一种膜分离提取乳酸菌细菌素的方法及装置与流程

本发明涉及一种膜分离提取乳酸菌细菌素的方法及装置，属于乳酸菌细菌素提取领域。

背景技术：

乳酸菌细菌素是乳酸球菌或乳酸杆菌发酵代谢后的产物，是一种对于同种或异类细菌具有抑制作用的抗菌肽。由于其安全无毒、抗菌活性高、降解无残留等特点，部分乳酸菌细菌素已作为食品保鲜剂、抗菌剂应用到食品、饮料行业中。甚至未来能应用到医药行业作为抗生素的替代物。但细菌素由于产量低、提取复杂和生产成本高等因素制约其商业化应用，且细菌素的纯度高低决定了其抑菌活性的高低。而现有已商品化的nisin(乳酸链球菌素)，其商业化收率也不到20％，其原因一方面是乳酸菌发酵代谢中产生了其他多肽，有些甚至聚合成蛋白，另一方面是分离提纯的方法还依赖于溶剂萃取、化学沉淀、离子交换色谱、液相色谱等多个繁杂的工艺组合，而这些工艺组合一方面增加了工艺的复杂性，不利于大规模的生产，同时也降低了收率。

膜分离技术，作为纯物理分离和以孔径筛分机理为分离原理的高精度分离技术，在医药生化分离纯化领域，得到了人们的广泛关注和商业化应用。申请号为200510066481.7的专利公开了一种从乳酸乳球菌发酵液中分离乳酸链球菌的方法，该方法采用孔径为10～60万分子量管式或无机膜将大于乳酸链球菌素分子量的物质分开，而后采用0.2～4万分子量的卷式膜将小于乳酸链球菌素分子量的物质分开，并浓缩，这种方法，工艺简单、收率高、活性较高，分离效果较好，确实比膜分离以外的方法要进步了许多，但是由于选择的两种膜分子量相差太大，在0.2～4万分子量的卷式膜浓缩液中，在浓缩了细菌素的同时，也浓缩了一定量的同样分子量范围内的其他杂质，如多肽类，造成产品纯度不高，而且在10～60万分子量管式或无机膜的浓缩液中，也存在着由于浓差极化而夹杂的一定量的细菌素产品，从而造成产品活性收率不高。申请号200710054257.5的专利申请公开了一种从发酵液中提取乳酸链球菌素的方法。该方法采用三级膜过滤方法，在去除了丝菌体和发酵残渣之后，先后采用微滤和小分子的超滤进行澄清和除杂、脱色和浓缩之后，再结晶干燥，这种方法，全部采用膜分离方法提纯分离，浓度和纯度得到了提高，但是相比于专利申请号200510061481.7中的两级膜过滤技术，工艺明显复杂了，增加了活性的损失，而且能耗和投资增加了。

为了提高乳酸菌细菌素的活性收率，同时也为了简化工艺流程和降低投资运行成本，使得该产品更容易工业化生产，本发明提出了一种新的膜分离提取乳酸菌细菌素的方法。

技术实现要素：

本发明提供一种膜分离提取乳酸菌细菌素的方法及装置，本发明本着提高乳酸菌细菌素活性收率的目的，将低分子量营养液发酵方法引入其中，考虑到大生产的连续性需要和操作方便，采用膜分离集成技术，尤其超滤时利用亲水性的超滤膜性能，高性能地截留作为疏水性的细菌素物质，降低了膜污染，提高了通量，既可提高了乳酸菌细菌素的活性收率，又简化了工艺，降低了投资成本，更适合于工业化生产，具有极大地经济性和环保意义。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种膜分离提取乳酸菌细菌素的方法，包括顺序相接的如下步骤：

1)、将经过由低分子量营养液发酵完的乳酸菌发酵液离心分离，其中，低分子量营养液原料的分子量不超过4kda；

2)、将步骤1)所得滤液用微滤膜进行澄清和酸水透析，其中，微滤膜为陶瓷膜，陶瓷膜的孔径为1000～100nm，当陶瓷膜体积浓缩倍数达到10倍时，用酸水对陶瓷膜浓缩的菌体浓液进行渗析过滤，直至整个渗透液中细菌素的活性回收率达到98％以上；

3)、将步骤2)所得滤液采用亲水性的小分子超滤膜进行浓缩和洗涤；其中，超滤膜的切割分子量为1k～4kda，当超滤膜的体积浓缩倍数达到10倍时，用酸水对浓缩液进行洗涤浓缩，直至出水的电导率与酸水的电导率相当；

4)、将步骤3)所得的浓缩液进行冷冻干燥，得乳酸菌细菌素干粉。

上述步骤1)中离心是为了除去菌丝体等发酵残渣。

上述方法将低分子量营养液发酵技术与膜分离技术集成在一起提取乳酸菌细菌素，提高了乳酸菌细菌素的活性收率。

本申请活性回收率，指提取工艺后所得乳酸菌细菌素的活性与提取工艺前乳酸菌细菌素的活性比值。

上述利用膜分离技术的高精度分离性能、膜表面的亲水性以及对具体参数的选择，结合低分子量营养液发酵技术，提取浓缩发酵液中疏水性乳酸菌细菌素，提高了产品的活性收率，简化了生产工艺，缩短了生产流程，降低了投资和运行成本。

本申请通过采用低分子量营养液发酵技术，很大程度上提高了发酵后细菌素的活性，究其原因，申请人认为，因为采用低分子量的营养物质减少了对代谢产物细菌素的包裹而提高了细菌素的活性收率。

为了提高乳酸菌细菌素的活性回收率，上述步骤1)中乳酸菌发酵液采用的发酵物为低分子量的营养液，有葡萄糖，酵母提取物，乙酸钠，柠檬酸三钠，磷酸二氢钾等，最大分子量为4kda，发酵温度为30～40℃，ph＝6.5。菌种为乳酸杆菌。

上述步骤1)中，离心分离的转速为4000rpm以上，离心分离的精度为50～150目，离心时间为12～18min。

为了进一步纯化发酵液中的乳酸菌细菌素产品，步骤2)中，微滤膜由氧化铝、氧化锆、氧化钛或碳化硅等陶瓷材料制成；孔隙率为30～50％；陶瓷膜的孔径为100～500nm。

上述步骤2)和步骤3)中，酸水的ph为5-6，酸水用纯水和稀硫酸调节配制而成。

为了提高微滤清液中乳酸菌细菌素产品的浓度，步骤3)中，超滤膜的切割分子量优选为1k～2kda，超滤膜所用材质为亲水性的pes(聚醚砜)、pan(聚丙烯腈)或陶瓷膜等。

上述步骤3)中，当出水的电导率与酸水的电导率相差在±30us/cm以内，认定为出水的电导率与酸水的电导率相当。

一种膜分离提取乳酸菌细菌素的装置，包括发酵罐、离心机、mf循环罐、mf循环泵、预过滤器、mf组件、uf循环罐、uf循环泵、uf组件和冷冻干燥机；

发酵罐、离心机和mf循环罐依次连通；mf循环罐、mf循环泵、预过滤器和mf组件的进料口依次连通，mf组件的浓缩液出口与mf循环罐连通、形成循环，mf组件的清液出口与uf循环罐连通；uf循环罐、uf循环泵和uf组件的进料口依次连通，uf组件的浓缩液出口与uf循环罐连通、形成循环，uf组件的浓缩液出口还通向冷冻干燥机。

上述uf为超滤，mf为微滤。

利用上述膜分离提取乳酸菌细菌素的装置提取乳酸菌细菌素的方法，包括顺序相接的如下步骤：

1)、在发酵罐内完成低分子量营养液厌氧发酵，待发酵罐里乳酸菌细菌素活性不再升高时，停止发酵，将所得乳酸菌发酵液经离心机离心分离；

2)、将步骤1)所得滤液收集到mf循环罐中，在mf循环泵的输送下经过预过滤器过滤后、在mf组件内进行澄清过滤，过滤后的浓液回流到mf循环罐中，而微滤滤液则收集到uf循环罐中，当体积浓缩倍数达到10时，向mf循环罐中加入酸水进行透析过滤，当清液中细菌素的总回收率达到了98％以上时，停止透析过滤；

3)、开启uf循环泵，在uf膜组件的作用分离下进行浓缩，uf浓缩液回到uf循环罐中继续循环浓缩，当体积浓缩倍数达到10时，向uf循环罐中加入酸水对浓缩液进行洗涤浓缩，当洗涤出水滤液的电导率与酸水的电导率相当时，停止洗涤；

4)、将步骤3)所得的浓缩液进冷冻干燥机冷冻干燥，得乳酸菌细菌素干粉。

上述利用膜分离技术的高精度分离性能以及膜表面的亲水性，结合低分子量营养液发酵技术及循环控制及各参数的选择，提取浓缩发酵液中疏水性乳酸菌细菌素，提高了产品的活性收率，简化了生产工艺，缩短了生产流程，降低了投资和运行成本。

本发明未提及的技术均参照现有技术。

有益效果

本申请将低分子量营养液发酵技术与膜分离技术充分集成在一起，既提高了乳酸菌细菌素的活性收率，又简化了生产工艺，还具有投资和运行成本低的优势，非常适合于工业化生产，与现有的提取工艺相比，具有如下的优越性：

1、低分子量营养液发酵技术提高了细菌素的活性，由分子量低于4kda的发酵原料进行发酵，既避免了代谢产物细菌素被大分子蛋白或多肽包裹而引起的活性降低，又有利于采用分子量为1kda～4kda超滤膜进行纯化分离细菌素和其它代谢杂质；进一步，发酵温度控制在30～40℃也降低了产生大分子杂质和色素的可能性，非常有利于产品的提纯除杂，从而提高了产品的活性。

2、陶瓷膜的高精度微滤极大地保证了对发酵液的过滤澄清度，使得发酵液中的大于细菌素分子量的物质得到有效去除，而微滤过后的酸水透析也使得裹夹到微滤浓缩液中细菌素得到回收，提高了微滤后的发酵液澄清度和活性收率。

3、亲水性小分子量的超滤膜对微滤后发酵液进行洗涤和浓缩，极大地提高了产品的纯度，从而提高活性收率；乳酸菌细菌素作为乳酸菌代谢的胞外产物，大部分是疏水性分子，分子量在3kda～10kda之间，进一步选用分子量为1kda～2kda的亲水性膜，可有效地拦截高活性的细菌素，同时脱除了大量的酸水；而对超滤浓缩液再次酸水的洗涤和浓缩，又再一次去除了浓缩液中裹夹的分子量比细菌素分子量更小的杂质，再一次使得产品得到了纯化和浓缩。

4、与传统的化学沉淀、溶媒萃取、离子色谱和液相色谱等工艺相比，本申请工艺简单，纯物理分离，且不带入其他杂质，既提高了产品的纯度以及活性回收率，又不产生有毒有害的废水和废弃物，节能环保。

5、与喷雾干燥法相比，本申请工艺以冷冻干燥为产品的最后干燥工序，极大地保证了干燥后产品的活性几乎不受影响，从而提高了其收率。

6、与申请号200710054257.5的专利申请相比，本申请只用了两级膜分离工艺，而且第二级浓缩膜还采用亲水性的膜，工艺上两级膜分离都采用了酸水透析和洗涤技术，不仅简化了工艺，而且也提高了活性收率；与申请号为200510066481.7的专利相比，本专利技术因使用合适孔径和亲水性能的浓缩膜，产品中的杂质更少，产品因浓缩而损失的量也更少，从而提高了产品活性收率；实践证明，采用本专利技术，浓缩液中细菌素的活性提高到1800iu/ml，活性回收率达到了95.96％。

7、本专利技术工艺简单，易于放大，绿色环保。设备紧凑，自动化程度高，操作维护都很方便，大大节约了投资和运行成本。

附图说明

图1为本发明膜分离提取乳酸菌细菌素装置的结构示意图；

图中，1、发酵罐，2、离心机，3、mf循环罐，4、mf循环泵，5、预过滤器，6、mf组件，7、uf循环罐，8、uf循环泵，9、uf膜组件，10、冷冻干燥机；

a、低分子量发酵原料，b、离心液体，c、酸水，d、mf浓液，e、mf滤液，f、酸水，g、uf浓液，h、uf浓液，i、uf滤液，k、细菌素产品。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考徐南平等著的《无机膜分离技术与应用》，化学工业出版社，2003)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

如图1所示，一种膜分离提取乳酸菌细菌素的装置，包括发酵罐1、离心机2、mf循环罐3、mf循环泵4、预过滤器5、mf组件6、uf循环罐7、uf循环泵8、uf组件9和冷冻干燥机10；

发酵罐1、离心机2和mf循环罐3依次连通；mf循环罐3、mf循环泵4、预过滤器5和mf组件6的进料口依次连通，mf组件6的浓缩液出口与mf循环罐3连通、形成循环，mf组件6的清液出口与uf循环罐7连通；uf循环罐7、uf循环泵8和uf组件9的进料口依次连通，uf组件9的浓缩液出口与uf循环罐7连通、形成循环，uf组件9的浓缩液出口还通向冷冻干燥机10。

利用上述膜分离提取乳酸菌细菌素的装置提取乳酸菌细菌素的方法，包括顺序相接的如下步骤：

1)、将分子量低于4kda的以下发酵物质a：20g/l葡萄糖，20g/l酵母提取物，10g/l的乙酸钠，10g/l柠檬酸三钠，5g/l磷酸二氢钾，0.5g/l硫酸镁，0.05g/l硫酸锰和乳酸杆菌一起放到发酵罐1里进行厌氧发酵，控制发酵温度为36℃，ph＝6.5，待发酵罐里乳酸菌细菌素活性不再升高时，停止发酵，得到发酵后液体共计200l，乳酸杆菌细菌素活性105iu/ml。

2)、将发酵好的液体200l先采用离心机分离去掉大分子的菌体残渣，离心机的分离精度为100目，转速为4000r/min，离心时间15min，得到滤液199l，乳酸杆菌细菌素活性104.5iu/ml，收率为99％。

3)、离心下来的液体b收集到mf循环罐3中，在mf循环泵4的输送下经过预过滤器5进入陶瓷微滤膜组件6内进行澄清过滤，陶瓷微滤膜元件采用200nm孔径的多通道氧化铝膜，孔隙率为38％；过滤后的浓液d回流到mf循环罐3中，而微滤后的滤液e则收集到uf循环罐7中，当体积浓缩倍数达到10时，加入由硫酸与纯水(电导率<5us/cm)配成的ph＝6的酸水c进行透析过滤，当滤液e中细菌素的活性总回收率达到了98％以上时，停止透析过滤，得到278.6l滤液，乳酸杆菌细菌素活性达到74iu/ml，收率为99.13％。

4)、将微滤滤液e全部收集到uf循环罐7中后，开启uf循环泵8，在uf膜组件9的作用分离下进行浓缩，(uf膜采用切割分子量为2kda的亲水性的pes膜)，uf浓缩液g回到uf循环罐中继续循环浓缩，当体积浓缩倍数达到10时，对浓缩液g进行洗涤浓缩，洗涤用水f采用由硫酸与纯水(电导率<5us/cm)配成的ph＝6的酸水，当洗涤出水滤液i的电导率与酸水f的电导率相当(相差在±30us/cm以内)，停止洗涤，浓缩去水得到浓液11.2l，乳酸杆菌细菌素活性1800iu/ml，收率为97.78％。

5)、将洗涤浓缩好的菌体浓缩液h取出，进冷冻干燥机10进行干燥得到干粉产品28.2g，产品的活性几乎不受影响，整个系统活性收率达到了95.96％。

为了说明低分子量营养液发酵技术的实施效果，本专利采用了发酵液为分子量大于4kda的营养液进行发酵作了对比，结果如下：

对照例1

上述膜分离提取乳酸菌细菌素的方法，包括如下步骤：

1)、将分子量大于4kda的以下发酵物质a：葡萄糖2g/l，蛋白胨1g/l，牛肉膏1g/l，酵母浸粉0.5g/l，醋酸钠0.5g/l，柠檬酸氢二铵0.2g/l，kh2po40.2g/l，吐温－800.1g/l，mgso40.02g/l，mnso40.005g/l,和乳酸杆菌一起放到发酵罐1里进行厌氧发酵，控制温度为37℃，ph＝6.5，待发酵罐里乳酸菌细菌素活性不再升高时，停止发酵，得到发酵后液体共计200l，乳酸杆菌细菌素活性95iu/ml。

2)、将发酵好的液体200l先采用离心机分离去掉大分子的菌体残渣，离心机的分离精度为100目，转速为4000r/min，离心时间15min。得到滤液199l，乳酸杆菌细菌素活性91.7iu/ml。收率为96％。

3)、离心下来的液体b收集到mf循环罐3中，在mf循环泵4的输送下经过预过滤器5进入陶瓷微滤膜组件6内进行澄清过滤，陶瓷膜元件采用200nm孔径的多通道氧化铝膜，孔隙率为38％。过滤后的浓液d回流到mf循环罐3中，而微滤后的滤液e则收集到uf循环罐7中。当体积浓缩倍数达到10时，加入由硫酸与纯水(电导率<5us/cm)配成的ph＝6的酸水c进行透析过滤。当滤液e中细菌素的总回收率达到了98％以上时，停止透析过滤。得到308.5l滤液。乳酸杆菌细菌素活性达到58iu/ml，收率为98％。

4)、将微滤滤液e全部收集到uf循环罐7中后，开启uf循环泵8，在uf膜组件9的作用分离下进行浓缩，(uf膜采用切割分子量为4kda的亲水性的ps膜)。uf浓缩液g回到uf循环罐中继续循环浓缩，当体积浓缩倍数达到10时，对浓缩液g进行洗涤浓缩，洗涤用水f采用由硫酸与纯水(电导率<5us/cm)配成的ph＝6的酸水。当洗涤出水滤液i的电导率与酸水f的电导率相当。停止洗涤，浓缩去水得到浓液11.2l。乳酸杆菌细菌素活性1501.7iu/ml，收率为94％。

5)、将洗涤好的菌体浓缩液h取出，进冷冻干燥机10进行干燥得到干粉产品32.3g。产品的活性几乎不受影响。整个系统活性收率88.43％。

从对照例1可以看出：由于大分子营养液的使用，不仅发酵后的细菌素活性降低，而且由于大分子营养物质的黏附和覆盖，细菌素分子被释放的量变低，采用膜分离方法难以有效将细菌素从这些大分子营养液中分离，造成离心、mf、uf活性收率下降，从而整个系统活性收率降低。

为了说明本专利技术采用二级膜分离技术，因工艺简化而产生的效果，本专利采用了类似于专利申请号200710054257.5三级膜分离技术作了对比，结果如下：

对照例2

1)、将分子量低于4kda的以下发酵物质a：20g/l葡萄糖，20g/l酵母提取物，10g/l的乙酸钠，10g/l柠檬酸三钠，5g/l磷酸二氢钾，0.5g/l硫酸镁，0.05g/l硫酸锰,和乳酸杆菌一起放到发酵罐1里进行厌氧发酵。控制温度为36℃，ph＝6.5。待发酵罐里乳酸菌细菌素活性不再升高时，停止发酵。得到发酵后液体共计200l，乳酸杆菌细菌素活性105iu/ml。

2)、将发酵好的液体200l先采用离心机分离去掉大分子的菌体残渣，离心机的分离精度为100目，转速为4000r/min，离心时间15min。得到滤液199l，乳酸杆菌细菌素活性104.5iu/ml，收率为99％。

3)、离心下来的液体b收集到mf循环罐3中，在mf循环泵4的输送下经过预过滤器5进入陶瓷微滤膜组件6内进行澄清过滤，陶瓷膜元件采用200nm孔径的多通道氧化铝膜，孔隙率为38％。过滤后的浓液d回流到mf循环罐3中，而微滤后的滤液e则收集到uf循环罐7中。当体积浓缩倍数达到10时，加入由硫酸与纯水(电导率<5us/cm)配成的ph＝6的酸水c进行透析过滤。当滤液e中细菌素的总回收率达到了98％以上时，停止透析过滤。得到278.6l滤液。乳酸杆菌细菌素活性达到74iu/ml，收率为99.13％。

4)、将微滤滤液e全部收集到uf1循环罐7中后，开启uf1循环泵8，在uf1膜组件9的作用分离下进行浓缩，(uf1膜采用切割分子量为10kda的亲水性的pes膜)。uf1浓缩液g回到uf循环罐中继续循环浓缩，当体积浓缩倍数达到10时，对浓缩液g进行洗涤浓缩，洗涤用水f采用由硫酸与纯水(电导率<5us/cm)配成的ph＝6的酸水。当洗涤出水滤液i的电导率与酸水f的电导率相当。停止洗涤，得到滤液306.5l。乳酸杆菌细菌素活性64.5iu/ml，收率为95.9％。

5)、将以上uf1滤液全部收集到uf2循环罐中，再次通过uf2进行浓缩(uf2膜采用切割分子量为2kda的亲水性的pes膜)，过程与步骤4)相似，得到浓液11.2l。乳酸杆菌细菌素活性1659.2iu/ml，收率为94％。

6)、将洗涤好的菌体浓缩液h取出，进冷冻干燥机10进行干燥得到干粉产品25.84g。产品的活性几乎不受影响，整个系统活性收率88.47％。

从对照例2可以看出：由于采用了三级膜技术，中间的uf1虽然一定程度上净化去除了一些大分子杂质，但是也损失了一定量的细菌素活性，因为uf1的浓液中截留了部分带有活性的大分子量的细菌素。而且从本案例可以看出，由于发酵采用了低分子量营养液发酵技术(分子量<4kda)，而且是36℃下低温发酵，因而发酵液中残留的大分子杂质和色素较少。因而这道膜不仅不能起到纯化产品作用(整个超滤系统的活性收率降低)，而且加大了产品损失，整个系统的活性收率降低。

为了说明本专利技术采用亲水膜浓缩脱水的效果，本专利采用了材质为疏水性的ps膜分离浓缩作了对比，结果如下：

对照例3

1)、将分子量低于4kda的以下发酵物质a：20g/l葡萄糖，20g/l酵母提取物，10g/l的乙酸钠，10g/l柠檬酸三钠，5g/l磷酸二氢钾，0.5g/l硫酸镁，0.05g/l硫酸锰,和乳酸杆菌一起放到发酵罐1里进行厌氧发酵。控制温度为36℃，ph＝6.5。待发酵罐里乳酸菌细菌素活性不再升高时，停止发酵。得到发酵后液体共计200l，乳酸杆菌细菌素活性105iu/ml。

2)、将发酵好的液体200l先采用离心机分离去掉大分子的菌体残渣，离心机的分离精度为100目，转速为4000r/min，离心时间15min。得到滤液199l，乳酸杆菌细菌素活性104.5iu/ml，收率为99％。

3)、离心下来的液体b收集到mf循环罐3中，在mf循环泵4的输送下经过预过滤器5进入陶瓷微滤膜组件6内进行澄清过滤，陶瓷膜元件采用200nm孔径的多通道氧化铝膜，孔隙率为38％。过滤后的浓液d回流到mf循环罐3中，而微滤后的滤液e则收集到uf循环罐7中。当体积浓缩倍数达到10时，加入由硫酸与纯水(电导率<5us/cm)配成的ph＝6的酸水c进行透析过滤。当滤液e中细菌素的总回收率达到了98％以上时，停止透析过滤。得到278.6l滤液。乳酸杆菌细菌素活性达到74iu/ml，收率为99.13％。

4)、将微滤滤液e全部收集到uf循环罐7中后，开启uf循环泵8，在uf膜组件9的作用分离下进行浓缩，(uf膜采用切割分子量为2kda的亲水性的ps膜)。uf浓缩液g回到uf循环罐中继续循环浓缩，当体积浓缩倍数达到10时，对浓缩液g进行洗涤浓缩，洗涤用水f采用由硫酸与纯水(电导率<5us/cm)配成的ph＝6的酸水。当洗涤出水滤液i的电导率与酸水f的电导率相当。停止洗涤，浓缩去水得到浓液11.2l。乳酸杆菌细菌素活性1675iu/ml，收率为91％。

5)、将洗涤好的菌体浓缩液h取出，进冷冻干燥机10进行干燥得到干粉产品29.2g。产品的活性几乎不受影响，整个系统收率为89.3％。

从对照例3可以看出，由于浓缩过程中，采用了疏水性的ps膜进行了浓缩洗涤，使得具有疏水性的细菌素有一定数量的透过，从而降低了该工艺细菌素的活性收率，导致整个系统收率下降，纯度降低。