同时检测羟基自由基和粘度的双功能荧光探针的合成与应用

本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一类同时检测羟基自由基和粘度的双功能荧光探针的合成与应用。此类探针以新的机理从各种活性氧化性物质中快速选择性检测羟基自由基和粘度，绿色荧光通道选择性检测羟基自由基，红色荧光选择性通道检测粘度，具有大斯托克斯位移、高荧光量子产率，检测灵敏度高和可视化检测等优点。

背景技术：

活性氧物质包括：羟基自由基(·oh)、次氯酸(hclo)、过氧亚硝酸盐(onoo^-)、过氧阴离子(o2^•-)、一氧化氮(no)、单线态氧(¹o2)和过氧化氢(h2o2)，它们在不同的生理和病理过程中发挥着重要作用(nature,2006,443,787–795;naturerevimmu.2006,6,508–519)。在所有活性氧物质中，羟基自由基是氧化活性最高的物种，它的寿命极短，并且可以与许多生物分子如dna碱基，脂质和蛋白质反应。它的过量产生导致细胞损伤，并与各种疾病有关。此外，许多证据表明·oh和其他活性氧物质的产生可用于癌症治疗(nature,2000,407,309–311)。另一方面，细胞内粘度是控制质量和信号传输以及生物大分子之间相互作用的关键因素。实际上，它已被证明是动脉粥样硬化、糖尿病、阿尔茨海默氏病、甚至细胞恶性肿瘤的重要贡献者或指标(biochem.j.,1994,298,443−450;psychopharmacology,1999,145,175−180)，因为它影响细胞膜中蛋白质与蛋白质的相互作用。因此，监测细胞内·oh水平和细胞中的粘度对于了解其生物学功能至关重要。

最近，已经报道了几种用于检测·oh和粘度的荧光探针。其中，基于·oh特征反应的荧光探针，如芳香加成，自旋捕获和夺氢，对其他活性氧物质表现出相对较好的选择性。例如，弱荧光的香豆素-3-羧酸探针与·oh反应，通过芳香加成反应产生荧光7-羟基-香豆素-3-羧酸衍生物(anal.sci.,2008,24,293–296)；还开发了在dmso中具有oh的硝酰自由基探针的自旋捕获方法(org.lett.,2012,14,50–53)；或者通过氧化c-h取代反应将氢氰基探针氧化反应成相应的花青染料，用于检测·oh和h2o2(angew.chem.,int.ed.,2009,48,299–303)。目前也报道了大量检测粘度变化的荧光探针，通过抑制分子中c=c双键的旋转，降低探针分子的非辐射损耗，可实现粘度的高灵敏度检测(chem.eur.j.,2021,doi:10.1002/chem.202004888)。同时检测羟基自由基和粘度变化的双功能探针还很少。因此，利用单个荧光探针实现双通道同时区分检测羟基自由基和粘度仍然存在巨大挑战。

技术实现要素：

鉴于上述情况，克服一些现有技术的不足，本发明的目的在于提供一类同时检测羟基自由基和粘度的双功能荧光探针。该类能在特定检测条件下，从各类活性氧化性物质中快速选择性荧光检测羟基自由基，并且对粘度具有很好的荧光响应。

本发明的目的还在于提供一种制备方法简单、高灵敏度、检测限低和成本较低的上述荧光分子探针的合成与应用方法。

本发明解决问题采取的具体技术方案为，同时检测羟基自由基和粘度的双功能荧光探针的合成以及制备在环境中定量分析羟基自由基和粘度，在活细胞中同时区分荧光成像羟基自由基和粘度的器件的应用，其探针的化学结构通式如下：

，其中，r=氰基/乙酸乙酯基/苯并噻唑基。

同时检测羟基自由基和粘度的双功能荧光探针的合成，其特征在于，所述荧光分子探针的制备方法包括以下步骤：

步骤1.合成3-(8-甲氧基-2,3,3a,4-四氢吡咯并[1,2-a]喹喔啉-5(1h)-基)丙酸甲酯

a.将适量3-氟-4-硝基苯甲醚与l-脯氨酸甲酯盐酸盐加入无水乙腈中，再加入适量的三乙胺加热回流反应6小时，过滤除去三乙胺盐酸盐，旋干溶液，

b.将旋干后的溶液用甲醇溶解，缓慢加入适量的氯化铵和锌粉，室温下搅拌过夜，然后过滤除去锌粉，旋干溶剂，所得固体加入水中，过滤干燥得绿色固体，

c.将绿色固体用无水四氢呋喃溶解，加入适量硼氢化钠和三氟化硼乙醚，90℃下反应12小时，反应完全后，缓慢倒入水中，用氢氧化钠调节溶液ph至12，过滤，滤液用乙酸乙酯萃取，将有机层旋干，

d.将上述产品加入适量的丙烯酸甲酯和冰醋酸中回流反应6小时，过滤得到3-(8-甲氧基-2,3,3a,4-四氢吡咯并[1,2-a]喹喔啉-5(1h)-基)丙酸甲酯；

步骤2.合成3-（7-甲酰基-8-甲氧基-2,3,3a,4-四氢吡咯并[1,2a]喹喔啉-5（1h）-基）丙酸甲酯

．在氮气保护条件下，将适量干燥重蒸的n,n-二甲基甲酰胺(dmf)缓慢加入等体积的三氯氧磷(pocl3)中，在20-50℃下搅拌30-60分钟，得黄色溶液，将3-(8-甲氧基-2,3,3a,4-四氢吡咯并[1,2-a]喹喔啉-5(1h)-基)丙酸甲酯溶于适量dmf中，逐滴加入到黄色的混合溶液中，混合物继续在氮气保护下60℃搅拌反应12小时；反应完全之后，将反应液倒入适量冰水中，用20%的naoh溶液调节ph至5~6，然后用乙酸乙酯萃取，有机层旋干，得黄色溶液；

步骤3.合成3-（7-（2,2-二氰基乙烯基）-8-甲氧基-2,3,3a,4四氢吡咯并[1,2-a]喹喔啉-5（1h）-基）丙酸甲酯（以r=氰基为例）

.将3-（7-甲酰基-8-甲氧基-2,3,3a,4-四氢吡咯并[1,2a]喹喔啉-5（1h）-基）丙酸甲酯和丙二腈加入适量乙醇中，再加入适量哌啶，室温下反应过夜，过滤，固体真空干燥得权利要求1所述的双功能荧光分子探针3-（7-（2,2-二氰基乙烯基）-8-甲氧基-2,3,3a,4四氢吡咯并[1,2-a]喹喔啉-5（1h）-基）丙酸甲酯。

本发明的一类同时检测羟基自由基和粘度的双功能荧光探针的使用方法：无特殊说明，通常在室温下将探针分子溶解在水相为ph=7.4的磷酸盐缓冲溶液(pbs)和分析物的水溶液的环境下用于羟基自由基的分析检测；在检测粘度时，探针分子溶解在不同粘度的甲醇-甘油溶液中用于检测粘度。

本发明的双功能荧光探针同时检测羟基自由基和粘度的具体特征如下：分子荧光探针用二甲基亚砜(dmso)溶解，探针分子溶解在不同梯度的粘度中，直接在470nm激发波长下发射600nm以上的红色荧光；探针分子溶解在磷酸盐缓冲溶液(pbs)，与羟基自由基室温反应15分钟后，在430nm激发波长下发射500nm左右的强绿色荧光。因此实现特定激发与荧光发射信号检测特定分析物。上述荧光分子探针实现了在不同检测条件下同时区分检测羟基自由基和粘度，对其他活性氧、活性硫、常见的氨基酸、金属离子和活性氮均无明显响应，对羟基自由基的检测限低至183.3nm，对粘度变化敏感度高。因此，本发明公开的双功能荧光分子探针能够实现对两者的高灵敏检测。

附图说明

图1本发明所述的双功能荧光探针的核磁共振氢谱图（r=氰基）。

图2本发明所述的双功能荧光探针检测羟基自由基和粘度的荧光光谱图（r=乙酸乙酯基）。

图3本发明所述的双功能荧光探针同时成像细胞内羟基自由基和粘度的荧光成像图（r=苯并噻唑基）。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的说明。

本发明所述的双功能荧光分子探针的合成路线如下图所示：

。

实施例1.合成3-(8-甲氧基-2,3,3a,4-四氢吡咯并[1,2-a]喹喔啉-5(1h)-基)丙酸甲酯

a.将30g(175.31mmol)3-氟-4-硝基苯甲醚与37.5g(227.9mmol)l-脯氨酸甲酯盐酸盐加入200ml无水乙腈中，再加入73ml(525.9mmol)三乙胺加热回流反应6小时，过滤除去三乙胺盐酸盐，旋干溶液，

b.将旋干后的溶液用300ml甲醇溶解，缓慢加入46.76g(874.13mmol)氯化铵和57.15g(874.13mmol)锌粉，室温下搅拌过夜，然后过滤除去锌粉，旋干溶剂，固体加入水中，过滤干燥得绿色固体，

c.将绿色固体用400ml无水四氢呋喃溶解，加入36.4g(962.17mmol)硼氢化钠和122ml(962.17mmol)三氟化硼乙醚，90℃下反应12小时，反应完全后，缓慢倒入水中，用氢氧化钠调节ph至12，过滤，滤液用乙酸乙酯萃取，将有机层旋干，

d.将上述产品加入适量的丙烯酸甲酯中回流反应12小时，过滤得到3-(8-甲氧基-2,3,3a,4-四氢吡咯并[1,2-a]喹喔啉-5(1h)-基)丙酸甲酯26.4g，产率为64.27%。

实施例2.合成3-（7-甲酰基-8-甲氧基-2,3,3a,4-四氢吡咯并[1,2a]喹喔啉-5（1h）-基）丙酸甲酯

．在氮气保护条件下，将适量干燥重蒸的10mln,n-二甲基甲酰胺(dmf)缓慢加入10ml(77.48mmol)三氯氧磷(pocl3)中，在20-50℃下搅拌30-60分钟，得黄色溶液，将10g(43.04mmol)3-(8-甲氧基-2,3,3a,4-四氢吡咯并[1,2-a]喹喔啉-5(1h)-基)丙酸甲酯溶于40mln,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，逐滴加入到上述黄色混合溶液中，混合物继续在氮气保护下60℃搅拌反应12小时；反应完全之后，将反应液倒入适量冰水中，用20%的naoh溶液调节ph至5~6，然后有大量固体析出，过滤得黄色固体10.2g，产率为93.03%。

实施例3.合成3-（7-（2,2-二氰基乙烯基）-8-甲氧基-2,3,3a,4四氢吡咯并[1,2-a]喹喔啉-5（1h）-基）丙酸甲酯（r=氰基为例）

.将3-（7-甲酰基-8-甲氧基-2,3,3a,4-四氢吡咯并[1,2a]喹喔啉-5（1h）-基）丙酸甲酯200mg(628.2μmol)固体和49.80mg(753.8μmol)丙二腈加入8ml乙醇，室温下反应过夜，过滤得权利要求1所述的荧光分子探针3-（7-（2,2-二氰基乙烯基）-8-甲氧基-2,3,3a,4四氢吡咯并[1,2-a]喹喔啉-5（1h）-基）丙酸甲酯185mg，产率为80.37%。

实施例4.双功能荧光探针在体外环境中检测羟基自由基和粘度的应用（r=乙酸乙酯基）

本发明所述的双功能荧光探针检测羟基自由基和粘度的光谱性质实验：将探针溶解在二甲基亚砜(dmso)中配置成浓度为1mm的探针溶液，分别配置浓度为10mm的羟基自由基水溶液。具体测试方式为：取20μl1mm的探针溶液，再加入适量的分析物溶液，最后加入的适量的磷酸盐缓冲溶液(pbs)(每一个测试样品总体积为2ml)。例如当要求测试羟基自由基浓度为20μm时探针与羟基自由基反应后的荧光强度，配制样品情况为：取20μl1mm的探针溶液，20μl的10mm的羟基自由基水溶液和1960μl的pbs缓冲溶液于2ml的样品管中，室温下震荡摇匀15分钟后即可用430nm的激发波长测量其荧光发射强度，检测粘度具体测试方式基本相同，配制方法为取20μl1mm的探针溶液加入1960μl不同粘度的溶液中，其他测试操作与上述步骤类似。该双功能探针分子实现了用不同的激发波长和荧光发射信号同时检测羟基自由基和粘度，具有很高的灵敏度，对羟基自由基的检测限低至183.3nm，对粘度变化敏感，非常适合活细胞中内源性羟基自由基和粘度变化的成像/定量分析。

实施例5.raw246.7（巨噬细胞）细胞中内源性羟基自由基和粘度双通道荧光成像分析

将raw246.7细胞传代至共聚焦皿细胞培养基中，在标准生长条件下培养24小时后，加入适量探针(5μm，r=苯并噻唑基)继续在标准生长条件下培养30分钟，然后在共聚焦荧光显微镜下照相，分别用绿色、红色荧光通道进行荧光成像raw246.7细胞内源性羟基自由基和粘度，从图3可以看出，本发明的双功能荧光探针成功实现了细胞中内源性的羟基自由基和粘度的双通道荧光成像分析。

本发明提供的同时检测羟基自由基和粘度的双功能荧光探针，利用羟基自由基的芳香加成特性，随后与氰基发生环化反应，能高选择性快速响应羟基自由基，反应后在430nm激发波长下发射500nm左右的绿光；通过粘度变化抑制自由旋转的氰乙烯部分，从而抑制探针分子的非辐射损耗过程，实现对粘度变化的实时监测，在470nm激发波长下发射600nm以上的红光，荧光现象明显。尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细的介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，具有本文所述技术特征的双功能荧光探针同时检测羟基自由基和粘度的应用，均落入本专利的保护范围。