggctggaattcgtcgctgctattaacagtgctgatggtagatacacaggc180

tacgggtcggcggtgaagggccgtgccaccatctcgagggacaacgggcagagcacagtg240

aggctgcagctgaacaacctcagggctgaggacaccggcacctacttctgcgccaaaagt300

gctggtagttgtatttccacttacattttcagttgtgaatctggtagtaccatcgacgca360

tggggccacgggaccgaagtcatcgtctcctccg394

<210>4

<211>322

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

ggcccagcgctgactcagccgtcctcggtgtcagcaaacctgggaggaaccgtcgagatc60

acctgctccgggggtggctatagctatggctggtaccagcagaggtctcctggcagtgcc120

cctgtcactctgatctatgaaggcaccaagagaccctcgaacatcccttcacgattctcc180

ggttccacatctggctccacacacacattaaccatcactggggtccaagccgaggacgag240

gctgtctattactgtgggagcacagacagcagtgctggttatgttggtatatttggggcc300

gggacaaccctgaccgtcctag322

<210>5

<211>73

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

ggtggttcctctagatcttccccgtgacgttggacgagtcctggccggcctggccgagga60

gacgatgacttcg73

<210>6

<211>72

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

gggcccaggcggccctgactcagccgtccttcgggaagatctagaggaaccaccacctag60

gacggtcagggt72