一种高产环孢菌素的植物内生镰刀菌及其应用

文档序号:26013579发布日期:2021-07-23 21:34阅读:126来源:国知局
一种高产环孢菌素的植物内生镰刀菌及其应用

本发明涉及生物工程技术领域,涉及微生物及其应用,具体涉及一种高产环孢菌素的植物内生镰刀菌及其应用。



背景技术:

环孢菌素(cyclosporine)是一类由11个氨基酸残基组成的结构独特的亲脂性环状多肽,迄今通过天然产物分离和半合成获得的环孢菌素共30多个。其中环孢菌素a的免疫抑制活性强、选择性高,且对骨髓和巨噬细胞几乎没有抑制作用,自1983年获批用于临床肾移植的几十年来,环孢菌素a一直作为最主要的临床一线抗排斥药物之一,广泛用于肾脏、肝脏、心脏等器官及骨髓移植。随着器官移植技术不断发展,器官移植成功率越来越高,患者也越来越普遍,而且这些移植患者往往需要多年乃至终身用药。

环孢菌素a除免疫抑制活性外,还具有抗真菌、抗虫、抗炎和抗病毒等多种生物活性,还常用于多种难治性皮肤病和自身免疫性血液病等疾病的治疗,环孢菌素a是重要的药物分子,在农用和养殖等领域也表现出明显的应用潜力,现有原料需求和潜在需求量大,环孢菌素a的高产菌株的发现和制备工艺研究一直备受关注。

然而环孢菌素a是分子量较大的环十一肽化合物,其中多个氨基酸残基为非常见氨基酸,且具有12个手性中心,人工合成较为困难。迄今为止,环孢菌素a的来源仍依靠微生物发酵和分离纯化获得,现有的野生真菌菌株的环孢菌素产率都在1.0g/l以下,且其生产培养基组分复杂、部分原料价格较高,发酵培养工艺繁琐,需要大规模的设备投入,生产成本高,寻找环孢菌素a高产菌株和简单高效、低成本的发酵培养及制备方法,一直是相关制药企业的重要关注点。



技术实现要素:

基于此,有必要提供一种高产环孢菌素的植物内生镰刀菌和利用该菌简单高效、低成本地制备环孢菌素a上的应用。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下:

一种高产环孢菌素的植物内生镰刀菌,所述高产环孢菌素的植物内生镰刀菌为镰刀菌(fusariumsp.)hu0298,分离于广东省汕头市南澳岛海滩植物酸模(rumexacetosa)植株中。

该菌株(生物材料)的保藏信息为:

名称:镰刀菌(fusariumsp.)hu0298;

保藏编号:gdmccno.61466;

保藏单位:广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc);

保藏地址:广州市越秀区先烈中路100号,广东省微生物研究所,邮编:510075;

保藏时间:2021年1月26日。

镰刀菌(fusariumsp.)hu0298的保存方法:采用pda培养基保存。pda培养基:土豆200g,葡萄糖20g,琼脂20g,蒸馏水1000ml,ph调至7.0。

本发明通过ctab法提取得到镰刀菌(fusariumsp.)hu0298菌株的dna,并通过its基因序列鉴定hu0298菌株的分类,its基因pcr扩增引物为:its4(5’–tcctccgcttattgatatgc–3’)和its5(5’–ggaagtaaaagtcgtaacaagg–3’)。将其基因序列与genbank数据库中的相关菌株序列进行blast对比,其its序列同源性与的fusariumfalciforme和fusariumsolani同源性最高,均为99%,hu0298菌株与镰刀菌fusariumsp.隶属同一分支,因而将其命名为镰刀菌(fusariumsp.)hu0298。

本发明的另一个目的是提供一种高产环孢菌素的植物内生镰刀菌在制备环孢菌素a中的运用。

在一个实施例中,提供一种高产环孢菌素的植物内生镰刀菌的发酵方法,包括以下步骤:

将镰刀菌(fusariumsp.)hu0298接种于pda培养基中活化培养,得到活化好的镰刀菌(fusariumsp.)hu0298菌种,其中,培养温度为20~30℃,活化培养时间为3~5天;

将活化好的镰刀菌(fusariumsp.)hu0298菌种接种到pdb培养基中振荡培养,得到一级种子液,其中,培养温度为20~30℃,振荡培养时间为1~3天;

将一级种子液接种至液体培养基进行液体发酵培养,得到液体发酵液;

或,将一级种子液接种至pdb培养基中培养1~3天得到二级种子液,然后将二级种子液接种至固体培养基进行固体发酵培养,得到固体发酵物,其中,液体发酵和固体发酵的培养温度为20~30℃。

在一个实施例中,所述液体培养基的组分为:

果糖30g/l、kh2po46.00g/l、cacl20.90g/l、mgso40.90g/l、kcl0.30g/l、酵母提取物5.0g/l、mnso4·4h2o6.70mg/l、znso4·7h2o8.30mg/l、feso4·7h2o15.00mg/l、cuso41.50mg/l、cocl211.00mg/l,ph调至5.4。

在一个实施例中,所述液体培养基的组分为:

葡萄糖30g/l、硫酸铵10g/l、k2hpo47.5g/l和微量元素溶液1ml/l,ph调至5.5,其中,所述微量元素溶液包括:znso44.4g/l、feso45g/l、mncl2180mg/l、na2mo425mg/l、cuso480mg/l和h2so42ml。

在一个实施例中,所述液体培养基的组分为:

麦芽提取物2%和酵母抽提物0.4%,ph调至5.4;

或200g/l土豆、20g/l琼脂和20g/l葡萄糖。

在一个实施例中,所述固体培养基包括:组分a和蒸馏水,所述组分a与蒸馏水的料液比为1:1~5,所述组分a为玉米、大米、小麦、麦麸和椰子油饼中的任意一种。

在一个实施例中,所述固体培养基包括:组分b、组分c和蒸馏水,所述组分b、所述组分c和蒸馏水的料液比为1:1:1~5,所述组分b为玉米或麦麸,所述组分c为小麦、花生油饼、大豆油饼、麦麸和椰子油饼中的任意一种。

在一个实施例中,所述固体培养基包括:玉米、蒸馏水和组分d,所述组分d为甘油、dl-α-氨基丁酸、麦芽提取物、大豆蛋白胨、酵母提取物和酪蛋白胨中的任意一种,所述玉米、所述蒸馏水和所述组分d之间的料液比为1:1:0.01~0.05。

在一个实施例中,提供一种高产环孢菌素的植物内生镰刀菌制备环孢菌素a的制备方法,包括以下步骤:

将镰刀菌(fusariumsp.)hu0298进行发酵培养,培养得到发酵培养物;

将发酵培养物用浸提液进行浸提,过滤后浓缩得到浸膏,其中,所述浸提液为95%乙醇或乙酸乙酯;

将浸膏进行硅胶柱层析,以体积比100:0至80:20的二氯甲烷-甲醇混合溶剂进行梯度洗脱,并收集硅胶板薄层层析中二氯甲烷-甲醇混合溶剂体积比95:5展开时,比移值为0.4~0.6,且酸水解-茚三酮显色法检测呈阳性的流份,合并得到总环孢菌素;

将总环孢菌素进行反相层析,以体积分数80%的甲醇进行洗脱,得到环孢菌素a。

本发明的有益效果是:本发明的发酵产物环孢菌素衍生物由镰刀菌(fusariumsp.)hu0298菌株发酵培养、提取分离而获得,其中环孢菌素a产量可高达5.63g/kg,具有培养基成本较低、生产工艺相对简单、易于规模发酵生产等的优点,能够大幅度提高环孢菌素a的单位产量、减少废弃物产量、降低生产成本,在制备环孢菌素a中具有良好的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,应当理解,以下附图仅示出了本申请的某些实施例,因此不应被看作是对范围的限定,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明一个实施例的一种高产环孢菌素的植物内生镰刀菌的发酵方法的流程示意图;

图2为本发明一个实施例的一种高产环孢菌素的植物内生镰刀菌制备环孢菌素a的制备方法的流程示意图;

图3为本发明一个实施例的镰刀菌(fusariumsp.)hu0298的菌落形态;

图4为本发明一个实施例的镰刀菌(fusariumsp.)hu0298的菌丝及孢子形态;

图5为本发明一个实施例的镰刀菌(fusariumsp.)hu0298基于its构建的邻接树。

具体实施方式

为了便于理解本发明,下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施方式。但是,本发明可以以许多不同的形式来实现,并不限于本文所描述的实施方式。相反地,提供这些实施方式的目的是使对本发明的公开内容理解的更加透彻全面。

除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的,不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

在一个实施例中,一种高产环孢菌素的植物内生镰刀菌,所述高产环孢菌素的植物内生镰刀菌为镰刀菌(fusariumsp.)hu0298,所述高产环孢菌素的植物内生镰刀菌于2021年1月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心,保藏编号为gdmccno.61466。

在本实施例中,镰刀菌(fusariumsp.)hu0298菌株是从广东省汕头市南澳岛附近海滩的植物酸模(rumexacetosa)植株中通过组织培养法分离获得。即通过将采集到的酸模植株的茎叶用75%乙醇和1%次氯酸钠溶液分别浸泡30s后,以无菌水冲洗2遍,晾干后剪取组织接种到pda培养基表面,在25±5℃的黑暗条件培养3d,挑取所得菌落接种至新的pda培养基进一步纯化得到白色丝状真菌。

上述所用的pda培养基配制方法为200g土豆加入适量纯水煮沸30min后过滤得到滤液,加入20g葡萄糖和20g琼脂,以纯水定容到1l,通过121℃湿热灭菌30min后配制得到。

在本实施例中,镰刀菌(fusariumsp.)hu0298的菌落和菌丝及孢子的形态如图3和图4所示,该菌菌丝有隔,呈白色棉絮状,直径约2.0~3.0μm;小型分生孢子呈椭圆形,0~1隔,大小为3.7~12.5μm×2.0~3.0μm;大型分生孢子呈镰刀形,1~4隔,大小为7.8~33.8μm×2.3~3.5μm。

进一步的,镰刀菌(fusariumsp.)hu0298菌株经测序拼接后得到的dna序列测定结果,参见序列表,并基于its构建邻接树,如图5所示,其its序列同源性与的fusariumfalciforme和fusariumsolani同源性最高,均为99%,hu0298菌株与镰刀菌fusariumsp.隶属同一分支。

综上所述,上述菌株鉴定为高产环孢菌素的植物内生镰刀菌(fusariumsp.),该菌株目前已保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称gdmcc,地址:广州市越秀区先烈中路100号,广东省微生物研究所),保藏日期:2021年1月26日,所述菌株的保藏编号为gdmccno.61466。

在一个实施例中,如图1所示,对一种高产环孢菌素的植物内生镰刀菌(fusariumsp.)hu0298进行发酵培养。

步骤110,将镰刀菌(fusariumsp.)hu0298接种于pda培养基中活化培养,得到活化好的镰刀菌(fusariumsp.)hu0298菌种,其中,培养温度为20~30℃,活化培养时间为3~5天。

具体的,用无菌接种针挑取存于冻存管内的镰刀菌(fusariumsp.)hu0298菌块并接种于pda培养基上进行活化,放在28℃恒温培养箱于黑暗条件下培养,该pda培养基通过将200g土豆切块后加水煮沸30min后过滤,加入20g葡萄糖和20g琼脂后以纯水定容到1l,121℃湿热灭菌30min配制得到。

步骤120,将活化好的镰刀菌(fusariumsp.)hu0298菌种接种到pdb培养基中振荡培养,得到一级种子液,其中,培养温度为20~30℃,振荡培养时间为1~3天。

具体的,该pdb培养基通过将200g土豆加水煮沸30min后过滤得到滤液,加入20g葡萄糖后以纯水定容到1l,121℃湿热灭菌30min配制得到。

步骤130,将一级种子液接种至液体培养基进行液体发酵培养,得到液体发酵液。

具体的,挑取活化好的镰刀菌(fusariumsp.)hu0298菌块接种至装有30mlpdb培养基的锥形瓶内,放在150rpm恒温振荡培养箱中于黑暗条件下的振荡培养2d,培养温度为20~30℃,所述液体培养基的组分为:果糖30g/l、kh2po46.00g/l、cacl20.90g/l、mgso40.90g/l、kcl0.30g/l、酵母提取物5.0g/l、mnso4·4h2o6.70mg/l、znso4·7h2o8.30mg/l、feso4·7h2o15.00mg/l、cuso41.50mg/l和cocl211.00mg/l,ph调至5.4。

在另一个实施例中,所述液体培养基的组分为:葡萄糖30g/l、硫酸铵10g/l、k2hpo47.5g/l和微量元素溶液1ml/l,ph调至5.5,其中,所述微量元素溶液包括:znso44.4g/l、feso45g/l、mncl2180mg/l、na2mo425mg/l、cuso480mg/l和h2so42ml。

在又一个实施例中,所述液体培养基的组分为:麦芽提取物2%和酵母抽提物0.4%,ph调至5.4;

在又一个实施例中,所述液体培养基为pdb液体培养基,其组分为200g/l土豆、20g/l琼脂和20g/l葡萄糖,该pdb液体培养基通过将200g土豆加水煮沸30min后过滤得到滤液,加入20g葡萄糖后以纯水定容到1l,121℃湿热灭菌30min配制得到。

在另一种发酵培养方式中,将一级种子液接种至pdb培养基中培养1~3天得到二级种子液,然后将二级种子液接种至固体培养基进行固体发酵培养,得到固体发酵物。

在本实施例中,用巴氏吸管吸取1ml的一级种子液至装有200mlpdb培养基的锥形瓶内,放在150rpm恒温振荡培养箱黑暗条件下振荡培养2d,得到二级种子液,然后用巴氏吸管吸取5ml的二级种子液至装有固定培养基的发酵罐中均匀接种,黑暗中静置培养35d。其中,将一级种子液接种至pdb培养基中培养及将二级种子液接种至固体培养基进行固体发酵培养的培养温度为20~30℃。

在本实施例中,所述固体培养基包括:组分a和蒸馏水,所述组分a与蒸馏水的料液比为1:1~5,所述组分a为玉米、大米、小麦、麦麸和椰子油饼中的任意一种。

在一个实施例中,所述固体培养基组分如表1所示。

表1固体培养基组分

在另一个实施例中,所述固体培养基的组分为:组分b、组分c和蒸馏水,所述组分b、所述组分c和蒸馏水的料液比为1:1:1~5,所述组分b为玉米或麦麸,所述组分c为小麦、花生油饼、大豆油饼、麦麸和椰子油饼中的任意一种。

在一个实施例中,所述固体培养基组分如表2所示。

表2固体培养基组分

在又一个实施例中,所述固体培养基包括:玉米、蒸馏水和组分d,所述组分d为甘油、dl-α-氨基丁酸、酵母提取物和酪蛋白胨中的任意一种,所述玉米、所述蒸馏水和所述组分d之间的料液比为1:1:0.01~0.05。

在一个实施例中,将上述实施例中的高产环孢菌素的植物内生镰刀菌(fusariumsp.)hu0298运用于制备环孢菌素a。具体的,将发酵培养物用有机溶剂提取得到提取物,该提取物为总环孢菌素,其中的环孢菌素a含量高达5.5%以上,再将提取物分离得到环孢菌素a。总环孢菌素包括环孢菌素a、环孢菌素b和环孢菌素c,总环孢菌素化学结构式为:

其中,在环孢菌素a的化学结构式中,r1=ch3,r2=h,在环孢菌素b的化学结构式中,r1=r2=h,在环孢菌素c的化学结构式中,r1=ch3,r2=oh。

其中,环孢菌素a的化学结构式为:

本发明的发酵产物环孢菌素衍生物由镰刀菌(fusariumsp.)hu0298菌株在适合条件下经液体发酵和固体发酵两种方式进行培养而获得,所得发酵物中环孢菌素a产量可达1g/kg至5.10g/kg。生产工艺相对简单,且易于规模发酵生产。

在一个实施例中,如图2所示,提供一种高产环孢菌素的植物内生镰刀菌制备环孢菌素a的制备方法,包括以下步骤:

步骤210,将镰刀菌(fusariumsp.)hu0298进行发酵培养,培养得到发酵培养物。

具体的,镰刀菌(fusariumsp.)hu0298接种于培养基中,培养温度为20~30℃,并在黑暗中静置培养。在本实施例中,镰刀菌(fusariumsp.)hu0298接种于所述固体培养基中进行固体发酵培养;在另一个实施例中,镰刀菌(fusariumsp.)hu0298接种于所述液体培养基中进行液体发酵培养。

步骤220,将发酵培养物用浸提液进行浸提,过滤后浓缩得到浸膏,其中,所述浸提液为95%乙醇或乙酸乙酯。

具体的,使用乙酸乙酯对发酵培养物进行浸提,然后对乙酸乙酯提取液浓缩至干得到乙酸乙酯提取物,浸提次数为1-3次,每次浸提时间为36-60h,在一个较佳实施例中,浸提时间为48h。

在一个实施例中,将发酵培养物用等体积的95%乙醇进行浸提,浸提时间为36-60小时,过滤得到乙醇提取液,然后对乙醇提取液进行减压浓缩,直至浓缩至其体积的1/20,得到一次浓缩物,此时为浸膏状,将一次浓缩物用体积分数80%的乙醇水溶液溶解,并使用等体积的石油醚进行萃取,分离出石油醚萃取物和剩余的乙醇水溶液,除去乙醇水溶液中的乙醇,然后用水补回原体积后继续使用等量的乙酸乙酯萃取,最后过滤浓缩得到乙酸乙酯萃取物,其中,石油醚萃取和乙酸乙酯萃取的次数为1-3次。

步骤230,将浸膏进行硅胶柱层析,以体积比100:0至80:20的二氯甲烷-甲醇混合溶剂进行梯度洗脱,并收集硅胶板薄层层析中二氯甲烷-甲醇混合溶剂体积比95:5展开时,比移值为0.4~0.6,且酸水解-茚三酮显色法检测呈阳性的流份,合并得到总环孢菌素。

具体的,将乙酸乙酯提取物放入正相硅胶柱,硅胶的粒径为100~200目,以体积比100:0~80:20的二氯甲烷-甲醇混合溶剂进行梯度洗脱时,通过结合硫酸香草醛、茚三酮和酸水解—茚三酮三种显色法检测合并相似的流份,对薄层板上二氯甲烷-甲醇体积比95:5展开时比移值0.4~0.6的总环孢菌素进行收集。

步骤240,将总环孢菌素进行反相层析,以体积分数80%的甲醇进行洗脱,得到环孢菌素a。

具体的,将收集得到的总环孢菌素流份进行高效液相色谱制备,以流动相为体积分数80%甲醇进行等度洗脱,得到环孢菌素a、环孢菌素b和环孢菌素c。

具体的,通过将得到的无色固体,即环孢菌素a样品进行采用质谱和核磁共振谱进行结构表征,其分子式为c62h24n111o12,正离子esimsm/z1224[m+na]+,负离子esimsm/z1200[m–h]和1236[m+cl]。其1hnmr和13cnmr谱数据见表3,上述数据显示分离得到的产物为环孢菌素a。

表3环孢菌素a的1h和13cnmr谱数据

实施例1

将镰刀菌(fusariumsp.)hu0298进行种子液培养后,接种至装有固体培养基的发酵罐中均匀接种,培养得到发酵培养物,将发酵培养物用浸提液进行浸提,过滤后浓缩得到浸膏,然后将该浸膏进行硅胶柱层析,以体积比100:0至80:20的二氯甲烷-甲醇混合溶剂进行梯度洗脱,并收集硅胶板薄层层析中二氯甲烷-甲醇混合溶剂体积比95:5展开时,比移值为0.4~0.6,且酸水解-茚三酮显色法检测呈阳性的流份,合并得到总环孢菌素,最后将总环孢菌素进行反相层析,以体积分数80%的甲醇进行洗脱,得到环孢菌素a。其中,所述固体培养基的组分为:玉米和蒸馏水,料液比为1:1。

实施例2

将镰刀菌(fusariumsp.)hu0298进行种子液培养后,接种至装有固体培养基的发酵罐中均匀接种,培养得到发酵培养物,将发酵培养物用浸提液进行浸提,过滤后浓缩得到浸膏,然后将该浸膏进行硅胶柱层析,以体积比100:0至80:20的二氯甲烷-甲醇混合溶剂进行梯度洗脱,并收集硅胶板薄层层析中二氯甲烷-甲醇混合溶剂体积比95:5展开时,比移值为0.4~0.6,且酸水解-茚三酮显色法检测呈阳性的流份,合并得到总环孢菌素,最后将总环孢菌素进行反相层析,以体积分数80%的甲醇进行洗脱,得到环孢菌素a。其中,所述固体培养基的组分为:大米和蒸馏水,料液比为1:1。

实施例3

将镰刀菌(fusariumsp.)hu0298进行种子液培养后,接种至装有固体培养基的发酵罐中均匀接种,培养得到发酵培养物,将发酵培养物用浸提液进行浸提,过滤后浓缩得到浸膏,然后将该浸膏进行硅胶柱层析,以体积比100:0至80:20的二氯甲烷-甲醇混合溶剂进行梯度洗脱,并收集硅胶板薄层层析中二氯甲烷-甲醇混合溶剂体积比95:5展开时,比移值为0.4~0.6,且酸水解-茚三酮显色法检测呈阳性的流份,合并得到总环孢菌素,最后将总环孢菌素进行反相层析,以体积分数80%的甲醇进行洗脱,得到环孢菌素a。其中,所述固体培养基的组分为:小麦和蒸馏水,料液比为1:1。

实施例4

将镰刀菌(fusariumsp.)hu0298进行种子液培养后,接种至装有固体培养基的发酵罐中均匀接种,培养得到发酵培养物,将发酵培养物用浸提液进行浸提,过滤后浓缩得到浸膏,然后将该浸膏进行硅胶柱层析,以体积比100:0至80:20的二氯甲烷-甲醇混合溶剂进行梯度洗脱,并收集硅胶板薄层层析中二氯甲烷-甲醇混合溶剂体积比95:5展开时,比移值为0.4~0.6,且酸水解-茚三酮显色法检测呈阳性的流份,合并得到总环孢菌素,最后将总环孢菌素进行反相层析,以体积分数80%的甲醇进行洗脱,得到环孢菌素a。其中,所述固体培养基的组分为:麦麸和蒸馏水,料液比为1:2。

实施例5

将镰刀菌(fusariumsp.)hu0298进行种子液培养后,接种至装有固体培养基的发酵罐中均匀接种,培养得到发酵培养物,将发酵培养物用浸提液进行浸提,过滤后浓缩得到浸膏,然后将该浸膏进行硅胶柱层析,以体积比100:0至80:20的二氯甲烷-甲醇混合溶剂进行梯度洗脱,并收集硅胶板薄层层析中二氯甲烷-甲醇混合溶剂体积比95:5展开时,比移值为0.4~0.6,且酸水解-茚三酮显色法检测呈阳性的流份,合并得到总环孢菌素,最后将总环孢菌素进行反相层析,以体积分数80%的甲醇进行洗脱,得到环孢菌素a。其中,所述固体培养基的组分为:椰子油饼和蒸馏水,料液比为1:3。

实施例6

将镰刀菌(fusariumsp.)hu0298进行种子液培养后,接种至装有固体培养基的发酵罐中均匀接种,培养得到发酵培养物,将发酵培养物用浸提液进行浸提,过滤后浓缩得到浸膏,然后将该浸膏进行硅胶柱层析,以体积比100:0至80:20的二氯甲烷-甲醇混合溶剂进行梯度洗脱,并收集硅胶板薄层层析中二氯甲烷-甲醇混合溶剂体积比95:5展开时,比移值为0.4~0.6,且酸水解-茚三酮显色法检测呈阳性的流份,合并得到总环孢菌素,最后将总环孢菌素进行反相层析,以体积分数80%的甲醇进行洗脱,得到环孢菌素a。其中,所述固体培养基的组分为:玉米、小麦和蒸馏水,料液比为1:1:2。

实施例7

将镰刀菌(fusariumsp.)hu0298进行种子液培养后,接种至装有固体培养基的发酵罐中均匀接种,培养得到发酵培养物,将发酵培养物用浸提液进行浸提,过滤后浓缩得到浸膏,然后将该浸膏进行硅胶柱层析,以体积比100:0至80:20的二氯甲烷-甲醇混合溶剂进行梯度洗脱,并收集硅胶板薄层层析中二氯甲烷-甲醇混合溶剂体积比95:5展开时,比移值为0.4~0.6,且酸水解-茚三酮显色法检测呈阳性的流份,合并得到总环孢菌素,最后将总环孢菌素进行反相层析,以体积分数80%的甲醇进行洗脱,得到环孢菌素a。其中,所述固体培养基的组分为:玉米、花生油饼和蒸馏水,料液比为1:1:2.5。

实施例8

将镰刀菌(fusariumsp.)hu0298进行种子液培养后,接种至装有固体培养基的发酵罐中均匀接种,培养得到发酵培养物,将发酵培养物用浸提液进行浸提,过滤后浓缩得到浸膏,然后将该浸膏进行硅胶柱层析,以体积比100:0至80:20的二氯甲烷-甲醇混合溶剂进行梯度洗脱,并收集硅胶板薄层层析中二氯甲烷-甲醇混合溶剂体积比95:5展开时,比移值为0.4~0.6,且酸水解-茚三酮显色法检测呈阳性的流份,合并得到总环孢菌素,最后将总环孢菌素进行反相层析,以体积分数80%的甲醇进行洗脱,得到环孢菌素a。其中,所述固体培养基的组分为:玉米、大豆油饼和蒸馏水,料液比为1:1:2.5。

实施例9

将镰刀菌(fusariumsp.)hu0298进行种子液培养后,接种至装有固体培养基的发酵罐中均匀接种,培养得到发酵培养物,将发酵培养物用浸提液进行浸提,过滤后浓缩得到浸膏,然后将该浸膏进行硅胶柱层析,以体积比100:0至80:20的二氯甲烷-甲醇混合溶剂进行梯度洗脱,并收集硅胶板薄层层析中二氯甲烷-甲醇混合溶剂体积比95:5展开时,比移值为0.4~0.6,且酸水解-茚三酮显色法检测呈阳性的流份,合并得到总环孢菌素,最后将总环孢菌素进行反相层析,以体积分数80%的甲醇进行洗脱,得到环孢菌素a。其中,所述固体培养基的组分为:玉米、麦麸和蒸馏水,料液比为1:1:3。

实施例10

将镰刀菌(fusariumsp.)hu0298进行种子液培养后,接种至装有固体培养基的发酵罐中均匀接种,培养得到发酵培养物,将发酵培养物用浸提液进行浸提,过滤后浓缩得到浸膏,然后将该浸膏进行硅胶柱层析,以体积比100:0至80:20的二氯甲烷-甲醇混合溶剂进行梯度洗脱,并收集硅胶板薄层层析中二氯甲烷-甲醇混合溶剂体积比95:5展开时,比移值为0.4~0.6,且酸水解-茚三酮显色法检测呈阳性的流份,合并得到总环孢菌素,最后将总环孢菌素进行反相层析,以体积分数80%的甲醇进行洗脱,得到环孢菌素a。其中,所述固体培养基的组分为:玉米、椰子油饼和蒸馏水,料液比为1:1:4。

实施例11

将镰刀菌(fusariumsp.)hu0298进行种子液培养后,接种至装有固体培养基的发酵罐中均匀接种,培养得到发酵培养物,将发酵培养物用浸提液进行浸提,过滤后浓缩得到浸膏,然后将该浸膏进行硅胶柱层析,以体积比100:0至80:20的二氯甲烷-甲醇混合溶剂进行梯度洗脱,并收集硅胶板薄层层析中二氯甲烷-甲醇混合溶剂体积比95:5展开时,比移值为0.4~0.6,且酸水解-茚三酮显色法检测呈阳性的流份,合并得到总环孢菌素,最后将总环孢菌素进行反相层析,以体积分数80%的甲醇进行洗脱,得到环孢菌素a。其中,所述固体培养基的组分为:麦麸、椰子油饼和蒸馏水,料液比为1:1:5。

实施例12

将镰刀菌(fusariumsp.)hu0298进行种子液培养后,接种至装有固体培养基的发酵罐中均匀接种,培养得到发酵培养物,将发酵培养物用浸提液进行浸提,过滤后浓缩得到浸膏,然后将该浸膏进行硅胶柱层析,以体积比100:0至80:20的二氯甲烷-甲醇混合溶剂进行梯度洗脱,并收集硅胶板薄层层析中二氯甲烷-甲醇混合溶剂体积比95:5展开时,比移值为0.4~0.6,且酸水解-茚三酮显色法检测呈阳性的流份,合并得到总环孢菌素,最后将总环孢菌素进行反相层析,以体积分数80%的甲醇进行洗脱,得到环孢菌素a。其中,所述固体培养基的组分为:玉米和2%甘油,料液比为1:1。

实施例13

将镰刀菌(fusariumsp.)hu0298进行种子液培养后,接种至装有固体培养基的发酵罐中均匀接种,培养得到发酵培养物,将发酵培养物用浸提液进行浸提,过滤后浓缩得到浸膏,然后将该浸膏进行硅胶柱层析,以体积比100:0至80:20的二氯甲烷-甲醇混合溶剂进行梯度洗脱,并收集硅胶板薄层层析中二氯甲烷-甲醇混合溶剂体积比95:5展开时,比移值为0.4~0.6,且酸水解-茚三酮显色法检测呈阳性的流份,合并得到总环孢菌素,最后将总环孢菌素进行反相层析,以体积分数80%的甲醇进行洗脱,得到环孢菌素a。其中,所述固体培养基的组分为:玉米和0.5%麦芽提取物,料液比为1:1。

实施例14

将镰刀菌(fusariumsp.)hu0298进行种子液培养后,接种至装有固体培养基的发酵罐中均匀接种,培养得到发酵培养物,将发酵培养物用浸提液进行浸提,过滤后浓缩得到浸膏,然后将该浸膏进行硅胶柱层析,以体积比100:0至80:20的二氯甲烷-甲醇混合溶剂进行梯度洗脱,并收集硅胶板薄层层析中二氯甲烷-甲醇混合溶剂体积比95:5展开时,比移值为0.4~0.6,且酸水解-茚三酮显色法检测呈阳性的流份,合并得到总环孢菌素,最后将总环孢菌素进行反相层析,以体积分数80%的甲醇进行洗脱,得到环孢菌素a。其中,所述固体培养基的组分为:玉米和0.1%大豆蛋白胨,料液比为1:1。

实施例15

将镰刀菌(fusariumsp.)hu0298进行种子液培养后,接种至装有固体培养基的发酵罐中均匀接种,培养得到发酵培养物,将发酵培养物用浸提液进行浸提,过滤后浓缩得到浸膏,然后将该浸膏进行硅胶柱层析,以体积比100:0至80:20的二氯甲烷-甲醇混合溶剂进行梯度洗脱,并收集硅胶板薄层层析中二氯甲烷-甲醇混合溶剂体积比95:5展开时,比移值为0.4~0.6,且酸水解-茚三酮显色法检测呈阳性的流份,合并得到总环孢菌素,最后将总环孢菌素进行反相层析,以体积分数80%的甲醇进行洗脱,得到环孢菌素a。其中,所述固体培养基的组分为:玉米和0.2%酵母提取物,料液比为1:1。

实施例16

将镰刀菌(fusariumsp.)hu0298进行种子液培养后,接种至装有固体培养基的发酵罐中均匀接种,培养得到发酵培养物,将发酵培养物用浸提液进行浸提,过滤后浓缩得到浸膏,然后将该浸膏进行硅胶柱层析,以体积比100:0至80:20的二氯甲烷-甲醇混合溶剂进行梯度洗脱,并收集硅胶板薄层层析中二氯甲烷-甲醇混合溶剂体积比95:5展开时,比移值为0.4~0.6,且酸水解-茚三酮显色法检测呈阳性的流份,合并得到总环孢菌素,最后将总环孢菌素进行反相层析,以体积分数80%的甲醇进行洗脱,得到环孢菌素a。其中,所述固体培养基的组分为:玉米和0.2%酪蛋白胨,料液比为1:1。

实施例17

将镰刀菌(fusariumsp.)hu0298进行种子液培养后,接种至装有液体培养基的发酵罐中均匀接种,培养得到发酵培养物,将发酵培养物用浸提液进行浸提,过滤后浓缩得到浸膏,然后将该浸膏进行硅胶柱层析,以体积比100:0至80:20的二氯甲烷-甲醇混合溶剂进行梯度洗脱,并收集硅胶板薄层层析中二氯甲烷-甲醇混合溶剂体积比95:5展开时,比移值为0.4~0.6,且酸水解-茚三酮显色法检测呈阳性的流份,合并得到总环孢菌素,最后将总环孢菌素进行反相层析,以体积分数80%的甲醇进行洗脱,得到环孢菌素a。其中,所述液体培养基的组分为:果糖30g/l、kh2po46.00g/l、cacl20.90g/l、mgso40.90g/l、kcl0.30g/l、酵母提取物5.0g/l、mnso4·4h2o6.70mg/l、znso4·7h2o8.30mg/l、feso4·7h2o15.00mg/l、cuso41.50mg/l和cocl211.00mg/l,ph调至5.4。

实施例18

将镰刀菌(fusariumsp.)hu0298进行种子液培养后,接种至装有液体培养基的发酵罐中均匀接种,培养得到发酵培养物,将发酵培养物用浸提液进行浸提,过滤后浓缩得到浸膏,然后将该浸膏进行硅胶柱层析,以体积比100:0至80:20的二氯甲烷-甲醇混合溶剂进行梯度洗脱,并收集硅胶板薄层层析中二氯甲烷-甲醇混合溶剂体积比95:5展开时,比移值为0.4~0.6,且酸水解-茚三酮显色法检测呈阳性的流份,合并得到总环孢菌素,最后将总环孢菌素进行反相层析,以体积分数80%的甲醇进行洗脱,得到环孢菌素a。其中,所述液体培养基的组分为:葡萄糖30g/l、硫酸铵10g/l、k2hpo47.5g/l和微量元素溶液1ml/l,ph调至5.5,其中,所述微量元素溶液包括:znso44.4g/l、feso45g/l、mncl2180mg/l、na2mo425mg/l、cuso480mg/l和h2so42ml。

实施例19

将镰刀菌(fusariumsp.)hu0298进行种子液培养后,接种至装有液体培养基的发酵罐中均匀接种,培养得到发酵培养物,将发酵培养物用浸提液进行浸提,过滤后浓缩得到浸膏,然后将该浸膏进行硅胶柱层析,以体积比100:0至80:20的二氯甲烷-甲醇混合溶剂进行梯度洗脱,并收集硅胶板薄层层析中二氯甲烷-甲醇混合溶剂体积比95:5展开时,比移值为0.4~0.6,且酸水解-茚三酮显色法检测呈阳性的流份,合并得到总环孢菌素,最后将总环孢菌素进行反相层析,以体积分数80%的甲醇进行洗脱,得到环孢菌素a。其中,所述液体培养基的组分为:麦芽提取物2%和酵母抽提物0.4%,ph调至5.4。

上述实施例1-19中,镰刀菌(fusariumsp.)hu0298发酵培养35天后,发酵物中环孢菌素a的产量如表4所示:

表4镰刀菌(fusariumsp.)hu0298固体发酵培养35天环孢菌素a的产量

表5镰刀菌(fusariumsp.)hu0298液体发酵培养35天环孢菌素a的产量

由表4和表5可知,液体发酵产物中,环孢菌素a的产量较低,产量均超过1g/l,在单一组分的固体培养基中,玉米发酵提取物中环孢菌素a的产量达到2.36g/kg,而麦麸和椰子油饼发酵提取物中环孢菌素a的含量明显高于玉米发酵提取物,其环孢菌素a的产量分别达3.27g/kg和2.82g/kg,分别为玉米发酵提取物的1.4倍和1.2倍。在多组分的固体培养基中,往玉米培养基中加入等量的小麦、麦麸和椰子油饼,均可以明显提高环孢菌素a的产量,其环孢菌素a的产量可达到3.62g/kg、3.34g/kg和3.31g/kg,分别为不添加其他原料的玉米发酵提取物的1.5、1.4和1.4倍;此外,麦麸和椰子油饼等量组合培养基发酵提取物中环孢菌素a的产量也达到了3.00g/kg。上述结果中,相对玉米发酵培养,使用麦麸和椰子油饼对镰刀菌(fusariumsp.)hu0298进行发酵培养,或玉米培养基中添加小麦、麦麸和椰子油饼,均能有效提高环孢菌素a的产量,且大幅度降低了生产成本。

结果还表明,玉米固体培养基中添加甘油作为第二碳源时,环孢菌素a的产量变化并无明显差异,但当玉米培养基中添加0.2%酵母提取物和0.1%大豆蛋白胨作为第二氮源,环孢菌素a的产量分别达到4.63和5.10g/kg,分别是玉米发酵的2.0倍和2.16倍。可见,0.2%酵母提取物和0.1%大豆蛋白胨的添加,大幅度提高了镰刀菌(fusariumsp.)hu0298发酵物中环孢菌素a的产量。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施方式仅表达了本申请的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本申请构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本申请的保护范围。因此,本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110>惠州学院

<120>一种高产环孢菌素的植物内生镰刀菌及其应用

<130>1

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>591

<212>dna

<213>镰刀菌(fusariumsp.hu0298的基因序列)

<400>1

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